楊 博,丁洪霞,陳方軍,郭善利,陳世華

(煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 煙臺(tái) 264005)

在植物中,三萜皂苷的前體2,3-氧化角鯊烯是由甲羥戊酸(MVA)途徑產(chǎn)生的,其中2,3-氧化角鯊烯環(huán)化酶(2,3-Oxidosqualene Cyclases,OSC)家族蛋白是三萜皂苷生物合成的關(guān)鍵酶[1-2]。目前OSC基因已在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、大豆(Glycinemax)和人參(Panaxginseng)等多種植物中發(fā)現(xiàn)。OSC家族成員具有DCTAE和 QW(QXXXXXW)高度保守序列[3],前者負(fù)責(zé)與底物結(jié)合,后者是帶有負(fù)電性的芳香族氨基酸,在環(huán)化反應(yīng)中起到穩(wěn)定碳陽(yáng)離子的作用,這些重復(fù)序列可能與穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和其功能相關(guān)。

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)是南美安第斯地區(qū)的本土食用植物,其種植和食用歷史可追溯到公元前5000年,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高且易于碾磨加工[4]。藜麥蛋白質(zhì)中的必需氨基酸組成平衡,是世界公認(rèn)的全營(yíng)養(yǎng)谷物[5]。該植物對(duì)于干旱、鹽漬等苛刻條件具有良好的抗逆性,具有極好的經(jīng)濟(jì)和研究?jī)r(jià)值。本研究基于前人公布的藜麥基因組數(shù)據(jù)[6],應(yīng)用生物信息學(xué)的方法對(duì)藜麥2,3-氧化角鯊烯環(huán)化酶基因(CqOSC)家族成員進(jìn)行了鑒定,并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、編碼蛋白Motif及啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件、基因表達(dá)模式等進(jìn)行了分析,以期為CqOSC基因功能的預(yù)測(cè)及研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 CqOSC基因家族成員的鑒定

從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR(https:∥www.arabidopsis.org/)和水稻數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥rice.uga.edu/index.shtml)中查詢并下載擬南芥、水稻的OSC蛋白序列。獲取序列后使用Tbtools[7]軟件與藜麥的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥www.cbrc.kaust.edu.sa/chenopodiumdb)的蛋白序列進(jìn)行對(duì)比,得到CqOSC候選基因。使用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息市中心(NCBI)的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)(CDD)(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)[8]對(duì)候選基因的蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行鑒定,最終確認(rèn)含有OSC蛋白保守結(jié)構(gòu)域的CqOSC基因家族成員。根據(jù)CqOSC基因家族全部成員在染色體上的位置進(jìn)行基因命名。然后使用在線網(wǎng)站(https:∥web.expasy.org/protparam/)[9]對(duì)CqOSC家族進(jìn)行蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)。使用Plant-mPLoc(http:∥www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#)在線網(wǎng)站進(jìn)行CqOSC基因家族的蛋白亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)。

1.2 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化

利用MEGA7.0[10]軟件中的ClustalW對(duì)藜麥、擬南和水稻OSC的蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)。使用MEGA7.0軟件的鄰接法(neighbor joining,NJ)并設(shè)置1000次boots-trap重復(fù)抽樣來進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.3 基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守基序

從Phytozome v13數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中搜索CqOSC基因家族基因和CDS序列并下載,使用GSDS 2.0在線網(wǎng)站(http:∥gsds.gao-lab.org/index.php)[11]描繪CqOSC基因家族的基因結(jié)構(gòu),并利用MEME5.1在線網(wǎng)站(http:∥meme-suite.org/tools/meme)[12]對(duì)CqOSC蛋白進(jìn)行保守基序搜索,繪制作圖。

1.4 基因共線性

C.quinoa和C.pallidicaule(A亞基因組)C.suecicum(B亞基因組)兩個(gè)祖先種的基因組數(shù)據(jù)來自Chenopodium DB (https:∥www.cbrc.kaust.edu.sa/chenopodiumdb/download/download-auth.html)。利用共線性掃描工具包MCScanX[13]來分析研究CqOSC基因家族所有成員與兩個(gè)祖先基因的共線性區(qū)域。使用TBtools軟件繪制共線性圖。

1.5 啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件預(yù)測(cè)

CqOSC基因家族成員啟動(dòng)子序列(轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1500 bp)來源于NCBI網(wǎng)站,使用TBtools軟件提取信息,提交到Plantcare 在線網(wǎng)站(http:∥bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)[14]進(jìn)行預(yù)測(cè)順式作用元件的種類及分布情況,繪制順式作用元件圖。

1.6 基因表達(dá)模式

從SRA網(wǎng)站(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/)下載已知的藜麥多種組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(SRP226463、SRP116149)。以TPM(每百萬(wàn)讀取轉(zhuǎn)錄本)的形式將RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化統(tǒng)計(jì)和計(jì)算[15],進(jìn)行CqOSC基因的表達(dá)模式的分析,使用TBTools軟件繪制CqOSC基因家族表達(dá)模式分析圖。

1.7 藜麥開花外施MeJA基因定量表達(dá)

在藜麥(品種Faro)開花時(shí)外施不同濃度0(CK)、0.5、1和2 mmol/L的MeJA,處理24 h,提取花的RNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用RT-qPCR測(cè)定CqOSCs的基因相對(duì)表達(dá)量,內(nèi)參為Cq-Actin。使用Origin[16]軟件制作基因表達(dá)柱狀圖:以CK處理下CqOSC11基因表達(dá)量作為相對(duì)對(duì)照處理數(shù)據(jù),繪制藜麥花中各CqOSC基因的表達(dá)量圖;以每個(gè)基因各自CK處理下基因表達(dá)量為相對(duì)對(duì)照處理數(shù)據(jù),繪制不同濃度MeJA處理下藜麥開花時(shí)期各CqOSC基因表達(dá)量圖。

2 結(jié)果

2.1 CqOSC基因家族成員的鑒定

在藜麥全基因組中共鑒定到15個(gè)CqOSC基因家族成員,根據(jù)其在染色體上的位置依次命名為CqOSC1～CqOSC15(表1)。CqOSC基因的CDS長(zhǎng)度為1124～2630 bp;編碼的蛋白長(zhǎng)度為373～875個(gè)氨基酸,蛋白偏酸性;分子質(zhì)量介于42 186.54～100 870.02 U,分子質(zhì)量最大的蛋白是CqOSC4,最小的是CqOSC2;理論等電點(diǎn)介于5.54～6.48之間,其中等電點(diǎn)最大的蛋白是CqOSC5,等電點(diǎn)最小的蛋白是CqOSC2。蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,CqOSC2編碼的蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中,其余成員編碼的蛋白都定位在葉綠體中。

表1 CqOSCs基因及蛋白基本信息

2.2 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化

以藜麥、擬南芥和水稻的OSC蛋白序列為基礎(chǔ),進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析(圖1)。結(jié)果顯示,來自上述3個(gè)物種的40個(gè)蛋白根據(jù)進(jìn)化距離被劃分為4個(gè)亞組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)。亞組Ⅰ只有一個(gè)水稻基因(OsOSC12),亞組Ⅱ含有14個(gè)基因,其CqOSC基因有2個(gè),擬南芥和水稻各有2和10個(gè),亞組Ⅲ是CqOSC基因家族6個(gè)成員自成一支,亞組Ⅳ含有7個(gè)CqOSC家族成員和11個(gè)AtOSC家族成員。在進(jìn)化樹中可以看到CqOSC9和CqOSC10與AtCAS1進(jìn)化距離較近,初步可以推測(cè)它們是朝著CAS的方向進(jìn)化。亞組Ⅳ中CqOSC7、CqOSC11、CqOSC12、CqOSC13、CqOSC14和CqOSC15與分支中AtLUPs進(jìn)化距離相對(duì)較近,可以對(duì)其功能進(jìn)行簡(jiǎn)單預(yù)測(cè),但具體的驗(yàn)證要在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行探究。

種縮寫:Cq,藜麥;Os,水稻;At,擬南芥,據(jù)文獻(xiàn)[17]單獨(dú)命名。

2.3 基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守基序

對(duì)CqOSC基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)(圖2)及蛋白序列(圖3)結(jié)果顯示,由圖2可見整體CqOSC基因家族各個(gè)成員基因結(jié)構(gòu)存在較大差距,序列長(zhǎng)度長(zhǎng)短不一,內(nèi)含子與外顯子數(shù)目存在較大差異,外顯子數(shù)目從7～20不等,內(nèi)含子數(shù)目從6～19不等。但大多數(shù)位于同一分支或進(jìn)化距離較近的基因家族成員結(jié)構(gòu)相似,序列長(zhǎng)度、外顯子和內(nèi)含子數(shù)目相近,但也有同一分支成員存在較大差異,CqOSC2與CqOSC6序列長(zhǎng)度雖然相近,但是外顯子與內(nèi)含子的數(shù)目明顯不同。相反,CqOSC7與CqOSC12雖然序列長(zhǎng)度存在很大差異,但外顯子與內(nèi)含子的數(shù)目相近,并且含有一段十分相似的內(nèi)含子區(qū)域。由圖3可見,CqOSC2和CqOSC14蛋白序列上缺少N端的一個(gè)Motif,CqOSC2和CqOSC15蛋白序列缺少C端的一個(gè)Motif,保守基序的缺失可能會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的功能產(chǎn)生影響。保守結(jié)構(gòu)域DCTAE和QW包含在Motif 2和Motif 3中,15個(gè)CqOSCs都含有這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。除CqOSC2與CqOSC6外,同一分支或進(jìn)化距離較近的家族成員Motif相似,由圖可見CqOSC蛋白序列同源性較高,結(jié)合說明CqOSC大部分基因家族成員家族進(jìn)化過程中變化較小。

圖2 CqOSC基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)分析

圖3 CqOSC基因家族成員的蛋白保守基序分析

2.4 基因共線性

由圖4(a)可見,C.quinoa與C.pallidicaule(A亞基因組)、C.suecicum(B亞基因組)的共線性分析有6個(gè)基因(CqOSC9、CqOSC1、CqOSC5、CqOSC7、CqOSC14、CqOSC15)與C.pallidicaule祖先種存在同源性,其中CqOSC1與CqOSC5均與scaffold-487染色體上的基因同源,CqOSC7、CqOSC14與CqOSC15均與scaffold-349染色體上的基因同源,只有CqOSC9與scaffold-122染色體上的基因同源。由圖4(b)可見,C.quinoa有7個(gè)基因(CqOSC10、CqOSC7、CqOSC8、CqOSC11、CqOSC12、CqOSC13、CqOSC15)與C.suecicum祖先種存在同源性,其中除CqOSC10與scaffold-92染色體上的基因同源外,其余基因家族成員與scaffold-44同源。這一分析結(jié)果可以顯示CqOSC基因家族成員在系統(tǒng)發(fā)生上與其祖先種的進(jìn)化關(guān)系。

圖4 C. quinoa與C. suecicum、C. pallidicaule間OSC基因的共線性分析

2.5 啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件預(yù)測(cè)

CqOSC基因家族啟動(dòng)子區(qū)共鑒定到多種順式作用元件(圖5)。經(jīng)鑒定共有18種響應(yīng)元件,其中數(shù)量最多的是光響應(yīng)元件(160個(gè)),可分為24類;激素響應(yīng)元件也占很大比例(77個(gè)),包括赤霉素(TATC-box、P-box、GARE-motif)、生長(zhǎng)素(TGA-element、AuxRR-core)、脫落酸(ABRE)、茉莉酸甲酯(CGTCA-motif、TGACG-motif)、水楊酸(TCA-element)等響應(yīng)元件,其中茉莉酸甲酯響應(yīng)元件占比較大,12個(gè)成員含有該響應(yīng)元件,其中CqOSC2基因上游1500 bp含有3個(gè)MeJA響應(yīng)元件,CqOSC8、CqOSC10和CqOSC14上游含有2個(gè),CqOSC1、CqOSC4、CqOSC5、CqOSC7、CqOSC9、CqOSC11、CqOSC12和CqOSC13上游只含有1個(gè),而CqOSC3、CqOSC6和CqOSC15上游不含MeJA響應(yīng)元件;還有逆境脅迫和環(huán)境應(yīng)激響應(yīng)元件,包括厭氧誘導(dǎo)(ARE、GC-motif)、低溫(LTR)、干旱(MBS)、參與防御和壓力反應(yīng)(TC-rich repeats)、和創(chuàng)傷應(yīng)激(WUN-motif)等響應(yīng)元件。這表明CqOSC基因家族成員的表達(dá)會(huì)受到激素或逆境脅迫等因素影響。

圖5 CqOSC基因啟動(dòng)子區(qū)(1500 bp)順式作用元件的分布

除此之外,還存在其他的作用元件,但具有明顯的特異性,數(shù)量較少,如根上的順式作用元件motif I是根上的特殊元件、CAT-box參與分生組織的表達(dá)、GCN4-motif參與胚乳表達(dá)的順式作用元件、Circadian控制植物的晝夜節(jié)律、O2-site參與玉米醇溶蛋白代謝調(diào)節(jié)、MBSI調(diào)控類黃酮合成等。

2.6 RNA-Seq表達(dá)模式

CqOSC基因家族在10種不同組織器官中的表達(dá)模式表明(圖6),總體來看家族成員表達(dá)具有較大區(qū)別:CqOSC2、CqOSC3、CqOSC4、CqOSC5、CqOSC11、CqOSC14和CqOSC15在各個(gè)部位的表達(dá)量都較低,而CqOSC9與CqOSC10在所有組織中均存在不同水平的表達(dá),說明這兩個(gè)成員與藜麥的這個(gè)整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段都有關(guān)系,其余CqOSC家族成員的基因表達(dá)情況具有明顯的特異性。CqOSC6雖然和CqOSC2屬于同一分支,但基因表達(dá)情況卻明顯不同,CqOSC6在頂端分生組織、花和未成熟的果實(shí)、葉柄、節(jié)間莖、花序、葉、白甜藜花和白黃苦藜花都有不同程度的表達(dá),猜測(cè)CqOSC6主要參與藜麥的生長(zhǎng)階段的前中期。CqOSC1和CqOSC8都主要在頂端分生組織和花序中表達(dá)。CqOSC7和CqOSC12除了在葉和白藜的花中存在較少外,在其他組織中都有所表達(dá),尤其是在花和未成熟的種子中表達(dá)量極高,在其他幾個(gè)部位的花和種子中表達(dá)量也都較高,推測(cè)其主要與藜麥種皮上皂苷的積累有關(guān),具體的情況需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。

圖6 CqOSC基因在藜麥不同組織中的表達(dá)模式分析

2.7 藜麥開花外施MeJA基因定量表達(dá)

對(duì)藜麥開花期花序中CqOSC基因家族各成員的相對(duì)表達(dá)量的RT-qPCR分析(圖7)可知,在開花時(shí)CqOSC7的基因表達(dá)量是最高的,CqOSC11的表達(dá)量最低,除此之外還有CqOSC6、CqOSC9、CqOSC10、CqOSC12基因表達(dá)量相對(duì)較多,CqOSC13、CqOSC15基本不表達(dá),大部分同一分支基因表達(dá)量相近。通過外施不同濃度MeJA可以看到各個(gè)基因?qū)eJA的響應(yīng)情況(圖8),其中CqOSC2、CqOSC4、CqOSC8等基因的表達(dá)量受MeJA影響較為顯著,而CqOSC3、CqOSC6、CqOSC15基因表達(dá)量則基本沒有變化。CqOSC基因家族對(duì)外施不同濃度MeJA響應(yīng)表現(xiàn)為常見的低促高抑現(xiàn)象。在外施0.5 mmol/L和1 mmol/L MeJA時(shí)基本是提高基因表達(dá)量,在濃度達(dá)到2 mmol/L時(shí)表達(dá)量顯著下降。

圖7 開花時(shí)期藜麥花中CqOSC基因的表達(dá)

圖8 不同濃度MeJA處理藜麥開花時(shí)期CqOSC基因表達(dá)量

3 分析與討論

藜麥目前作為一種高營(yíng)養(yǎng)的新興糧食在市場(chǎng)逐漸火熱,但研究發(fā)現(xiàn)藜麥種皮上含有的皂苷使其具有一定的苦味與毒性,需要水洗或機(jī)械研磨去除[18],影響其種植與推廣。2,3-氧化角鯊烯環(huán)化酶(OSC)是皂苷產(chǎn)生途徑中的關(guān)鍵酶,在多種植物中皆有發(fā)現(xiàn),依據(jù)其蛋白上具有高度保守序列的特點(diǎn),結(jié)合前人對(duì)基因家族生信分析的研究,可以快速找到藜麥中OSC基因家族成員。有研究在擬南芥和水稻中分別發(fā)現(xiàn)13個(gè)AtOSCs與12個(gè)OsOSCs[19]。通過與這25個(gè)成員對(duì)比,在藜麥基因組中鑒定得到15個(gè)CqOSC基因家族成員,在系統(tǒng)發(fā)育發(fā)育分析中可以看到CqOSC的成員與同為雙子葉植物的擬南芥親緣關(guān)系更近。研究發(fā)現(xiàn)OSC基因家族的天然結(jié)構(gòu)具有多樣性,這是由于OSC酶的核心部位可以具有多種變換而產(chǎn)生的[3],所以CqOSC家族的基因結(jié)構(gòu)具有較大差別。同時(shí)家族成員都含有Motif1/2/3這三個(gè)蛋白保守基序,推測(cè)這三個(gè)保守基序?qū)ζ渖飳W(xué)功能具有重要意義。皂苷的苦味使其在一定程度上具有抵御蟲害的作用,所以CqOSC成員與祖先種相較在進(jìn)化過程中不僅沒有丟失,相反數(shù)目還進(jìn)行了明顯的擴(kuò)增,并且表現(xiàn)為祖先種一條染色體上的基因進(jìn)化到藜麥的不同染色體上,猜測(cè)與二倍體祖先種C.pallidicaule(A亞基因組)、C.suecicum(B亞基因組)不斷雜交產(chǎn)生染色體加倍相關(guān)。

結(jié)合各CqOSC基因在藜麥不同組織中的表達(dá)模式分析和開花時(shí)外施不同濃度MeJA處理后各成員基因表達(dá)情況結(jié)果來看,CqOSC家庭成員在生殖生長(zhǎng)過程中具有顯著的組織特異性,CqOSC6、CqOSC7、CqOSC12在花以及種子中表達(dá)量較高,其可能與種子中皂苷的積累有密切關(guān)系;而CqOSC6同時(shí)與CqOSC8在頂端分生組織中表達(dá)量高,CqOSC9與CqOSC10在整個(gè)表達(dá)模式中表達(dá)量都較高,其可能與藜麥整株皂苷的積累相關(guān)。FIALLOS-JURADO[20]等發(fā)現(xiàn)將藜麥葉片浸泡在MeJA中30 s后,藜麥葉片的皂苷合成量增加,本實(shí)驗(yàn)適當(dāng)改變處理?xiàng)l件,再結(jié)合圖5與圖8的結(jié)果顯示,開花時(shí)外施不同濃度MeJA,基因上游不含有MeJA的響應(yīng)元件的CqOSC3、CqOSC6、CqOSC15基因表達(dá)量基本沒有變化,而含有MeJA響應(yīng)元件較多的CqOSC2、CqOSC4、CqOSC8等基因的表達(dá)量變化顯著,所以CqOSC基因家族成員的表達(dá)模式與其基因上游MeJA響應(yīng)元件數(shù)量相關(guān)。同時(shí)CqOSC基因家族對(duì)外施不同濃度MeJA響應(yīng)變現(xiàn)為常見的低促高抑現(xiàn)象:在外施0.5 mmol/L和1 mmol/L MeJA時(shí)基本是提高基因表達(dá)量,在濃度達(dá)到2 mmol/L時(shí)表達(dá)量顯著下降,抑制了基因表達(dá),說明MeJA同樣影響藜麥花期皂苷合成,在后續(xù)種植或研究可以考慮外施MeJA來降低種子中的皂苷含量。綜上所述,通過生物信息學(xué)的方法對(duì)CqOSC基因家族各個(gè)成員進(jìn)行分析預(yù)測(cè),對(duì)其基因功能的后續(xù)研究具有一定的參考意義。