鐘木森 安忠誠 樊光亞 暴紀謙 蘇文碩 董黎強

[摘要]?目的?基于網(wǎng)絡藥理學、分子對接驗證補陽還五湯治療脊髓損傷的作用機制。方法?通過TCMSP、SymMap、PubChem、Swiss?Target?Prediction數(shù)據(jù)庫篩選補陽還五湯的活性成分和靶點。從OMIM、GeneCards、TTD、DrugBank數(shù)據(jù)庫檢索脊髓損傷的靶點。通過venny軟件獲取補陽還五湯與脊髓損傷的交集靶點。用Cytoscape軟件構(gòu)建補陽還五湯治療脊髓損傷的活性成分-靶點網(wǎng)絡。通過DAVID數(shù)據(jù)庫對共同靶點進行基因本體論和京都基因與基因組百科全書富集分析，分子對接技術(shù)分析藥物與靶點的結(jié)合能力。結(jié)果?共得到補陽還五湯中活性成分106個，作用靶點225個，脊髓損傷靶點1315個，藥物-疾病交集靶點112個。補陽還五湯主要通過槲皮素、山柰酚、鞣花酸、木樨草素、常春藤皂苷元等藥物活性成分治療脊髓損傷。結(jié)論?補陽還五湯可通過多種信號通路達到治療脊髓損傷的目的。

[關鍵詞]?補陽還五湯；脊髓損傷；網(wǎng)絡藥理學；作用機制；分子對接

[中圖分類號]?R683.2??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.01.016

Mechanism?of?Buyang?Huanwu?decoction?in?the?treatment?of?spinal?cord?injury?based?on?network?pharmacology

ZHONG?Musen1，?AN?Zhongcheng2，?FAN?Guangya1，?BAO?Jiqian1，?SU?Wenshuo1，?DONG?Liqiang2

1.The?Second?School?of?Clinical?Medicine，?Zhejiang?Chinese?Medical?University，?Hangzhou?310053，?Zhejiang，?China;?????????2.Department?of?Orthopedics，?the?Second?Affiliated?Hospital?of?Zhejiang?Chinese?Medical?University，?Hangzhou?310005，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?To?verify?the?mechanism?of?Buyang?Huanwu?decoction?in?the?treatment?of?spinal?cord?injury?based?on?network?pharmacology?and?molecular?docking.?Methods?The?active?ingredients?and?targets?of?Buyang?Huanwu?decoction?were?screened?out?by?TCMSP，?SymMap，?PubChem?and?Swiss?Target?Prediction?databases.?Spinal?cord?injury?targets?were?retrieved?from?OMIM，?GeneCards，?TTD，?and?DrugBank?databases.?Through?venny?software，?the?intersection?target?of?Buyang?Huanwu?decoction?and?spinal?cord?injury?was?obtained.?The?active?ingredient-target?network?for?the?treatment?of?spinal?cord?injury?was?constructed?with?Cytoscape?software.?Gene?ontology?and?Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes?enrichment?analysis?of?common?targets?were?carried?out?by?DAVID，?and?the?binding?ability?of?drugs?and?targets?was?analyzed?by?molecular?docking?technology.?Results?A?total?of?106?active?ingredients?and?225?targets?of?Buyang?Huanwu?decoction，?1315?targets?of?spinal?cord?injury?and?112?targets?of?drug-disease?intersection?were?obtained.?The?active?ingredients?of?Buyang?Huanwu?decoction?were?quercetin，?kaempferol，?ellagic?acid，?luteolin?and?hederagenin?in?the?treatment?of?spinal?cord?injury.?Conclusion?Buyang?Huanwu?decoction?can?achieve?the?purpose?of?treating?spinal?cord?injury?through?various?signal?pathways.

[Key?words]?Buyang?Huanwu?decoction;?Spinal?cord?injury;?Network?pharmacology;?Mechanism?of?action;?Molecular?docking

脊髓損傷是一種致殘率高、治療時間長且費用高昂的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1-2]。我國脊髓損傷的年患病率為37人次/100萬，男性高于女性，主要由墜落傷、交通事故等因素引起[3]。現(xiàn)代醫(yī)學主要采取多學科協(xié)作的診療方案，主要包括急性期的外科治療和亞急性期及后期的康復治療，但治療效果有限[4]。傳統(tǒng)中醫(yī)學沒有脊髓損傷的病名，但歷代典籍將該病歸為痿證、體惰?！鹅`樞·寒熱病》指出“身有所傷，血出多……四肢懈惰不收，名曰體惰”。中醫(yī)學主要以補法、通法作為治療脊髓損傷的治法。清代王清任所著《醫(yī)林改錯》中的補陽還五湯是治療氣虛血滯、脈絡瘀阻導致半身不遂、口眼?斜、語言謇澀的經(jīng)典方，具有益氣、活血、通絡之功。動物實驗表明，補陽還五湯可通過改善缺血狀態(tài)、抗炎、抗氧化、減少神經(jīng)細胞凋亡等方式治療脊髓損傷[5]。本文通過網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術(shù)研究補陽還五湯治療脊髓損傷的主要藥物成分及相關信號通路，旨在為臨床治療提供診療思路。

1??材料與方法

1.1??藥物活性成分篩選及靶點預測

檢索中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（traditional?Chinese?medicine?systems?pharmacology?database?and?analysis?platform，TCMSP）（https：//tcmsp-?e.com/tcmsp.php）查找補陽還五湯中黃芪、桃仁、紅花、赤芍、川芎、當歸成分及作用靶點，以口服生物利用度（oral?bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug?likeness，DL）≥0.18篩選補陽還五湯的有效成分及藥效靶點[6]。因TCMSP中未找到地龍，故在SymMap數(shù)據(jù)庫（www.symmap.org）搜索地龍的有效成分，在PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.?ncbi.nlm.nih.gov）下載地龍有效成分的SDF文件，篩選GIabsorption為“HIGH”、DL評估中≥3個“YES”，通過Swiss?Target?Prediction數(shù)據(jù)庫（http：//swisstargetprediction.ch）預測其作用靶點。利用UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）轉(zhuǎn)換靶點的基因名稱。

1.2??疾病靶點基因篩選

以“spinal?cord?injury”為關鍵詞，通過OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org）、GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org）、TTD數(shù)據(jù)庫（https：//db.idrblab.net/ttd）、DrugBank數(shù)據(jù)庫（https：//go.drugbank.com）篩選相關系數(shù)≥8的靶點，隨后整合，去除重復值，得到脊髓損傷的靶點并導出檢索結(jié)果。

1.3??中藥成分-疾病靶點網(wǎng)絡構(gòu)建

通過venny2.1.0繪制成分靶點與疾病靶點的韋恩圖，取二者交集靶點，并將其數(shù)據(jù)輸入Cytoscape?3.7.2軟件，構(gòu)建中藥成分-靶點網(wǎng)絡。

1.4??蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡的構(gòu)建

將交集靶點輸入STRING（https：//cn.string-db.org），篩選“Homo?sapiens”，置信度≥0.400，去除重復后導出。利用Cytoscape?3.7.2軟件進行數(shù)據(jù)可視化分析。

1.5??信號通路分析

把藥物、疾病的交集靶點輸入DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov）進行基因本體論（gene?ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes，KEGG）信號通路富集分析，設置篩選條件為P<0.05，在微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn）平臺通過生物過程、分子功能、細胞組分和KEGG信號通路選擇P值最小的前20條結(jié)果制作條形圖和氣泡圖。

1.6??活性成分-核心靶點的分子對接

在PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org）、PubChem數(shù)據(jù)庫中獲取關鍵蛋白和關鍵化合物的3D結(jié)構(gòu)，使用PyMol軟件對所有關鍵蛋白進行加氫處理，利用ADFRsuite?1.0將關鍵化合物及關鍵蛋白轉(zhuǎn)換為PDBQT格式，用AutoDock?Vina?1.1.2進行分子對接。

2??結(jié)果

2.1??補陽還五湯活性成分靶點收集

補陽還五湯中滿足條件的化合物共106個，其中包括黃芪20個成分、桃仁23個成分、紅花22個成分、赤芍29個成分、川芎7個成分、當歸2個成分、地龍3個成分。收集靶點基因共546個，除去重復靶點321個，剩余225個靶點基因。

2.2??脊髓損傷作用靶點篩選

檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫得到1218個靶點，檢索OMIM數(shù)據(jù)庫得到107個靶點，檢索DrugBank數(shù)據(jù)庫得到15個靶點，檢索TTD數(shù)據(jù)庫得到7個靶點，整合去重后獲得1315個靶點。

2.3??補陽還五湯活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡構(gòu)建

通過venny2.1.0平臺繪制藥物成分和疾病靶點的韋恩圖，取得共同靶點112個，見圖1。通過Cytoscape?3.7.2軟件構(gòu)建活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡圖，根據(jù)Cytoscape軟件算出有效成分的degree值，degree值越大，表示節(jié)點越重要。結(jié)果顯示degree值前5位的分別為槲皮素、山柰酚、鞣花酸、木樨草素、常春藤皂苷元，見表1。

2.4??蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡結(jié)果

將共同靶點信息導入STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡。篩選出前6位關鍵靶點為腫瘤壞死因子（tumor?necrosis?factor，TNF）、白細胞介素（interleukin，IL）-6、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（serine/threonine?kinase?1，AKT1）、腫瘤蛋白P53（tumor?protein?P53，TP53）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular?endothelial?growth?factor?A，VEGFA）、IL-1β。

2.5??GO和KEGG通路富集分析

GO富集分析得到932個結(jié)果，其中與生物過程有關的727個，包括基因表達的正向調(diào)控、細胞凋亡的正負向調(diào)控、藥物反應、對脂多糖的反應等，見圖2；與細胞組分有關的83個，涉及細胞外間隙、膜筏、細胞表面、線粒體等，見圖3；與分子功能有關的122個，涉及酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等，見圖4。根據(jù)P值排序，取前20個富集結(jié)果制作成條狀圖。KEGG分析得到446條重要信號通路，主要涉及晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced?glycation?end?product，AGE）/晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor?for?advanced?glycation?end?product，RAGE）信號通路、IL-17信號通路、VEGF信號通路、TNF信號通路、磷脂酰肌醇3激酶

（phosphoinositide?3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein?kinase?B，AKT）信號通路等。根據(jù)P值，取前20條信號通路繪制氣泡圖，見圖5。

2.6??分子對接分析

以degree值較高的成分槲皮素、山奈酚、鞣花酸、木犀草素、常春藤皂苷元與關鍵靶點TNF、IL-6、AKT1、TP53、VEGFA、IL-1β進行分子對接，結(jié)果顯示5個主要活性成分與6個關鍵靶點均具有良好的結(jié)合能力，結(jié)合能均≤–5.0kcal/mol，見表2。對接結(jié)果可視化見圖6。

3??討論

脊髓損傷常伴隨著諸多并發(fā)癥，包括損傷平面以下的肢體癱瘓、神經(jīng)病理性疼痛、功能障礙等，給患者造成極大的精神折磨和經(jīng)濟負擔。目前仍無法完全治愈脊髓損傷，只能盡量減少神經(jīng)、組織、細胞的繼發(fā)性損傷，盡可能恢復脊髓殘余功能[7]。中醫(yī)認為，脊髓損傷多由墜落跌撲等外因和筋脈失養(yǎng)等內(nèi)因造成，多屬氣滯血瘀證。治療上以益氣活血通絡為主，補陽還五湯是益氣活血法中的代表方，研究表明補陽還五湯對脊髓損傷有較好療效[8]。

補陽還五湯中生黃芪大補元氣，以促血行，祛瘀通絡，為君藥。當歸尾活血通絡而不傷血，為臣藥。赤芍、川芎、桃仁、紅花助當歸尾活血祛瘀，為佐藥；地龍通經(jīng)活絡，引導藥力直達絡中，為佐使藥。諸藥合用共奏益氣、消瘀、通絡之功。本研究發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯中有106個化合物，其中槲皮素、山奈酚、鞣花酸、木犀草素、常春藤皂苷元可能是治療脊髓損傷的有效成分。

槲皮素存在于黃芪、紅花中，是一種具有抗炎、抗癌、抗感染和抗氧化的黃酮醇，它可通過激活PI3K/AKT信號通路抑制神經(jīng)細胞凋亡下游相關分子的表達，如胱天蛋白酶-3（caspase-3）、caspase-6、caspase-9、Bcl-2與Bax，降低IL-4、IL-6、TNF-α等炎癥因子水平；還可通過信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄活化因子1（signal?transducer?and?activator?of?transcription?1，STAT1）和核因子κB（nuclear?factor-κB，NF-κB）信號通路抑制巨噬細胞/小膠質(zhì)細胞極化為M1型，同時促進極化為M2型巨噬細胞[9-10]。Firgany等[11]提出槲皮素可通過降低谷氨酸興奮性毒性使磷酸化活化轉(zhuǎn)錄因子2基因表達降低，抑制p38絲裂原激活的蛋白激酶（p38?mitogen-activated?protein?kinase，p38?MAPK）信號通路。此外槲皮素還可間接通過激活星形膠質(zhì)細胞攝取和處理細胞外的谷氨酸，減少谷氨酸興奮性毒性，從而降低Ca2+濃度、清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化。槲皮素多以苷的形式存在，如槲皮素-3-O-葡萄糖苷，該化合物可激活AKT磷酸化、細胞周期蛋白D1表達和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived?neurotrophic?factor，BDNF）的產(chǎn)生，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

山柰酚存在于黃芪、紅花中，是一種常見的黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化的藥理作用。它能通過抑制DNA和髓樣分化因子88（myeloid?differentiation?factor?88，MyD88）的NF-κB結(jié)合活性、抑制IL-6、IL-1β、IL-18和TNF-α的釋放、增加核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關因子2（nuclear?factor-erythroid?2-related?factor?2，Nrf2）調(diào)控基因的mRNA和蛋白表達、抑制Toll樣受體4等不同作用機制發(fā)揮抗炎作用[12-15]。研究顯示，山奈酚是一種很好的抗氧化劑，它可抑制小膠質(zhì)細胞活化來緩解氧化應激，降低還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4介導的活性氧（reactive?oxygen?species，ROS）的產(chǎn)生[16]。其中，線粒體碎裂誘導的ROS可導致神經(jīng)元損傷并激活MAPK、NF-κB引發(fā)神經(jīng)炎癥，山奈酚或許可減輕線粒體損傷。

鞣花酸存在于赤芍中，是一種天然多酚組分，具有較強的抗氧化、抗炎作用。它可通過清除自由基、增強抗氧化酶的活性、抑制脂質(zhì)過氧化和減少ROS產(chǎn)生等多種方式發(fā)揮抗氧化作用[17]。鞣花酸還可抑制包括NF-κB、MAPK和JAK-STAT等多條炎癥信號通路。鞣花酸與NF-κB前體蛋白p105結(jié)合，阻礙NF-κB與特定DNA結(jié)構(gòu)域結(jié)合，抑制NF-κB調(diào)控基因表達[18]。鞣花酸還能抑制NF-κB抑制蛋白（inhibitor?of?NF-κB，IκB）的磷酸化及影響NF-κB易位從而抑制NF-κB信號通路[19]。MAPK是細胞內(nèi)一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。有研究證實鞣花酸可以劑量依賴性方式抑制MAPK信號通路的激活，降低相關促炎因子的基因表達[20]。鞣花酸還可抑制JAK1、JAK2和STAT1的磷酸化，阻斷JAK-STAT信號通路的反應途徑[21]。

木犀草素存在于紅花中，是一種天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化等作用。它通過激活PI3K/AKT通路清除細胞外的ROS減少氧化應激、調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax比例、抑制過氧化氫等方式來調(diào)節(jié)細胞凋亡[22]。研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素可通過低氧誘導因子1α（hypoxia-inducible?factor?1α，HIF-1α）/核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白（nucleotide-binding?oligomerization?domain-like?receptor?protein?3，NLRP3）信號通路抑制HIF-1α、NLRP3和caspase-1蛋白表達，還具有升高超氧化物歧化酶活性、降低丙二醛含量及促炎細胞因子（TNF-α、IL-6）表達的作用，緩解細胞凋亡及炎癥反應[23]。研究發(fā)現(xiàn)木犀草素可促進Nrf2從細胞質(zhì)到細胞核的易位，通過激活Nrf2-ARE信號通路減少氧化應激[24]。木犀草素可抑制髓鞘堿性蛋白誘導肥大細胞的活化來發(fā)揮抗氧化作用，還可抑制小膠質(zhì)細胞活化及調(diào)控BDNF的表達、降低包括BIM、P53、TRB3等上調(diào)基因的mRNA表達，從而減少神經(jīng)細胞的凋亡[25]。

常春藤皂苷元存在于黃芪、桃仁中，具有抗炎、抗氧化、抗神經(jīng)退行性的藥理作用，可通過抑制p38MAPK磷酸化來減輕氧化應激對MAPK通路的激活作用、降低誘導型一氧化氮合酶、環(huán)氧合酶2表達水平，減少TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子，清除自由基和抑制一氧化氮產(chǎn)生[26-27]。研究表明常春藤皂苷可通過恢復線粒體電位的改變，減少ROS積累以保護神經(jīng)細胞；還可通過濃度依賴的方式促進PI3K/AKT信號通路下游靶標磷酸化及上調(diào)BDNF來調(diào)節(jié)細胞凋亡[28]。研究發(fā)現(xiàn)，常春藤皂苷元可通過降低IκBβ、IκBα、p65磷酸化水平抑制NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎作用[29]。

綜上所述，補陽還五湯治療脊髓損傷的作用機制涉及多成分、多靶點參與的多種生物過程和信號通路。方中的黃芪、桃仁、紅花、赤芍、當歸、川芎等關鍵成分可通過多種信號通路發(fā)揮抗氧化應激、抗炎、抗神經(jīng)元凋亡等作用，治療脊髓損傷。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻]

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（收稿日期：2023–03–23）

（修回日期：2023–11–24）