胡潤，姚沛，李俊蒽，桂仁捷，段華新

0 引言

淋巴瘤是血液系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，主要可分為非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma, NHL）和霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma, HL）[1]，傳統(tǒng)針對NHL和HL的治療方法主要包括化學(xué)治療、放射治療以及造血干細胞移植（hematopoietic cell transplantation, HCT）等，但常規(guī)放化療并不能完全根除腫瘤細胞，因此出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)的風(fēng)險較高，而HCT治療也因配型困難及眾多并發(fā)癥在一定程度上限制了其使用，因此亟需尋找更加安全有效的治療方法解決這一難題。隨著精準醫(yī)療時代的來臨，包括單克隆抗體、免疫檢查點抑制劑、嵌合抗原受體T細胞（chimeric antigen receptor T cell, CAR-T）、細胞因子治療以及疫苗等治療方法在一定程度上改善了淋巴瘤患者的預(yù)后[2]。目前已有多種CAR-T產(chǎn)品上市，然而，使用CAR-T細胞治療常會引起細胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome, CRS）、移植物抗宿主反應(yīng)（graft versus host disease, GVHD）、免疫效應(yīng)細胞相關(guān)神經(jīng)毒性綜合征（immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome, ICANS）等并發(fā)癥[3]。自然殺傷細胞（natural killer cells, NK）細胞作為另一種重要的免疫細胞，在對抗腫瘤方面有著天然的優(yōu)勢。在基于CAR-T的基礎(chǔ)上，現(xiàn)已被改造成CAR-NK用于腫瘤治療，旨在克服CAR-T治療的不足之處。本文將系統(tǒng)介紹CARNK在淋巴瘤治療中的研究現(xiàn)狀。

1 CAR-T產(chǎn)品及其適應(yīng)證

目前CAR-T產(chǎn)品主要針對于難治性或復(fù)發(fā)性大B細胞淋巴瘤（large B-cell lymphoma, LBCL）、濾泡型淋巴瘤（follicular lymphoma, FL）、B細胞急性淋巴細胞白血?。˙ lymphoblastic leukemia/lymphoma, B-ALL）以及多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）的后線治療，見表1。

2 NK細胞

NK細胞是一種天然細胞毒性淋巴細胞，在機體的免疫監(jiān)視中起關(guān)鍵作用[4]。NK細胞表面具有活化性殺傷細胞受體（killer activation receptor, KAR）和抑制性殺傷細胞受體（killer inhibitory receptor, KIR），受體通過與對應(yīng)配體相互作用產(chǎn)生激活或抑制信號，二者的整合及平衡決定了NK細胞的激活狀態(tài)[5]。例如，正常細胞不表達或表達低水平的NK細胞激活受體配體，但高表達主要組織相容性復(fù)合物Ⅰ類分子（major histocompatibility complexⅠ, MHC-Ⅰ）, MHC-Ⅰ可與KIR相結(jié)合以保護它們免受NK細胞攻擊；相反，腫瘤細胞因MHC-Ⅰ表達下調(diào)從而導(dǎo)致NK細胞活化[6]?；罨腘K細胞可以與靶細胞形成免疫突觸釋放穿孔素和顆粒酶等細胞毒顆粒發(fā)揮殺傷作用[7]，另外還可以通過Fas/FasL等死亡受體途徑誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[8]?？贵w依賴性的細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC）也是NK細胞發(fā)揮細胞毒性作用的重要方式，NK細胞通過CD16與靶細胞上IgG的Fc段結(jié)合從而促進靶細胞裂解[9]。也正因NK細胞天然的抗腫瘤作用，使其成為CAR工程的候選細胞。

3 CAR-NK

3.1 CAR結(jié)構(gòu)

NK細胞上表達的功能性CAR分子由四部分組成[3]：細胞外結(jié)合域、鉸鏈區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)信號域。細胞外結(jié)合域的單鏈可變抗體片段（single chain antibody fragment, scFv）可與腫瘤抗原結(jié)合，是決定CAR-NK細胞特異性和功能的重要部分。鉸鏈區(qū)與scFv共同組成了CAR細胞外結(jié)構(gòu)區(qū)，可維持效應(yīng)細胞CAR的穩(wěn)定表達?？缒そY(jié)構(gòu)域通過連接CAR的細胞外結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)激活信號結(jié)構(gòu)域，對細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及穩(wěn)定CAR結(jié)構(gòu)起重要作用?；诩毎麅?nèi)信號結(jié)構(gòu)域的不同目的，CAR-NK設(shè)計已經(jīng)發(fā)展到第四代。第一代CAR使用CD3ζ作為單一細胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域，第二、三代CAR結(jié)構(gòu)引入了CD28、CD137（4-1BB）、DAP10等共刺激分子，旨在增加NK細胞活化效應(yīng)以及殺傷活性。最近，攜帶IL-2或IL-15等“有效載荷分子”的第四代CAR已被設(shè)計出來，用于增強CAR-NK在體內(nèi)的持久性和抗腫瘤作用[10-11]。

3.2 NK細胞獲取

相較于T細胞，NK細胞的來源更加豐富，包括NK細胞系（如NK92）、外周血單核細胞（pe-ripheral blood mono nuclear cells, PBMCs）、臍帶血（umbilical cord blood, UCB）及誘導(dǎo)多能干細胞（induced pluripotent stem cells, IPSCs）等[3,11]。最初的CAR-NK細胞來源于NK細胞系，其中NK92細胞系由于缺乏KIR和淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1的表達，導(dǎo)致其相較于外周血NK細胞具備更強的細胞毒性[12]，且與其他繁瑣和耗時的獲取方式相比，NK細胞系更易于擴增和維持。但由于NK92細胞系屬于非整倍體，具有潛在的惡變傾向，所以輸注前必須經(jīng)過輻照以抑制其在體內(nèi)增殖及持久性[13]。從外周血中分離出NK細胞較為容易，且此時NK細胞已分化成熟，但此方法獲取的NK細胞數(shù)量較少且轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低，長時間培養(yǎng)后可導(dǎo)致細胞毒性降低[14]。UCB來源的NK細胞的優(yōu)勢在于具有強大的增殖能力，然而與外周血的NK細胞相比常表現(xiàn)為不成熟表型，因此細胞毒性較差[15]。IPSC是另一種NK細胞來源，其規(guī)避了供體之間的細胞異質(zhì)性帶來的風(fēng)險，且具有顯著的擴增潛力，可產(chǎn)生大量具有強細胞毒性的均質(zhì)NK細胞，這些細胞正常表達NKG2D、NKp46、Fas和TRAIL等激活受體，且KIR表達率低于外周血NK細胞[16]，因此現(xiàn)在也被廣泛用于CAR-NK細胞的制備。

4 臨床應(yīng)用

4.1 B細胞淋巴瘤

4.1.1 CD19 CD19在絕大多數(shù)B細胞惡性腫瘤中均有不同程度表達，并且在正常組織中的表達僅限于成熟B細胞、B細胞前體和漿細胞，是在B細胞淋巴瘤（B-cell lymphomas, BCL）中應(yīng)用最常見的靶點。目前已有多種靶向CD19的CAR-T產(chǎn)品上市，但CAR-T帶來的眾多不良反應(yīng)仍有待優(yōu)化和解決。臨床前研究已證明CD19 CAR-NK細胞的強大抗腫瘤作用，并且在對抗淋巴惡性腫瘤方面要優(yōu)于CAR-T[17-18]，目前已有眾多CD19 CAR-NK細胞的臨床試驗在進行中，見表2。FT596是IPSC衍生的靶向CD19 CAR-NK產(chǎn)品，其作為單一療法以及與利妥昔單抗或奧妥珠單抗聯(lián)合治療的臨床研究（NCT04245722）正在進行中。一例復(fù)發(fā)或難治性彌漫性大B細胞淋巴瘤（relapse/refractory diffuse large B-cell lymphoma, R/R DLBCL）患者納入該項研究，首次予以低劑量CAR-NK細胞輸注后取得部分緩解（partial response, PR），在經(jīng)第二次輸注后腫瘤減小50%并且腫瘤代謝較前降低70%，在≥3級的不良事件中僅觀察到中性粒細胞減少，在隨訪期間得到解決[19]。另外Liu等進行的臨床試驗中，2例DLBCL和4例濾泡型淋巴瘤（follicularlymphoma, FL）患者接受CD19 CAR-NK細胞輸注，治療后完全緩解（complete response, CR）率達到67%。重要的是，所有患者均未觀察到CRS、GVHD及ICANS等嚴重不良事件[20]，這也進一步證明了CAR-NK在療效相近的情況下，安全性方面要優(yōu)于CAR-T。

表2 CAR-NK在淋巴瘤中的臨床研究Table 2 Clinical study of CAR-NK in lymphoma

另外，在使用CAR-T治療過程中，通常會由于靶向抗原的下調(diào)和缺失或CAR-T細胞功能性失活而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)，對于前者引起的腫瘤復(fù)發(fā)可以通過靶向一種以上的抗原來解決，如Martyniszyn等構(gòu)建的CD19和CD20雙特異性CAR-T細胞在BCL中展現(xiàn)出良好活性[21]；而對于后者則可以重新制備并施用第二批CAR-T細胞解決問題，但由于CAR-T細胞制備的復(fù)雜性及患者自身T細胞數(shù)量不足和質(zhì)量低下，使得此方法難以成功，因此選擇獲取及制備更加容易的NK細胞或許是解決辦法之一。對此，Roex等制備了雙重靶向CD19和BCMA CAR-NK細胞，除了直接發(fā)揮抗腫瘤作用外，尚未發(fā)現(xiàn)正常細胞或組織毒性，并且在重塑腫瘤微環(huán)境中也發(fā)揮著重要作用[22]?？傮w而言，在目前的臨床前研究及臨床研究中，CAR-NK在基于CD19的過繼細胞療法中展現(xiàn)出了優(yōu)異的抗腫瘤作用，同時相較于CAR-T具有更低的細胞因子毒性、GVHD風(fēng)險以及制造成本等優(yōu)勢，這也為患者提供了一種新的治療選擇。

4.1.2 CD20 CD20是外周B細胞的重要標志物，表達于95%以上的BCL中。鑒于抗CD20單克隆抗體在BCL治療中取得的成功，CD20被認為是CAR設(shè)計的理想靶點[23]。研究表明CD20 CAR-T作為補救治療在利妥昔單抗治療后的R/R B-NHL中取得不錯療效[24]，而使用CAR-T治療時，由于T細胞免疫檢查點如PD-1的表達，抑制了CAR-T細胞的免疫活性，從而保護腫瘤細胞免于被殺死，而NK細胞的表面PD-1表達相對較低，并且CARNK可以通過多種機制識別腫瘤細胞，相較于CAR-T具有更高的靶向功效。此外，CD20 CAR介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可以克服抑制性受體和HLA配體之間產(chǎn)生的抑制性信號，在一定程度上克服了腫瘤耐藥性[25]。Chu等證明了其構(gòu)建的CD20 CARNK可有效殺死CD20陽性Burkitt淋巴瘤（Burkitt lymphoma, BL）細胞，減輕小鼠腫瘤負荷并延長生存期，在其后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)了羅米吡嗪可通過NKG2D增加CD20 CAR-NK細胞毒性發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用[25-26]。然而目前大多數(shù)用于NK細胞的CAR結(jié)構(gòu)都是基于CAR-T細胞的結(jié)構(gòu)而設(shè)計的，只能在個體化治療的基礎(chǔ)上使用，并且受到腫瘤微環(huán)境的限制，Liu等基于NKG2D-NKG2DL軸理論上設(shè)計了一種可溶性CD20 CAR-NK，其在BL等細胞系中已展現(xiàn)出強大抗腫瘤效應(yīng)[27]。另外為降低脫靶效應(yīng)及復(fù)發(fā)風(fēng)險，構(gòu)建雙特異性CAR可能是解決方法之一，目前有多種雙特異性CAR-T細胞進入了臨床研究[28-30]，該策略或許可應(yīng)用于CAR-NK的后續(xù)研究。

4.1.3 CD22 CD22是一種唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素家族的一個成員，在絕大多數(shù)B細胞惡性腫瘤中表達，包括B細胞急性淋巴細胞白血?。˙cell acute lymphoblastic leukemia, B-ALL）、高級別B細胞淋巴瘤（high grade B-cell lymphoma，HGBL）、慢性淋巴細胞白血?。╟hronic lymphocyte leukemia, CLL）和毛細胞白血?。╤airy cell leukemia, HCL）等[31]。一項回顧性分析表明CD22 CAR-T在NHL患者中的CR率可達64%（95%CI:46%～81%），值得注意的是其中大部分患者經(jīng)CD19 CAR-T治療失敗[32]，這也表明CD22是一種具有治療價值的靶點。除了單靶向CD22外，CD20和CD22雙靶向的CAR-T細胞也已被證明可同時有效靶向具有不同水平表達的CD22和CD20的B-NHL，并且在體內(nèi)外均表現(xiàn)出穩(wěn)健的抗腫瘤活性[33]。最近Kim等構(gòu)建了雙重靶向CD19和CD22的CAR-NK-92細胞，發(fā)現(xiàn)其在體內(nèi)外均能夠有效消除DLBCL細胞，證明了雙特異性CD19和CD20 CAR-NK細胞的治療潛力[34]。目前在CAR-NK平臺靶向CD22的研究并不多，基于在CAR-T細胞中的良好應(yīng)用，CAR-NK臨床試驗NCT03824964和NCT03692767招募既往接受過至少一線治療或HCT治療的CD22陽性BCL患者，通過注射CARNK細胞評估其與治療相關(guān)不良事件的發(fā)生情況，目前暫未公布相關(guān)研究結(jié)果。

4.2 T細胞淋巴瘤

T細胞淋巴瘤（T-cell lymphomas, TCL）是一種高度異質(zhì)性惡性腫瘤，占NHL比例不到15%[35]。目前針對TCL的CAR-T治療仍處于初步階段，研究表明，基于CAR-T的療法具有一定內(nèi)在挑戰(zhàn)性，因為CAR-T細胞和惡性T細胞表達共同的目標抗原，這種現(xiàn)象會導(dǎo)致輸注的CAR-T細胞攻擊自身[36]。相較于CAR-T細胞，CAR-NK細胞缺乏T細胞標志物的表達，并且可以來源于同種異體，這為TCL的治療提供無可替代的優(yōu)勢。T細胞常見的腫瘤標志物如CD3、CD4、CD5、CD7等已被用于CAR-NK的靶向構(gòu)建。Chen等構(gòu)建了第三代CD3 CAR-NK細胞，其在體內(nèi)展現(xiàn)出對人外周T細胞淋巴瘤（peripheral T-cell lymphomas, PTCL）強大的抗腫瘤活性[37]。但是由于CAR-NK細胞的耐久性較差導(dǎo)致其在體內(nèi)缺乏長期持久性，存在一定腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險，因此目前的CD3 CAR-NK細胞可用于其他方案治療后殘留T細胞腫瘤的消除。另外有研究發(fā)現(xiàn)靶向CD5的CAR-NK相較CD3具備更優(yōu)的療效[38]，在Chen團隊的另一項研究中，通過構(gòu)建CD5 CAR-NK細胞也驗證了其對抗PTCL的有效性[39]，臨床研究NCT05110742擬招募CD5表達大于30%的R/R TCL（包括PTCL、ALL、T-LBL等）患者，予以環(huán)磷酰胺和氟達拉濱的淋巴清除化療后接受CAR-NK細胞及IL15輸注，旨在評估其治療相關(guān)不良事件發(fā)生率。除此之外，Pinz等使用CD4 CAR-NK靶向PTCL細胞，發(fā)現(xiàn)其在體內(nèi)外均能有效消除腫瘤細胞[40]。除了以上靶點，臨床試驗NCT02742727通過招募各類型CD7陽性的TCL患者，旨在評估CD7 CAR-NK在TCL中的療效及安全性。到目前為止，CAR-T或CAR-NK在TCL中的研究并未取得明顯進展，原因在于T細胞腫瘤與正常T細胞擁有共同的抗原，如何跨越這一障礙是接下來研究的重點。

5 總結(jié)與展望

自從CAR工程問世以來，過繼細胞治療領(lǐng)域取得顯著發(fā)展，CAR-T細胞為基于CAR免疫療法的未來發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。盡管在血液腫瘤中已取得巨大成功，但CAR-T細胞的缺點如制備的復(fù)雜性、高成本、長耗時及不良反應(yīng)等在一定程度上限制了其臨床適用范圍。CAR-NK目前在血液腫瘤中的研究已初顯光芒，其相較于CAR-T具備更多優(yōu)勢，比如更豐富的殺傷機制、更簡單的獲取方式以及更安全的不良反應(yīng)等，目前在clinicaltrials.gov上已有數(shù)十項臨床試驗評估CAR-NK在淋巴瘤中的療效及安全性。而CAR-NK在淋巴瘤的應(yīng)用方面，絕大部分研究集中在BCL上，如何提高對TCL的療效也是未來探索的重點。盡管如此，CAR-NK目前也面臨著如CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低下、體內(nèi)持久性不足、免疫抑制腫瘤微環(huán)境等困難，對于CAR-NK的未來應(yīng)用，需要優(yōu)化基因修飾方法、預(yù)處理方案、細胞劑量以及聯(lián)合免疫治療或造血干細胞移植等提高CAR-NK治療功效，這需要更多的研究來促進CAR-NK的臨床轉(zhuǎn)化。相信基于NK細胞天然的抗腫瘤血統(tǒng)，CAR-NK技術(shù)的不斷發(fā)展，在不久的未來將會出現(xiàn)更加成熟、高效、安全的CAR-NK產(chǎn)品，為更多的淋巴瘤患者帶來福音。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。