劉思遠(yuǎn)，申東晨，劉崢，魯麗穎，徐恒，董愛榮

摘要：為探究染褐斑病不同程度的水曲柳葉片微生物多樣性和主要致病微生物，分析防治方法以維護(hù)水曲柳人工林生態(tài)安全、提升其經(jīng)濟(jì)效益，在帽兒山實(shí)驗(yàn)林場采集染褐斑病不同程度的葉片，采用高通量測序技術(shù)，測定并分析水曲柳葉片微生物群落結(jié)構(gòu)和物種組成。3組樣品感病前后共得到1 026個真菌分類操作單元（Operational Taxonomic Unit ，OUT）及322個細(xì)菌OUT。在細(xì)菌中，變形菌門和放線菌門為優(yōu)勢菌門；鞘氨醇單胞菌屬、醋酸桿菌屬、短根瘤菌屬等為主要優(yōu)勢屬。在真菌中，擔(dān)子菌門和子囊菌門為優(yōu)勢菌門；維希尼克氏酵母屬、殼針孢屬、漢納酵母屬為優(yōu)勢菌屬。3組樣品細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)無明顯差異，真菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)差異性顯著，初步推測尾孢菌屬為病原菌，但其致病性有待進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞：水曲柳；褐斑??；高通量測序；尾孢菌屬；菌群結(jié)構(gòu)

中圖分類號：S763.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1006-8023（2024）01-0001-08

Microbial Diversity in Leaves of Different Fraxinus mandshurica Brown Spot Disease Stages

LIU Siyuan， SHEN Dongchen， LIU Zheng， LU Liying， XU Heng， DONG Airong*

（College of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China）

Abstract：To investigate the microbial diversity and the main pathogenic microorganisms of Fraxinus mandshurica leaves with different degrees of brown spot disease， and to analyze the control methods to maintain the ecological safety and enhance the economic benefits of Fraxinus mandshurica plantation forests， leaves infected with brown spot disease to varying degrees at Maoershan Experimental Forest Farm were collected，and the microbial community structure and species composition of Fraxinus mandshurica leaves were determined and analyzed using high-throughput sequencing technology. A total of 1 026 fungal operational taxonomic units （OUT） and 322 bacterial OUTs were obtained before and after the disease in the three groups of samples. Among the bacteria， the phyla Proteobacteria and Actinobacteriota were the dominant phyla; the genera Sphingomonas， Acidibacter and Bradyrhizobium were the main dominant genera. Among the fungi， the phyla Ascomycota and Basidiomycota were the dominant phyla; the genera Vishniacozyma， Septoria， and Hannaella were the dominant genera. There were no significant differences in bacterial diversity and community structure among the three groups of samples， and significant differences in fungal diversity and community structure. It was preliminarily speculated that the Cercospora was a pathogenic bacterium， but its pathogenicity needed further study.

Keywords：Fraxinus mandshurica; brown spot; high-throughput sequencing; cercospora; microbial community structure

0引言

水曲柳（Fraxinus mandshurica）是木犀科（Oleaceae）梣屬（Fraxinus）植物，東北三大硬闊木之一，為東北地區(qū)的主要造林樹種，同時也是工業(yè)和民用高級用材[1-2]，廣泛分布于中國東北三省及西北部分地區(qū)，在俄羅斯、日本及朝鮮也有分布[3]。目前對水曲柳的研究較為全面，如生理學(xué)研究[4-6]、生態(tài)學(xué)研究[7-8]、遺傳育種研究[9-10]及繁育技術(shù)研究[11]等。由于破壞嚴(yán)重，加之對水曲柳的市場需求大，水曲柳資源已十分匱乏，伴隨著水曲柳人工種植數(shù)量增加，其病害也愈發(fā)嚴(yán)重，如水曲柳翅果斑點(diǎn)病、水曲柳梢頭白腐、花曲柳葉斑病、水曲柳白粉病、苗木根結(jié)線蟲病、煤污病和水曲柳幼苗褐斑病等都造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，因此對水曲柳病害的深入了解至關(guān)重要。水曲柳褐斑病多危害幼苗，發(fā)病后，嫩葉出現(xiàn)病斑，病斑顏色加深擴(kuò)大至大量葉片死亡，極大降低幼苗生長率，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[12-14]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)林場的水曲柳幼樹葉片均感染不同程度的褐斑病，導(dǎo)致葉片發(fā)黃甚至植株死亡，是現(xiàn)存水曲柳數(shù)量稀少的主要原因之一。此外國內(nèi)外對于其他褐斑病的相關(guān)研究十分豐富，目前常見的褐斑病有核桃褐斑病[15]、蘋果褐斑病[16]、松針褐斑病[17]、梨樹褐斑病[18]和柑橘褐斑病[19]等，但對水曲柳褐斑病的記載較少，僅有少數(shù)文獻(xiàn)提及，目前褐斑病的防治以化學(xué)防治為主，長此以往會造成環(huán)境污染或產(chǎn)生耐藥性等現(xiàn)象，利用拮抗微生物防治林木病害是近年來的研究熱點(diǎn)[20]，故運(yùn)用生物防治拮抗水曲柳褐斑病病原是一種有效可行的辦法。

高通量測序技術(shù)相比較傳統(tǒng)的生物測定方法更加快速、準(zhǔn)確、高效且能全面分析物種組成以及群落結(jié)構(gòu)[21- 22]，如鄧世林等[23]在分析感染楊樹灰斑病前后葉圍微生物變化時發(fā)現(xiàn)染病后病原菌棒盤孢屬（Coryneum）為優(yōu)勢真菌，Satoshi等[24]通過高通量測序研究法，分析桐與柞木的真菌群落組成隨著時間與腐朽程度的變化情況，結(jié)果表明腐朽木的分解速率受腐朽真菌的種群數(shù)量的影響。

目前為止，水曲柳褐斑病未引起足夠重視，關(guān)于水曲柳褐斑病的研究也鮮有報(bào)道，故探究其微生物群落結(jié)構(gòu)并進(jìn)一步分析防治方法在維護(hù)水曲柳人工林生態(tài)安全、提升其經(jīng)濟(jì)效益等方面具有重要意義。本研究運(yùn)用高通量測序法分析不同染病程度的葉片微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)變化，通過分析相關(guān)優(yōu)勢微生物的豐度，探究引起褐斑病的相關(guān)病原菌，為后續(xù)的褐斑病研究提供理論依據(jù)和試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1樣本采集

水曲柳健康葉片、發(fā)病葉片均于2022年6月采集于黑龍江省哈爾濱市帽兒山實(shí)驗(yàn)林場。采用“S”形十點(diǎn)采樣法，分別剪取3棵5年生健康葉片、感染褐斑病較輕（病斑面積占整個葉片面積的10%以下）及染病較重（病斑面積占整個葉片面積的10%以上）的水曲柳葉片，放入密封袋中以進(jìn)行后續(xù)DNA提取處理，編號為J1、B1、B2。

1.2水曲柳葉片總DNA提取及PCR擴(kuò)增

葉片先用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇浸泡15 s，無菌水沖洗3次去除殘留乙醇，再用0.5%的次氯酸鈉浸泡1 min后，再用無菌水沖洗3次?？侱NA的提取采用十六烷基三甲基溴化銨法（Cetyltrimethylammonium Bromide，CTAB）稍作修改，并用體積分?jǐn)?shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的質(zhì)量。使用帶條形碼的特異引物對總DNA的16S rRNA和ITS進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增采用50 μL PCR擴(kuò)增體系，擴(kuò)增反應(yīng)條件為98 ℃預(yù)變性5 min， 98 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物放于體積分?jǐn)?shù)為2%瓊脂凝膠電泳檢測，剩余樣品4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｃ拷M樣品設(shè)置3個樣本重復(fù)，J1的3個重復(fù)編號為L1、L2、L3;B1的3個重復(fù)編號為L4、L5、L6;B2的3個重復(fù)編號為L7、L8、L9。引物中的相對應(yīng)擴(kuò)增區(qū)域?yàn)?6S V5、V7 區(qū)引物，其作用是可以幫助鑒定細(xì)菌多樣性；ITS1 和ITS4區(qū)引物，其作用是可以幫助鑒定真菌多樣性。擴(kuò)增產(chǎn)物采用Illumina平臺對群落DNA片段進(jìn)行雙端（Paired-end）測序，測序過程由上海派森諾生物科技有限公司完成。

細(xì)菌上游引物序列：5′－AACMGGATTAGATACCCKG－3′ 下游引物序列5′－ACGTCATCCCCACCTTCC－3′。

真菌上游引物序列：5′－CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA－3′ 下游引物序列5′－GCTGCGTTCTTCATCGATGC－3′。

1.3數(shù)據(jù)分析

調(diào)用QIIME 2切除序列的引物片段，棄除未匹配引物的序列；調(diào)用DADA2進(jìn)行質(zhì)控、去噪、拼接、去嵌合體、去噪，合并OTUs特征序列和OTU表格，統(tǒng)計(jì)各樣本在門、綱、目、科、屬、種6個分類水平下的組成分布的數(shù)據(jù)可視化，并以相對豐度呈現(xiàn)分析結(jié)果。物種比對注釋使用 RDP classifier 軟件，保留置信區(qū)間大于0.8的注釋結(jié)果。利用scikit-bio進(jìn)行豐富度（Chao1）指數(shù)、辛普森（Simpson）指數(shù)、覆蓋率（Coverage）指數(shù)計(jì)算，并在各分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析，得到微生物群落結(jié)構(gòu)組成。利用R語言ropls包進(jìn)行PCA分析樣本間的物種豐度組成差異。利用VennDiagram包制作韋恩圖。利用pheatmap包繪制物種組成熱圖。

2結(jié)果與分析

2.1感病前后樣品的細(xì)菌和真菌Alpha多樣性

α指數(shù)可以代表物種在生境內(nèi)的多樣性，例如coverage代表樣品文庫的覆蓋率，其數(shù)值越高，則樣品中序列被測出的概率越高。由表1可知，本次測序的coverage均達(dá)到0.99以上，說明本次測序結(jié)果代表樣品中微生物的一個真實(shí)的情況。Chao1可以用來估計(jì)群落中含OUT數(shù)目的物種總數(shù)，一般來講Chao1的數(shù)值越大代表物種總數(shù)越多，Shannon指數(shù)同樣可用來估算樣品中微生物多樣性，但其與微生物群落多樣性正相關(guān)。由表1可知，真菌的Chao1指數(shù)與Shannon指數(shù)隨著染病程度增加明顯下降；細(xì)菌的Chao1指數(shù)與Shannon指數(shù)隨著染病程度增加明顯上升。結(jié)果表明，隨著病菌侵染的加重，內(nèi)生真菌豐富度及多樣性呈現(xiàn)出下降的趨勢，內(nèi)生細(xì)菌的豐富度及多樣性逐漸上升。

2.2真菌Beat多樣性

基于主坐標(biāo)分析樣品間多樣性差異，評估不同病級的水曲柳葉片內(nèi)生真菌的差異性，如圖1所示。結(jié)果表明，第一主坐標(biāo)（PC1）與第二主坐標(biāo)（PC2）的貢獻(xiàn)率分別為90.2%和8.5%。健康葉J1的3個樣品相聚較近，而發(fā)病較輕的B1和較重的B2相聚較近，表明在褐斑病侵染的情況下，內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，無病斑葉與染病葉內(nèi)生真菌群落構(gòu)成差異明顯。

2.3不同侵染級別的水曲柳葉OUT分類

根據(jù)97%相似度對抽平后的序列進(jìn)行OTU聚類，由圖2可知，感病前后共得到1 208個真菌OUT及358個細(xì)菌OUT。不同染病程度的3組樣品中共有160個真菌OUT，占OUT總數(shù)的13.2%，3類樣品中特有的真菌OUT數(shù)目分別為367、287和212個，其中J1中特有的OUT數(shù)目最多。在不同染病程度的葉片中共有33個細(xì)菌OUT，占OUT總數(shù)的9.9%，3類樣品中特有的細(xì)菌OUT數(shù)目分別為45、92和152個，其中B2中特有的OUT數(shù)目最多。證明染病前后真菌的OUT數(shù)目顯著下降，細(xì)菌的OUT數(shù)目顯著上升，與表1結(jié)果一致。

2.4不同感染級別的水曲柳葉物種分類學(xué)注釋

通過圖3可直觀地展示各分組的注釋精度及不同分組的注釋情況。由圖3（a）可知，隨葉片染病程度增加，真菌門、綱、目、科、屬、種的OUT數(shù)量均明顯下降，真菌種水平下的OUT數(shù)目隨染病由282下降為273、240。由圖3（b）可知，隨葉片染病程度增加，細(xì)菌門、綱、目、科、屬、種的OUT數(shù)量均明顯上升，細(xì)菌種水平下的OUT數(shù)目隨染病由46上升為71、74。

2.5感病前后葉片細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性

對不同感染級別的葉片在不同的分類水平進(jìn)行群落組成分析，結(jié)果見表2，在細(xì)菌門水平下，3組樣品中主要包含變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）、擬桿菌門（Bacteroidota）及厚壁菌門（Firmicutes），其中變形菌門的相對豐度最高，分別達(dá)到97.56%、97.53%、97.26%，因此變形菌門為葉片內(nèi)生細(xì)菌中的優(yōu)勢菌門。

在屬水平下，健康葉J1相對豐度較高的屬有鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）（86.34%）、醋酸桿菌屬 （Acidibacter）（4.62%）、短根瘤菌屬（Bradyrhizobium）（2.84%）、酸球菌屬（Acidisoma）（2.23%）和副球菌屬（Paracoccus）（0.24%）等；染病較輕葉片B1相對豐度較高的屬有鞘氨醇單胞菌屬（87.63%）、醋酸桿菌屬（4.37%）、短根瘤菌屬（1.71%）、酸球菌屬（1.71%）和未被鑒定的擬桿菌科（muribaculaceae）（0.46%）等；染病較重葉片B2相對豐度較高的屬有鞘氨醇單胞菌屬（87.50%）、醋酸桿菌屬 （4.64%）、短根瘤菌屬（1.46%）、酸球菌屬（1.81%）和痤瘡棒狀桿菌屬（Cutibacterium）（0.52%）等。3組樣品的細(xì)菌群落組成不盡相同，主要優(yōu)勢屬大致相同，但相對豐度存在一定的差異性。短根瘤菌屬、酸球菌屬、假單胞菌屬和副球菌屬等在葉片染病后相對豐度呈一定下降趨勢；痤瘡棒狀桿菌屬、甲基桿菌屬隨著葉片發(fā)病，相對豐度有一定上升。

2.6感病前后葉片真菌群落結(jié)構(gòu)差異性

真菌的群落組成結(jié)果見表3，在門水平下，子囊菌門（Ascomycota）與擔(dān)子菌門（Basidiomycota）為主要的優(yōu)勢菌門，且在染病前后出現(xiàn)豐度差異，子囊菌門在健康葉B1中的相對豐度為56.89%，但在B1與B2樣品中相對豐度下降為32.63%和43.92%。擔(dān)子菌在J1中相對豐度為14.17%，染病后分別上升到51.46%和51.01%。

在屬水平下，健康葉J1相對豐度較高的屬有維希尼克氏酵母屬（Vishniacozyma）（2.53%）、殼針孢屬（Septoria）（39.71%）、宙斯沸耳屬（Dioszegia）（4.21%）、木耳屬（Auricularia）（1.47%）和鏈格孢屬（Alternaria）（1.29%）等；染病較輕葉片B1相對豐度較高的屬有維希尼克氏酵母屬（38.00%）、殼針孢屬（15.31%）、漢納酵母屬（Hannaella）（6.30%）、木耳屬（Auricularia）（1.52%）和尾孢菌屬（Cercospora）（1.34%）等；染病較重葉片B2相對豐度較高的屬有維希尼克氏酵母屬（35.63%）、殼針孢屬（18.27%）、漢納酵母屬（5.12%）、尾孢菌屬（4.14%）和宙斯沸耳屬（3.91%）等。其中希尼克氏酵母屬、漢納酵母屬和尾孢菌屬在葉片染病后相對豐度開始明顯上升，殼針孢屬相對豐度在染病后明顯下降。

2.7物種組成熱圖分析

根據(jù)真菌屬水平下相對豐度前15的數(shù)據(jù)繪制熱圖，結(jié)果如圖4所示。熱圖分析不同樣品的差異較為顯著，不同樣品之間優(yōu)勢種群存在顯著差異。熱圖分析顯示隨著病害的發(fā)生，樣品中的真菌微生物群落逐漸改變，優(yōu)勢菌群發(fā)生改變，樣品中的群落結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。從樣本聚類來看B1組和B2組的真菌微生物群落組成更為相似，表明染病后的菌群結(jié)構(gòu)相似度提高。殼針孢屬與宙斯沸耳屬等在J1樣本中豐度較高，而維希尼克氏酵母屬與尾孢菌屬等在染病葉片中豐度較高。

3討論

通過高通量測序技術(shù)，對不同染病程度的水曲柳葉片內(nèi)生細(xì)菌與真菌多樣性進(jìn)行分析，并研究其群落結(jié)構(gòu)。研究表明健康植物組織的內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定[25]，從而抑制病原菌的侵入與致病，張麗娜等[26]通過平板稀釋法培養(yǎng)健康與染病的山茶葉片，結(jié)果發(fā)現(xiàn)健康葉片的內(nèi)生真菌數(shù)量及多樣性遠(yuǎn)高于染病葉片。本研究中，健康葉片內(nèi)生真菌多樣性顯著高于染病葉片，這與先前的研究結(jié)論一致。

3組樣品的細(xì)菌優(yōu)勢門為變形菌門和放線菌門，

Sturz[27]研究發(fā)現(xiàn)在果樹等經(jīng)濟(jì)樹種及經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物的組織中也存在大量的變形菌門和放線菌門，與此同時甄泉[28]和方建波[29]的研究中提到，不同的林型空氣細(xì)菌群落中變形菌門、放線菌門以及厚壁菌門均是細(xì)菌的主導(dǎo)菌門，這說明水曲柳葉片樣品中的優(yōu)勢細(xì)菌很可能是在染病之前就大量存在，不是導(dǎo)致水曲柳褐斑病的主要病原。真菌群落中擔(dān)子菌門和子囊菌門是絕對的優(yōu)勢真菌，兩者均為常見的植物內(nèi)生真菌[30]，且染病前后相對豐度出現(xiàn)顯著變化。

鞘氨醇單胞菌屬作為內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢屬，可對紫外線輻射進(jìn)行預(yù)防，在白玉蘭、水稻等植物葉片內(nèi)生細(xì)菌群落研究中也有報(bào)道[31-32]。維希尼克氏酵母屬是常見植物內(nèi)生真菌，如趙衛(wèi)松等[33]研究表明患黃萎蔫病的馬鈴薯病株根際土壤中維希尼克氏酵母屬的相對豐度呈上升趨勢，但對其系統(tǒng)性研究卻鮮有報(bào)道[34- 35]。殼針孢屬是球殼孢目的無性屬，為許多植物病原菌，分布于全球多種植物，常引起葉斑等癥狀[36]，但在本研究中殼針孢屬相對豐度在染病后下降，同時其也為常見的內(nèi)生真菌[37-38]，不考慮為病原菌。水曲柳褐斑病其致病菌有研究認(rèn)為是半知菌球殼孢目[13]，有研究認(rèn)為是白蠟尾孢菌（Cercospora fraxinites）[14]，后者與本研究結(jié)果相似，本研究在健康葉中僅檢測到0.05%的尾孢菌屬，但尾孢菌屬在病葉中的相對豐度顯著上升，很可能為病原菌，但其致病性需要柯赫氏法則進(jìn)一步驗(yàn)證，后續(xù)可從病原菌分離及內(nèi)生細(xì)菌真菌的拮抗方向進(jìn)一步探究。

本研究結(jié)果可為水曲柳的微生物群落結(jié)構(gòu)提供一些理論的依據(jù)。隨著水曲柳需求量的日益增加，以及人工水曲柳林的逐漸增多，水曲柳褐斑病等重要病害的監(jiān)測和防治任務(wù)更加艱巨，因此東北地區(qū)如何實(shí)施有效的防治策略，還有待今后進(jìn)一步調(diào)查和研究。

4結(jié)論

健康及感染水曲柳褐斑病葉片的微生物多樣性如下。

1）不同染病程度葉片細(xì)菌多樣性及豐度無顯著差異，其中變形菌門和放線菌門為優(yōu)勢菌門；鞘氨醇單胞菌屬、醋酸桿菌屬和短根瘤菌屬等為主要優(yōu)勢屬。

2）3組樣品真菌多樣性及豐度有差異顯著，其中擔(dān)子菌門和子囊菌門為優(yōu)勢菌門，但染病前后相對豐度差異顯著；維希尼克氏酵母屬、殼針孢屬和漢納酵母屬等染病前后相對豐度差異顯著。

3）初步推測尾孢菌屬為病原菌。

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