胡 超，李琎杰，毛自欣，袁 波，劉塞納

（江西省檢驗檢測認證總院 食品檢驗檢測研究院，江西宜春 336000）

硒作為人體必需的微量元素之一，有多種免疫與生物學功能，尤其是預防心血管病、抗腫瘤、抗病毒性疾病及抗衰老等作用[1]。與無機硒化合物相比，有機硒化合物生物活性強、毒性低、吸收率高、污染小[2-4]，而且硒不能在人體內合成，必須通過食物中攝取。根據(jù)《中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量》，成人每天的硒攝入量應不少于50 μg[2]，而目前我國人均每日硒攝入量僅為26～32 μg，遠低于最低攝入量。因此，對食品中有機硒的含量檢測具有很大的研究意義。人體內的有機硒形式主要為硒蛋白和硒代氨基酸，硒代氨基酸主要形式為甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、硒代蛋氨酸（SeMet）、硒代半胱氨酸（Sec）[13]等。

近年來，富硒農業(yè)發(fā)展越來越快，農產(chǎn)品的硒含量得到廣泛的關注。因此，關于農產(chǎn)品硒含量的檢測也越來越重要。

根據(jù)現(xiàn)有的國家標準和文獻參考，有機硒檢測方法中，前處理提取方法有水提取法、酸提取法、酶解提取法和輔助提取法等[4]。主要針對香菇樣品中水提取法、酸提取法、酶解提取法[7]對甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、硒代蛋氨酸（SeMet）、硒代半胱氨酸（Sec） 的實際提取效果的分析和對比。檢測器的選擇有高效液相色譜法[10-12]、氣相色譜- 串聯(lián)質譜法[9]、毛細管電泳法等、氫化物發(fā)生- 原子熒光光譜法[8]和液相色譜- 電感耦合等離子質譜法（HPLC-ICP-MS）[6]。選擇超高效液相色譜串聯(lián)質譜法（HPLC-ESI-MS）的檢測方法研究。液相色譜串聯(lián)質譜法具有不易受干擾、重現(xiàn)性好、準確度高、靈敏度好等優(yōu)點[3-5]。該方法省去了繁瑣的前處理衍化過程，避免了其他離子干擾，節(jié)省了分離時間，可實現(xiàn)大批量多樣品的檢測，為探究農作物有機硒的檢測提供了一定的數(shù)據(jù)基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters Xevo TQD 型超高效液相色譜- 串聯(lián)質譜聯(lián)用儀（HPLC-ESI-MS） （三重四極桿），美國Waters 公司產(chǎn)品；XSE105DU 型十萬分之一電子天平，瑞士梅特勒托利多公司產(chǎn)品；KQ-400KDE 型超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；TGL-15B 型高速離心機，上海安亭科技儀器廠產(chǎn)品；SHA-CA 型水浴恒溫振蕩器，上海江星儀器廠產(chǎn)品。

甲基硒代半胱氨酸標準品、硒代蛋氨酸標準品、硒代半胱氨酸標準品（純度均為99.8%），蛋白酶（酶活力≥30 U/mg），甲醇（MS 純），甲酸（MS純），純凈水（娃哈哈）。

富硒香菇，購自當?shù)剞r貿市場。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制

分別準確稱取甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸標準溶液5.0 mg，于100 mL 棕色容量瓶中，用水定容。配成質量濃度均為50 μg/mL 的混合標準液，取1.0 mL 儲備液至50 mL 棕色容量瓶，水定容，配成質量濃度1.0 μg/mL 的混合標準儲備液。分別移取混合標準儲備液0.001，0.005，0.010，0.050，0.100，0.200 mL 于10 mL 棕色容量瓶，用空白基質配制成質量濃度為0.2，0.5，1.0，5.0，10.0，20.0 ng/mL 的標準系列工作液。

1.2.2 提取方法的選擇

（1） 水提取法。香菇樣品經(jīng)粉碎機粉碎，準確稱取2.0 g 于50 mL 離心管，加15ml 超純水，渦旋混勻，于60 ℃水浴條件下超聲提取1 h，在60 ℃水浴振蕩提取24 h，以轉速8 000 r/min 離心10 min，上清液移至25 mL 棕色容量瓶，殘渣加8 mL 超純水，超聲提取30 min，以轉速8 000 r/min 離心10 min，合并上清液，加超純水定容，混勻，過0.22 μm（PES） 濾膜，供HPLC-ESI-MS 上機檢測分析，采用外標定量法檢測甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸。

（2） 酸提取法。香菇樣品經(jīng)粉碎機粉碎，準確稱取2.0 g 于50 mL 離心管，加6.0 mol/L 的HCl 溶液5 mL 于60 ℃水浴條件下超聲提取1 h，于60 ℃水浴中振蕩提取24 h，冷卻，以轉速8 000 r/min 離心10 min，取上清液2.0 mL 置于10 mL 棕色容量瓶，加超純水定容，混勻，過0.22 μm（PES） 濾膜，供HPLC-ESI-MS 上機檢測分析，采用外標定量法檢測甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸。

（3） 酶解提取法。香菇樣品經(jīng)粉碎機粉碎，準確稱取2.0 g 置于50 mL 離心管，加入20 mg 蛋白酶，加入濃度為0.2 mol/L 的抗壞血酸溶液0.25 mL，加Tris-HCl 緩沖液（10 mol/L） 4.75 mL，漩渦30 s，于37 ℃水浴條件下以轉速120 r/min 振蕩20 h，避光。于60 ℃水浴超聲波提取40 min，降至常溫，以轉速8 000 r/min 離心10 min，取上清液2.0 mL 置于10 mL 棕色容量瓶，用0.1%甲酸水定容，混勻，通過注射器過0.22 μm（PES） 濾膜，供HPLC-ESI-MS 上機檢測分析，采用外標定量法檢測甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸。

1.2.3 儀器條件

（1） 液相色譜- 質譜條件。色譜柱：Agilent ZORBAXSB-AQ 型，柱長100 mm，內徑3.0 mm，粒徑1.8 μm，進樣量5.0 μL，流速0.25 mL/min，柱溫40 ℃；流動相：A 相0.1%甲酸溶液；B 相甲醇。

梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

（2） 質譜參考條件。電噴霧離子源，正離子掃描，多反應監(jiān)測，毛細管電壓3.0 kV，脫溶劑氣溫度550 ℃，脫溶劑氣流量1 000 L/H，錐孔氣流量50 L/H；噴霧電壓、離子源溫度、脫溶劑溫度和氮氣流速等參數(shù)應優(yōu)化至最優(yōu)靈敏度。

定性離子對、定量離子對和碰撞能量見表2。

表2 定性離子對、定量離子對和碰撞能量

2 結果與分析

2.1 樣品檢測結果

取同一樣品，同時用3 種不同提取方法處理，通過HLPC-MS 的質譜檢測，標準曲線質量濃度為0.2～20.0 ng/mL，所得檢測結果如下。

香菇樣品中3 種硒代氨基酸的測定見表3，甲基硒代半胱氨酸MRM 譜圖見圖1，硒代蛋氨酸MRM譜圖見圖2，硒代半胱氨酸MRM譜圖見圖3，HPLCESI-MS 法檢測3 種硒代氨基酸的回歸方程、相關系數(shù)和檢出限見表4。

圖1 甲基硒代半胱氨酸MRM 譜圖

圖2 硒代蛋氨酸MRM 譜圖

圖3 硒代半胱氨酸MRM 譜圖

表3 香菇樣品中3 種硒代氨基酸的測定

表4 HPLC-ESI-MS 法檢測3 種硒代氨基酸的回歸方程、相關系數(shù)和檢出限

2.2 重復性試驗

針對試驗中的儀器HPLC-ESI-MS 和樣品前處理分別進行重復性試驗。儀器重復性試驗中，以質量濃度15 ng/mL 標液進樣6 次，保持其余條件不變，得出此質量濃度下平均峰面積和相對標準偏差（RSD）。

前處理重復性試驗中，采用酶解提取法對同一樣品連續(xù)處理6 次，在同樣的儀器條件下檢測結果，得出平均峰面積和相對標準偏差（RSD）。

HPLC-ESI-MS 儀器和前處理重現(xiàn)性見表5。

表5 HPLC-ESI-MS 儀器和前處理重現(xiàn)性

由表5 可知，3 種氨基酸RSD 值均≤5%，說明儀器方法和前處理方法重現(xiàn)性良好。

2.3 回收試驗

3 種硒代氨基酸加標回收率見表6。

表6 3 種硒代氨基酸加標回收率

對樣品進行不同質量濃度加標（0.05，0.25，0.50 mg/kg） 3 種硒代氨基酸混標，用酶解提取法做回收試驗。各樣品平行進樣2 次，外標法定量，計算3 個加標水平下3 種硒代氨基酸的回收率和相對標準偏差，得出平均回收率分別為92.3%，93.0%，92.4%；相對標準偏差分別為2.71%，2.14%，1.83%，說明該方法有較高準確度、重現(xiàn)性比較好、方法相對可靠。

3 結論

前處理提取方面，3 種硒代氨基酸在水提取法、酸提取法和酶解提取法的提取效率存在明顯差異。因為有機硒在植物中的存在形式比較復雜，主要有游離的氨基酸和蛋白質的形式存在。水提取法主要提取試樣中的游離氨基酸；酸提取法能夠酸解蛋白質，破壞氨基酸之間的肽鍵，解離出游離氨基酸，但是高濃度酸解蛋白質過程不可控，可能使蛋白質過度分解，破壞氨基酸之間的肽鍵，后續(xù)可做使用不同濃度酸和不同類型酸提取效果的對比試驗。酶解法能夠很好地分解蛋白質又不會破壞氨基酸結構，在3 種提取方法中對于提取植物中有機硒效果最有效，具有更高的專一性和更高提取率。酶解法提取耗時比較長，可能存在分解不完全的情況，后續(xù)可再進行比對試驗，比對不同酶解時長、不同溫度、不同蛋白酶及與纖維素酶搭配等的更佳提取方案。

檢測儀器選擇上，目前使用比較多的是柱前衍生液相色譜法、氣相色譜- 串聯(lián)質譜法、毛細管電泳法和液相色譜- 電感耦合等離子體質譜法等，選擇高效液相色譜串聯(lián)質譜法檢測具有靈敏度高、檢出限低、抗干擾性強、精密度高、簡潔快速等優(yōu)勢，可適用于大批量樣品檢測，為研究蔬菜中有機硒的檢測提供了一定的數(shù)據(jù)基礎。該方法的不足之處在于無法檢測樣品無機硒和總硒，因此對于硒的形態(tài)檢測方法還有待進一步的探索和完善。