李非平,劉玉良,王神飛,張夢(mèng)詩(shī),胡賢彪,安俊輝,王東輝,張名岳,侯 蓉,蔡開來

(成都大熊貓繁育研究基地四川省瀕危野生動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610081)

大熊貓(Ailuropoda melanoleuca)是中國(guó)特有的珍稀瀕危動(dòng)物.根據(jù)第四次全國(guó)大熊貓調(diào)查,全球野生大熊貓數(shù)量已達(dá)到1 864只,其中80%以上分布在四川.由于棲息地的縮小及破碎化,導(dǎo)致遺傳交流中斷,遺傳多樣性不斷缺失[1],經(jīng)過我國(guó)的不懈努力使得大熊貓的數(shù)量明顯上升,雖然國(guó)際自然保護(hù)聯(lián)盟已將這一標(biāo)志性物種從“瀕?！绷袨椤耙孜！?但是,大熊貓的保護(hù)仍需要持續(xù)努力,為了防止大熊貓重新面臨瀕危,我國(guó)已經(jīng)進(jìn)行了多方面的科學(xué)研究及管理工作.目前,大熊貓的研究主要集中在棲息地的分布[2]、腸道微生物[3]、疾病的預(yù)防和治療[4]及分類[5]等.本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功地從大熊貓的骨髓中分離了間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)[6],為大熊貓細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)的基礎(chǔ)研究提供了新的資源.

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)是存在于骨髓和身體大多數(shù)結(jié)締組織中的一類具有高度的自我更新能力的成體干細(xì)胞[7].因其來源豐富,在體外易分離和擴(kuò)增,低免疫源性,且不存在倫理問題,可用于同種異體移植等特性成為繼胚胎干細(xì)胞后備受關(guān)注的細(xì)胞.BM-MSCs 可分化成多種細(xì)胞,如成骨細(xì)胞[8]、軟骨細(xì)胞[9]、脂肪細(xì)胞[10]、神經(jīng)細(xì)胞[11]、心肌細(xì)胞[6]及肝細(xì)胞[12]等.同時(shí),BM-MSCs 還因其獨(dú)特的增殖分裂模式使外源基因易于導(dǎo)入和表達(dá)[13],可作為基因治療載體[14],在組織損傷修復(fù),如神經(jīng)系統(tǒng)損傷后再生修復(fù)[15]、自身免疫疾病治療[16]中有廣闊的應(yīng)用前景.

LIF 是白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)家族中的一個(gè)多效性細(xì)胞因子,是一種分子量介于38 kD～67 kD的分泌型糖蛋白.LIF的生物學(xué)活性主要有:(1)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和表型;(2)抑制脂蛋白脂酶活性,降低3T3-L1脂肪細(xì)胞對(duì)游離脂肪酸的攝取;(3)促進(jìn)骨的重吸收,這種作用可能是通過 LIF 刺激成骨細(xì)胞合成前列腺素所介導(dǎo)的;(4)誘導(dǎo)肝臟急性期蛋白的產(chǎn)生.同時(shí),Oskowit等通過miRNA干擾hBMSCs的LIF表達(dá)發(fā)現(xiàn),其成骨及成脂分化能力加強(qiáng)[17];體內(nèi) LIF 受體的缺失導(dǎo)致了胎兒骨組織和其他間葉組織分化異常則進(jìn)一步說明了 LIF 對(duì)維持 MSCs 功能的重要性.

然而,到目前為止LIF對(duì)大熊貓干細(xì)胞生長(zhǎng)及發(fā)育的調(diào)控作用還未有報(bào)道.因此,本研究擬通過構(gòu)建LIFRNAi 慢病毒 pLKO.1 puro-LIF-down無擾質(zhì)粒,以慢病毒感染的方式將其導(dǎo)入PDBM-MSCs 中,抑制LIF在PDBM-MSCs的表達(dá),進(jìn)而研究LIF抑制后對(duì)PDBM-MSCs生長(zhǎng)及干性的影響,為大熊貓干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及干性機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ).

1 材料方法

1.1 材料

low-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium (LG-DMEM 貨號(hào):3160083,美國(guó)Gibco);胎牛血清(FBS 貨號(hào):FSP500,美國(guó) Prime);basic fibroblast growth factor (bFGF,貨號(hào):PHG0026,美國(guó) Gibco);Anti-antibiotic (貨號(hào):15240052,美國(guó) Gibco);青鏈霉素 (貨號(hào):SV30010,美國(guó) HyClone);Phosphate-Buffered Saline (PBS,貨號(hào):C2012500BT,美國(guó) Gibco);TrypLE Express (貨號(hào):12604-013,美國(guó)Gibco);pLKO.1 puro載體 (貨號(hào):LM-1792,上海 LMAI Bio );DNA凝膠回收試劑盒 (貨號(hào):D0056,上海 碧云天);氨芐霉素 (貨號(hào):ST007,上海 碧云天);LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑 (貨號(hào):11668019,美國(guó) Thermo);嘌呤霉素 (貨號(hào): ST551,上海 碧云天 );Rneasy MiNi Kit(50) (貨號(hào):163050725,德國(guó)Qiagen );PrimeScript RT reagent Kit(貨號(hào):RR047A,日本TaKaRa);FastStart Essential DNA Green Master (貨號(hào):6402712001,瑞士Roche) .

1.2 大熊貓骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)

MSCs 的分離參照劉玉良等[6]對(duì)PDBM-MSCs的分離方法.在無菌條件下,切除死亡后的大熊貓的股骨和脛骨,剔除骨頭上的所有結(jié)締組織.剪開骨頭的兩端,用20 mL的注射器抽滿完全培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓至60 mm培養(yǎng)皿中.完全培養(yǎng)基成分:LG-DMEM,10% FBS,1×Anti-antibiotic,10 ng/mL bFGF.輕輕吹打所得細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,將細(xì)胞在37 ℃,5% CO2下孵育.4 h后,移除培養(yǎng)基,用PBS溶液沖洗3次,再加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)貼壁細(xì)胞5 d,每2 d換液1次.細(xì)胞達(dá)到80%融合,用TrypLE Express消化,以5×103/cm2的細(xì)胞密度進(jìn)行接種.

1.3 LIF RNAi 慢病毒載體的構(gòu)建包裝與轉(zhuǎn)染

1.3.1LIFRNAi 載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)3對(duì)大熊貓LIF基因靶點(diǎn)序列(siRNA1-3,如表1),并將其構(gòu)建到pLKO.1 puro慢病毒載體,載體中含有Puro 抗性和Amp 抗性,酶切位點(diǎn)選用AgeI和EcoRI,雙酶切后用 1% 瓊脂糖凝膠電泳分離,從膠上切取目的載體,使用膠回收試劑盒回收純化目的載體.siRNA 經(jīng)3′和5′的單鏈退火獲得shRNA后,與線性回收純化目的載體行連接反應(yīng)后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,在含氨芐霉素的LB平板37 ℃培養(yǎng)過夜篩選重組克隆.平板挑選克隆接種至LB培養(yǎng)基37 ℃ 250 r/min搖菌14 h,將菌液送擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序.

1.3.2 HEK293T 細(xì)胞病毒包裝及滴度檢測(cè)

HEK293T細(xì)胞融合率達(dá)到60%～70%進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染體系:100 mm 平板中,加入 10 μg 慢病毒表達(dá)載體,10 μg 慢病毒包裝質(zhì)粒,50 μL Lipofectamine2 000.4 h后除去含轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基,加入10 mL HEK293T新鮮培養(yǎng)基,37 ℃ 孵育48 h,收集含病毒顆粒的上清.4 ℃ 2 000×g離心10 min,除去細(xì)胞碎片.用 0.45 μm 濾器過濾收集上清.通過熒光顯微鏡應(yīng)用倍比稀釋法檢測(cè)病毒的滴度.

1.3.3 慢病毒轉(zhuǎn)染

將P2代 PDBM-MSCs 以 5×103/cm2的細(xì)胞密度接種于六孔板中,完全的培養(yǎng)基成分為 LG-DMEM,10% FBS,1×青鏈霉素,10 ng/mL bFGF,置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,分別加入3種 pLKO.1 puro-LIF-down 抑制表達(dá)慢病毒及陰性對(duì)照組pLKO.1-puro-Scramble,繼續(xù)培養(yǎng) 12 h 后更換新鮮培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后加入嘌呤霉素篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)染克隆.應(yīng)用 q-PCR 檢測(cè)LIFmRNA 表達(dá)水平.

1.4 q-PCR 檢測(cè)

選P2代PDBM-MSCs分別進(jìn)行pLKO.1 puro-LIF-down抑制表達(dá)慢病毒及陰性對(duì)照組pLKO.1-puro-Scramble感染72 h后的細(xì)胞,使用Rneasy MiNi Kit 提取總 RNA,方法參照試劑盒說明書進(jìn)行.PrimeScript RT reagent Kit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,方法參照廠商說明書.FastStart Essential DNA Green Master 檢測(cè)LIF、CDK2、CCNB2、CCND3、P53、P16、P27、Caspase3等基因在 mRNA 水平的表達(dá)量,方法參照廠商說明書.q-PCR循環(huán)95 ℃變性3 min,95 ℃ 10 s、58 ℃～60 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s,循環(huán) 40 次.用于擴(kuò)增的引物列于表 2 中.

表2 引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有結(jié)果均來自至少3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn).應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件 SPSS for Windows 13.0 t 檢驗(yàn)來確定差異顯著性.P<0.05 時(shí)為差異顯著.

2 結(jié)果

2.1 LIF RNAi 慢病毒重組質(zhì)粒構(gòu)建與篩選

DNA測(cè)序結(jié)果證明 3 個(gè)重組質(zhì)粒pLKO.1 puro-LIF-down中的目的片段均與預(yù)期的序列一致(圖 1),說明目的片段已成功克隆至慢病毒表達(dá)載體中.將重組質(zhì)粒pLKO.1 puro-LIF-down與空質(zhì)粒pLKO.1-puro-Scramble分別包裝至HEK293T細(xì)胞 48 h 后,分別對(duì)其病毒滴度進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pLKO.1 puro-LIF-down-1的病毒滴度為(1×106TU/mL),pLKO.1 puro-LIF-down-2的病毒滴度為(1.5×106TU/mL),pLKO.1 puro-LIF-down-3的病毒滴度為(0.9×106TU/mL),對(duì)照組空質(zhì)粒pLKO.1-puro-Scramble的病毒滴度為(3×106TU/mL).

圖1 重組質(zhì)粒 pLKO.1 puro-LIF-down 中的目的片段測(cè)序

2.2 LIF RNAi 慢病毒轉(zhuǎn)染 PDBM-MSCs

將 PDBM-MSCs 分別用重組質(zhì)粒 pLKO.1 puro-LIF-down 慢病毒與空質(zhì)粒 pLKO.1-puro-Scramble 慢病毒進(jìn)行感染,72 h 后空質(zhì)粒 pLKO.1-puro-Scramble 組細(xì)胞增殖融合至 80%～90%,呈旋渦狀或簇狀有序排列(圖2-A),而LIF抑制組細(xì)胞增殖融合至 60%～70%,細(xì)胞排列不規(guī)則(圖2-A).采用 q-PCR 的方法檢測(cè) pLKO.1 puro-LIF-down 慢病毒對(duì) PDBM-MSCs 中LIF的抑制效果,結(jié)果顯示感染 3 種慢病毒后 PDBM-MSCs 的LIF在 mRNA 水平上的表達(dá)量相對(duì)于空質(zhì)粒 pLKO.1-puro-Scramble 慢病毒均顯著降低(圖2-B),但是相比于 pLKO.1 puro-LIF-down-2(0.80±0.02)、pLKO.1 puro-LIF-down-3(0.74±0.17)的抑制作用 pLKO.1 puro-LIF-down-1(0.55±0.03)抑制效果更為顯著(圖2-B),因此本實(shí)驗(yàn)后期均采用 pLKO.1 puro-LIF-down-1 慢病毒作為實(shí)驗(yàn)材料.

(A)LIF抑制慢病毒感染后72 h后PDBM-MSCs生長(zhǎng)狀態(tài)(200×);(B)抑制慢病毒感染后PDBM-MSCs的LIF在mRNA水平上的相對(duì)表達(dá)量

2.3 LIF 抑制后對(duì) PDBM-MSCs 生長(zhǎng)影響

將PDBM-MSCs分別用重組質(zhì)粒pLKO.1 puro-LIF-down-1慢病毒與空質(zhì)粒pLKO.1-puro-Scramble慢病毒進(jìn)行感染,72 h后觀察空質(zhì)粒組細(xì)胞融合率達(dá)明顯高于LIF抑制組細(xì)胞.用q-PCR的方法對(duì)LIF抑制后PDBM-MSCs關(guān)鍵周期基因檢測(cè)顯示CDK2(P=0.028 2)、CCNB2(P=0.000 1)及CCND3(P=0.008 4)等促周期基因在mRNA水平上顯著下調(diào),而CCNYL1 也呈下降趨勢(shì)(圖3-A).同時(shí)對(duì)凋亡分子P53(P=0.001 8)、P16(P=0.000 1)、P27(P<0.000 1)、Caspase3(P=0.002 7)等進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果顯示這些分子均在mRNA水平上顯著提高(圖3-B).表明LIF抑制能夠顯著的抑制PDBM-MSCs周期,同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡.

(A)LIF抑制慢病毒感染后PDBM-MSCs周期基因的表達(dá)情況;(B)LIF抑制慢病毒感染后PDBM-MSCs凋亡基因的表達(dá)情況

2.4 LIF抑制后對(duì)PDBM-MSCs干性影響

為了研究LIF對(duì)PDBM-MSCs的干性是否產(chǎn)生影響,細(xì)胞同上述處理后,對(duì)PDBM-MSCs的干性分子表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),LIF抑制后PDBM-MSCs的干性分子KLF4(P=0.009 8)、SOX2(P<0.000 1)在mRNA水平上顯著下調(diào)(圖4),表明LIF對(duì) PDBM-MSCs 的干性起到維持作用.

圖4 LIF 抑制后 PDBM-MSCs 干性基因的表達(dá)情況

3 討論

MSCs 具有跨系譜,甚至跨胚層分化的潛能,可分化成多種組織細(xì)胞[18].研究發(fā)現(xiàn),MSCs 具有去分化和跨胚層轉(zhuǎn)分化能力,且在這種轉(zhuǎn)分化過程中,MSCs 分化的是首先進(jìn)行去分化,回到原始狀態(tài)再轉(zhuǎn)分化為其他組織.而 BM-MSCs 由于具有強(qiáng)大的增殖能力和跨胚層分化潛能的同時(shí)也具有免疫調(diào)節(jié)功能等特性,在細(xì)胞治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值,是研究大熊貓等珍貴野生動(dòng)物干細(xì)胞的寶貴資源.本研究篩選所得LIF表達(dá)抑制的 MSCs 為進(jìn)一步研究大熊貓干細(xì)胞分化機(jī)制提供了數(shù)據(jù)及材料支撐.

LIF 是一種多效性細(xì)胞因子,具有廣泛的活性,其功能性受體存在于多種器官中,包括肝[19]、骨[20]、子宮[21]、腎和中樞神經(jīng)系統(tǒng)[22]等.研究發(fā)現(xiàn) LIF 在小鼠胚胎干細(xì)胞中起到抑制分化保持在全能狀態(tài)的作用,并能夠有效地促進(jìn)其自我更新[23];Harris 等研究表明 LIF具有促進(jìn)牛成纖維細(xì)胞重編程為多能干細(xì)胞的潛力,也證實(shí)了其在牛多能干細(xì)胞分離培養(yǎng)以及建系上的潛力[24];Oskowitz 等研究證明 LIF對(duì)維持 MSCs 功能具有重要作用,如維持 MSCs 的干性抑制成脂肪、成骨的分化[17],以上結(jié)果表明 LIF 是維持細(xì)胞干性的重要調(diào)控分子.本研究采取 RNAi 干擾的方式降低了PDBM-MSCs 的LIFmRNA 的表達(dá)水平,同時(shí)定量檢測(cè)結(jié)果顯示 BM-MSCs 的干性標(biāo)記基因KLF4、SOX2 的表達(dá)量伴隨著LIF的下調(diào)呈現(xiàn)出顯著下調(diào)趨勢(shì).說明本研究所得LIF抑制后 BM-MSCs 的干性下降這一結(jié)果與前人的研究相一致.同時(shí) Jiang 等發(fā)現(xiàn)LIF對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)起促進(jìn)作用[25],同樣在本次研究過程中發(fā)現(xiàn),降低 BM-MSCs 的LIF表達(dá)水平后,相關(guān)周期調(diào)控基因CDK2、CCNB2、CCND3 顯著下調(diào),關(guān)鍵凋亡基因P53、P16、P27、caspase3 的表達(dá)顯著上調(diào),也證實(shí)了LIF對(duì)大熊貓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)起促進(jìn)作用,這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果也是一致的.進(jìn)一步證明本研究構(gòu)建的大熊貓LIFRNAi 質(zhì)粒在 BM-MSCs 表達(dá)是成功的.

通過 q-PCR 的方法檢測(cè)LIF在 RNA 水平上的變化,結(jié)果顯示與空質(zhì)粒 pLKO.1-puro-Scramble 對(duì)照組相比感染重組質(zhì)粒 pLKO.1 puro-LIF-down-1 后PDBM-MSCs 的LIF在 RNA 水平上顯著下調(diào).與小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞[26]LIF干擾效率相比,此次對(duì) PDBM-MSCs 進(jìn)行LIF干擾后其干擾效率較低,這可能是干擾位點(diǎn)、條件及方式不合適造成的,還需繼續(xù)探索.然而,感染重組質(zhì)粒 pLKO.1 puro-LIF-down-1 病毒的細(xì)胞與空質(zhì)粒 pLKO.1-puro-Scramble 對(duì)照組相比也表現(xiàn)出生長(zhǎng)被抑制以及干性下降的趨勢(shì),這說明該LIF抑制載體已經(jīng)發(fā)揮了其生物學(xué)功能.本次研究由于沒有針對(duì)大熊貓的抗體,因此我們只能選取抗人或大鼠的 LIF 抗體進(jìn)行 Western Blot 蛋白分析,但是無論是抗人或大鼠的抗體都未檢測(cè)出陽(yáng)性特異結(jié)合(數(shù)據(jù)未給出),這可能是由于PDBM-MSCs 中 LIF 的肽段同源性與人或大鼠相差較大,因此開發(fā)大熊貓?zhí)禺惖?LIF 抗體進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)結(jié)果是我們下一步研究所必須的.

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了大熊貓的LIFRNAi 慢病毒載體,通過感染的方式成功轉(zhuǎn)入PDBM-MSCs 中.經(jīng)試驗(yàn)證明大熊貓LIF對(duì) BM-MSCs 的生長(zhǎng)及干性均起到調(diào)節(jié)的作用,為L(zhǎng)IF在大熊貓干細(xì)胞中的功能研究提供了一定的技術(shù)及理論支撐.然而,LIF在大熊貓干細(xì)胞生長(zhǎng)、分化過程中所涉及的具體調(diào)控機(jī)制目前尚不明確,還需進(jìn)一步進(jìn)行研究.