雙?？鼓[瘤光敏劑二氫卟吩e6-偕氟尿嘧啶的合成和生物活性

沈 潔，黃 飛，張星杰，姚建忠 （.江蘇省昆山市第一人民醫(yī)院, 江蘇 昆山 5300；.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系, 上海 00433）

光動力治療（PDT）基于光輻照聚集光敏劑的腫瘤組織，由光敏劑誘發(fā)光動力反應(yīng)形成單線態(tài)氧（1O2）等活性氧（ROS），通過對腫瘤細胞和腫瘤血管的直接殺傷及激活機體系統(tǒng)免疫反應(yīng)等多種機制發(fā)揮抗腫瘤作用[1-3]。二氫卟吩及菌綠素類光敏劑是PDT 新藥研究的熱點[4-8]。其中，已獲批上市的代表藥物有他拉泊芬（talaporfin）和帕利泊芬（padeliporfin）等[9,10]。

光敏劑作為結(jié)構(gòu)非特異性藥物，存在缺乏腫瘤靶向性攝入和明確的作用藥靶等缺陷。此外，PDT受制于局部治療，對浸潤較深的腫瘤組織，及已發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤療效有限。目前，PDT 和化療聯(lián)用是克服上述缺陷，提高PDT 療效最為普遍和有效的策略之一。研究表明，抗代謝化療藥物氟尿嘧啶（5-Fu）與PDT 聯(lián)用具有協(xié)同抗腫瘤作用[11-13]。據(jù)此，我們設(shè)想利用在腫瘤微環(huán)境下能響應(yīng)性斷裂的連接基團（linker）將光敏劑與化療藥物偶聯(lián)，希望實現(xiàn)二者在腫瘤組織的靶向釋放，從而發(fā)揮其PDT 和化療協(xié)同抗腫瘤作用。酰腙鍵是酸敏感化學(xué)鍵，常被用來連接載體，以藥物制備智能藥物載體。這種藥物載體到達腫瘤細胞的內(nèi)涵體或溶酶體中時，會發(fā)生酸性水解將藥物有效釋放出來。因此，本文針對腫瘤微環(huán)境呈弱酸性的特點，采用藥物化學(xué)最經(jīng)典的前藥設(shè)計策略，以脫鎂葉綠素a（Phephorbide a）粗提物經(jīng)酸堿降解制得的二氫卟吩e6（3）[14]為先導(dǎo)光敏劑，通過其152-羧基與抗腫瘤藥物5-Fu 以酸敏感酰腙鍵連接，設(shè)計合成pH 響應(yīng)型光化療協(xié)同抗腫瘤光敏劑二氫卟吩e6-偕氟尿嘧啶（1），并考察其體外PDT 抗腫瘤活性和pH 響應(yīng)性5-Fu 釋放，及其對黑色素瘤B16-F10 和肝癌HepG2 細胞的光動力抗癌活性及其作用機制，以期獲得高效、低毒的PDT 治癌藥物候選藥物，合成路線見圖1。

圖1 二氫卟吩e6 -偕氟尿嘧啶光敏劑(1)的合成路線

1 化學(xué)合成

1.1 儀器與試劑

用Bruker MSL-600 型核磁共振儀測定1H NMR，CD3OD 為溶劑；用API-3 000 LC-MS 型電噴霧質(zhì)譜儀測定質(zhì)譜（ESI-MS）；用島津UV-160 型紫外分光光度計測定UV 吸收譜；用日立F-7 000 熒光分光光度計測定熒光發(fā)射譜；用Shimazu LC-20AD HPLC 儀測定化合物1 的相對純度及其5-Fu 的體外釋放。色譜柱型號為Waters Xterra C18柱，流動相：乙腈-0.3%乙酸水溶液（80 : 20）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：400 nm（化合物1 的相對純度）或254 nm（5-Fu 釋放）；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μl。柱色譜分離用TELEDYNE ISCO 的快速制備色譜Combi Flash@Rf+儀，硅膠H 作為固定相。PDT 抗癌活性測試使用BWT 半導(dǎo)體激光儀（北京凱普林，波長為660 nm）；用流式細胞儀（BD Accuri C6，美國）（激發(fā)波長：488 nm，發(fā)射波長：525 nm）檢測受試腫瘤細胞樣品的ROS 水平、細胞凋亡率和細胞周期阻滯。

圖2 化合物1 甲醇液(10 μmol/L)的紫外吸收譜和熒光發(fā)射譜(λEx=400 nm)

二氫卟吩e6（3）按照文獻[14]的方法制備；其它實驗用材料和化學(xué)試劑均為市售商品。

1.2 42-N-(二氫卟吩 e6-152-?；?-5-氟尿嘧啶-4-腙（1）的合成

取氟尿嘧啶（0.2 g，1.563 mmol）溶于無水吡啶（10 ml），加入五硫化二磷（0.298 g，1.563 mmol），加熱回流12 h。反應(yīng)完畢，減壓回收溶劑，殘物加乙酸乙酯溶解（100 ml），用0.1 mol/L HCl 洗滌（50 ml×2），無水Na2SO4干燥，減壓除去溶劑得4-硫代-5-氟尿嘧啶粗品。上述4-硫代-5-氟尿嘧啶粗品加甲醇（10 ml）溶解，于0 ℃下滴加N2H4·H2O（0.316 g，6.252 mmol），室溫繼續(xù)攪拌2 h。反應(yīng)完畢，減壓抽濾，P2O5真空干燥得固體化合物5-氟尿嘧啶-4-腙（2）中間體，直接用于下步反應(yīng)。取二氫卟吩e6（0.1 g，0.168 mmol）溶于無水DMF（10 ml），加1-乙基-（3-二甲氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）（0.035 g，0.183 mmol），室溫攪拌反應(yīng)6 h 后再加入中間體2（0.031 g，0.218 mmol），繼續(xù)攪拌36 h。反應(yīng)完畢，反應(yīng)液加入10 倍體積量乙酸乙酯，飽和NaCl 水溶液洗滌（50 ml×3），無水Na2SO4干燥，減壓回收溶劑所得固體經(jīng)快速制備色譜梯度洗脫分離純化（流動相為二氯甲烷/甲醇/甲酸=15∶1∶0.1～8∶1∶0.1）得黑色固體1 純品0.048 g，產(chǎn)率39.6%。UV-vis λmax(MeOH, nm) (ε, M-1cm-1)：660(3.15×104), 510 (0.82×104), 402 (8.13×104)。1HNMR (600 MHz, CD3OD, δ, ppm): 9.79 (s, 1H, 10-CH),9.73 (s, 1H, 5-CH), 9.07 (s, 1H, 20-CH), 8.19 (dd,J=18.0, 12.0 Hz, 1H, 31-CH), 7.29 (s, 1H, 5-Fu 的6-CH),6.38 (d,J= 18.0 Hz, 1H, 32-CHB), 6.15 (d,J= 12.0 Hz,1H, 32-CHA), 5.35 (s, 2H, 151-CH2), 4.65 (m, 2H, 17-CH和18-CH), 3.84 (q,J= 7.5 Hz, 2H, 81-CH2), 3.63 (s,3H, 12-CH3), 3.53 (s, 3H, 2-CH3), 3.30 (s, 3H, 7-CH3),2.3～2.0 (m,4H , 171-CH2和172-CH2), 1.76 (m, 6H?18-CH3和82-CH3)。MS (ESI+)m/z: 723.63 (M+H)+(100%)。元素分析（C38H39N8O6F，%）計算值：C 63.16, H 5.40, N 15.48；實測值：C 63.34, H 5.38, N 15.43。HPLC 測定純度：95.2%。

2 體外光理化性質(zhì)和光生物活性

2.1 化合物1 的紫外吸收譜和熒光發(fā)射譜

分別測定目標(biāo)化合物1 及其先導(dǎo)化合物二氫卟吩e6（3）的甲醇溶液（10 μmol/L）在300～800 nm處的紫外吸收譜和激發(fā)波長為400 nm 的熒光發(fā)射光譜，結(jié)果見圖2。

2.2 化合物1 的體外pH 響應(yīng)性5-Fu 釋放

分別配制濃度為50 μmol/L 的化合物1 的HOAc-NaOAc 緩沖液（pH 5.0）和PBS 溶液（10 ml），并于0.5、1.0、3.0、6.0、12、24 h 時分別取樣（500 μl）。其中，HOAc-NaOAc 緩沖液（pH 5.0）組取樣液用0.1 mol/L 氫氧化鈉水溶液迅速調(diào)節(jié)pH 值至7.4。每份取樣液加PBS 稀釋至原溶液1/3 濃度，微孔濾膜（孔徑0.22 μm）過濾，HPLC 進樣檢測；實驗重復(fù)3 次。根據(jù)5-Fu 的HPLC 峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線分析計算，繪制目標(biāo)化合物1 于弱酸（pH 5.0）中的5-Fu體外釋放量-時間曲線，結(jié)果見圖3。

圖3 化合物1 的體外pH 響應(yīng)性5-Fu 累積釋放量-時間曲線(n=3)

2.3 化合物1 的體外光動力抗癌活性

2.3.1 細胞孵育

參照文獻[6-8]的方法進行。

2.3.2 細胞暗毒性測試

參照文獻[6-8]的方法，每孔5×103個B16-F10細胞或HepG2 細胞懸液（100 μl）接種于96 孔板上，加入等體積上述細胞培養(yǎng)液孵育24 h；更換含不同濃度待測物的培養(yǎng)液（DMSO 濃度小于1%，100 μl），繼續(xù)避光孵育48 h；再更換含10%（V/V）CCK-8（Beyotime，中國）的RPMI 1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（100 μl），繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，然后用Varioskan Flash 全波長酶標(biāo)儀（Thermo）于波長450 nm 處測定每孔的吸光度值，計算各濃度對應(yīng)的細胞存活率，并擬合得到待測物的腫瘤細胞半數(shù)抑制濃度即IC50值。

2.3.3 細胞光毒性測試

每孔5×103個B16-F10 細胞或HepG2 細胞懸液（100 μl）接種于96 孔板上，加入等體積細胞培養(yǎng)液孵育24 h；更換含不同濃度待測物的細胞培養(yǎng)液（DMSO 濃度小于1%，100 μl），繼續(xù)避光孵育24 h；再更換新鮮培養(yǎng)液（100 μl），以波長為660 nm 的激光輻照受試細胞樣品（光照劑量為10 J/cm2），繼續(xù)孵育24 h。最后按“2.3.2”項下CCK-8 法測定各待測物的腫瘤細胞IC50值。

2.3.4 實驗結(jié)果

以臨床光敏藥物他拉泊芬為陽性對照，化合物1 及其先導(dǎo)化合物3 對腫瘤細胞株的體外PDT抗癌活性結(jié)果見表1。

表1 目標(biāo)化合物1 的體外光動力抗癌活性(IC50，μmol/L)

2.4 化合物1 介導(dǎo)的PDT 對腫瘤細胞內(nèi)ROS 水平的影響

操作步驟如下：a.每孔3 × 105個B16-F10 細胞懸液（2 ml）接種6 孔板上，按“2.3.1”項條件避光孵育24 h；b.分別更換含一定濃度化合物1 或他拉泊芬的新鮮培養(yǎng)液（DMSO 濃度小于1%，2 ml），繼續(xù)避光孵育24 h；c.加入10 mmol/L DCFH-DA ROS 熒光檢測探針（Beyotime，1.5 μl），吹打混勻，繼續(xù)避光孵育20 min；d.PBS 洗滌3 次，再加新鮮培養(yǎng)液（2 ml），以660 nm 波長的激光輻照（光劑量10 J/cm2）細胞樣品，繼續(xù)避光孵育20 min；e.收集每孔細胞樣品，用流式細胞儀檢測各孔細胞ROS水平，結(jié)果見圖4。

圖4 目標(biāo)化合物1 誘導(dǎo)B16-F10 細胞產(chǎn)生活性氧的水平

2.5 化合物1 介導(dǎo)的PDT 對腫瘤細胞凋亡的影響

按“2.4”項下操作方法，僅從步驟c 開始，更換新鮮培養(yǎng)液（2 ml），用660 nm 波長的激光輻照（光劑量10 J/cm2）細胞樣品，繼續(xù)避光孵育20 min；d.以1 500 r/min 離心（5 min）細胞樣品，PBS 洗滌，再以1 000 r/min 離心（5 min）后獲取細胞樣品；e.按Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒（Beyotime）操作流程操作，結(jié)果見圖5。

圖5 目標(biāo)化合物1 誘導(dǎo)B16-F10 細胞凋亡*P<0.05，與10 J/cm2 比較。

2.6 化合物1 介導(dǎo)的PDT 對腫瘤細胞周期的阻滯作用

按“2.5”項下操作方法，僅在e 步驟中，換以細胞周期阻滯檢測試劑盒（Beyotime）的操作流程，每份細胞樣品中分別加入染色緩沖液（300 μl）、RNase A（6 μl）和碘化丙啶染色液（15 μl），輕輕混勻，避光孵育20 min 后，用流式細胞儀進行細胞周期阻滯檢測，結(jié)果見圖6。

圖6 目標(biāo)化合物1 對B16-F10 細胞周期的阻滯作用

3 結(jié)果與討論

按文獻[14]方法制得的二氫卟吩e6（3）為先導(dǎo)化合物，經(jīng)1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）于無水DMF 中催化分子內(nèi)脫水縮合制得二氫卟吩e6-131,152-酸酐活潑中間體[15]，然后直接與中間體2 發(fā)生酰化反應(yīng)成功合成得到了光化療雙?？鼓[瘤光敏劑二氫卟吩e6-偕氟尿嘧啶（1），反應(yīng)收率達39.6%，其結(jié)構(gòu)經(jīng)UV、ESI-MS、1H NMR及元素分析確證。

化合物1 在甲醇中最大紫外吸收波長和熒光發(fā)射波長（激發(fā)波長：400 nm）分別為660 nm 和670 nm，與先導(dǎo)物3 相一致，表明先導(dǎo)物3 以酰腙鍵偶聯(lián)5-Fu 后，并沒有改變其作為光敏劑特有的紫外吸收和熒光發(fā)射光譜等光物理特性。此外，化合物1 在弱酸（pH 5.0）條件下，能有效釋放5-Fu，24 h內(nèi)累積釋放率可達60.3%；但在pH 7.4 的條件下較為穩(wěn)定，24 h 內(nèi)5-Fu 累積釋放率僅為5%。

體外PDT 抗癌活性測試結(jié)果顯示，化合物1對B16-F10 和HepG2 細胞株的光毒活性和暗毒/光毒比（治療指數(shù)）均顯著優(yōu)于先導(dǎo)物二氫卟吩e6（3）（P<0.005）和他拉卟吩（P<0.001），其IC50值分別達0.73 μmol/L 和0.90 μmol/L。

體外PDT 抗癌機制研究提示，化合物1 介導(dǎo)的PDT 能顯著提升B16-F10 細胞內(nèi)ROS 水平和誘導(dǎo)B16-F10 細胞凋亡，并阻滯腫瘤細胞周期于S 期。

總之，二氫卟吩e6-偕氟尿嘧啶（1）具有PDT抗癌活性強、治療指數(shù)（暗毒/光毒比）高且可在腫瘤弱酸環(huán)境中有效釋放5-Fu 等優(yōu)點，從而實現(xiàn)“單分子”光化療協(xié)同抗腫瘤作用，值得進一步開發(fā)研究。