地皮菜水應(yīng)激蛋白的研究進展

陳曉霞,路曉慶,張桓虎

(1. 山西醫(yī)科大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院,山西 太原 030001;2. 山西省腫瘤醫(yī)院,山西 太原 030001)

普通念珠藻(圖1)俗稱地皮菜[1],屬于藍藻門念珠藻屬[2],在全國各地均有所分布,因其豐富的營養(yǎng)價值和特殊的生物活性,而具有重要的藥用價值[3]。地皮菜中重要的組成部分水應(yīng)激蛋白,屬于酸性多肽,等電點(PI)位于4.3～4.8[4-5]。目前,水應(yīng)激蛋白已被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于念珠藻屬中,但其在地皮菜中的含量更為豐富,其中,細胞外基質(zhì)總蛋白量可達83.6%[6]。水應(yīng)激蛋白的一些生物學(xué)活性,包括抗輻射、抗干旱和抗瘤性等都顯示其具有重要的研究價值[7]。

圖1 野生的念珠藻[1]Fig.1 Wild N. commune vauch[1]

1 水應(yīng)激蛋白的來源

地皮菜由細胞細絲和大量細胞外基質(zhì)組成,水應(yīng)激蛋白則是地皮菜細胞外基質(zhì)的特征性成分[8],對于維持細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能具有重要作用[9],可通過基因表達及蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生。這些具有異質(zhì)性,在基因型中具有高度的多樣化,所表達的一系列蛋白被統(tǒng)稱為水應(yīng)激蛋白[8]。其經(jīng)胞內(nèi)降解和修飾后,相對分子量大小各異。Sokamoto等[10]報道稱:水應(yīng)激蛋白是1個單拷貝基因,由1個單順反子的操縱子調(diào)控,其各種亞型可能是由于脫酰胺、共價修飾或者是由蛋白酶水解構(gòu)成。

2 水應(yīng)激蛋白的結(jié)構(gòu)

目前,關(guān)于水應(yīng)激蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)尚未明確。同源建模作為一種模擬蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的常規(guī)技術(shù),具有很強的權(quán)威性[11]。而蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)(SWISS-MODEL)是目前最具有權(quán)威性的系統(tǒng)[12-13]。根據(jù)已知的水應(yīng)激蛋白基因片段,使用SWISS-MODEL對水應(yīng)激蛋白的3D結(jié)構(gòu)進行了預(yù)測,結(jié)果見圖2。其具體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的測定還需要依賴核磁共振和X線晶體學(xué)等技術(shù)的輔助驗證。蛋白結(jié)合位點仍需要借助肺通氣功能(PFT)成像功能化探針等技術(shù)進一步確定,以期尋找出特異性識別位點[14]。

圖2 水應(yīng)激蛋白的3D預(yù)測結(jié)構(gòu)Fig.2 3D predictive structure of N. commune vauch

3 水應(yīng)激蛋白的制備

3.1 水應(yīng)激蛋白的提取和分離

目前對地皮菜的研究多集中于水應(yīng)激蛋白的活性功能方面,運用合適的手段從地皮菜中提取分離出高質(zhì)量的水應(yīng)激蛋白具有重要的理論和現(xiàn)實意義。目前,主要通過水提法、鹽提法和酸提法等方式提取植物蛋白[15]。由于水應(yīng)激蛋白在干燥念珠藻中的含量較為豐富,因此,可采用生物化學(xué)手段,如:丙酮硫酸銨沉淀法[16-17]。該方法簡單快捷,能有效提取水應(yīng)激蛋白[18]。但仍存在一些問題,例如:分離不充分時,會導(dǎo)致雜質(zhì)混于樣品中。另外,較長時間的樣品浸泡,會影響丙酮對水應(yīng)激蛋白的修飾。針對上述問題,應(yīng)繼續(xù)研究相關(guān)的水應(yīng)激蛋白提取、分離方法,以期尋找出更合適的提取方案,來增加提取純度,為水應(yīng)激蛋白的深度提純和開發(fā)創(chuàng)造條件。

3.2 水應(yīng)激蛋白的誘導(dǎo)表達

除了物理方法外,也可通過基因重組技術(shù)誘導(dǎo)原核系統(tǒng)對水應(yīng)激蛋白進行大量表達[19]?？紤]到遺傳學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等方面,大腸桿菌已成為眾多異源蛋白質(zhì)的首選表達系統(tǒng)[20]。

目前,學(xué)者們通過對表達與純化條件的不斷優(yōu)化,成功獲得了具有生物活性的水應(yīng)激蛋白[17],為其開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)。此外,進一步的截短優(yōu)化,成功獲取到了免疫反應(yīng)小、安全性高的活性肽,并明確了截斷體活性片段的生物活性[17],也為研究水應(yīng)激蛋白各保守結(jié)構(gòu),細化各結(jié)構(gòu)域的生物活性創(chuàng)造了條件[21]。

4 水應(yīng)激蛋白的生物活性

4.1 抗干旱作用

干旱脅迫是導(dǎo)致作物減產(chǎn)的重要環(huán)境因素[22]。植物可感知缺水信號,并啟動應(yīng)對策略的能力被定義為抗旱能力[23]。地皮菜在干旱或濕潤的環(huán)境中都具有很強的適應(yīng)能力。在干旱過程中,能處于一種“靜息”狀態(tài),降低生存活動,此過程可長達100年[24]。而當水源充足時,便會迅速恢復(fù)其原有的生存能力,重新進行呼吸及光合作用[25]。早在20世紀80年代,學(xué)者們已經(jīng)在結(jié)構(gòu)、生理和生化水平上對地皮菜的干燥耐受性進行了研究[26]。Ye等[27]報道了水應(yīng)激蛋白在藍藻類生物抵抗干旱環(huán)境中起到的關(guān)鍵作用。Scherer等[28]研究發(fā)現(xiàn):當菌落經(jīng)受干燥和再水化的重復(fù)循環(huán)時,地皮菜會積累一組新的酸性蛋白質(zhì),即為水應(yīng)激蛋白;其經(jīng)由再水化后,分泌到細胞外多糖鞘中,以維持基質(zhì)的保護作用,為細胞提供生存保護[6,29]?？傊?水應(yīng)激蛋白在地皮菜遭遇環(huán)境脅迫,特別是在干旱時,發(fā)揮著重要作用,即水應(yīng)激蛋白可能是一種具有細胞應(yīng)激抗性的蛋白。

4.2 抗輻射作用

地皮菜可適應(yīng)具有高水平輻射的環(huán)境[10]。在黑暗條件下進行培養(yǎng),會造成水應(yīng)激蛋白的缺失,而紫外線會影響水應(yīng)激蛋白mRNA的擴增,導(dǎo)致水應(yīng)激蛋白分泌增加,使擴增比例最高可達4倍[30]。由此說明:水應(yīng)激蛋白在抗輻射中發(fā)揮著重要作用[9]?，F(xiàn)今社會發(fā)展迅速,人們受到輻射損傷的風險大大增加,因此,需要不斷尋找更為有效、安全的抗輻射藥物。Peng等[31]和倫博書等[32]研究認為:部分中藥具有輻射保護作用,可抗自由基,抑制DNA的損傷,且具有更少的副作用。因此,地皮草中的水應(yīng)激蛋白有望被開發(fā)為一種新的抗輻射制劑。

4.3 抗腫瘤活性

近年來,國內(nèi)外學(xué)者圍繞水應(yīng)激蛋白的抗癌功效也進行了一系列研究。Guo等[5]的研究結(jié)果證實:水應(yīng)激蛋白可通過殺滅結(jié)腸癌細胞(HCT-116、HT-29和SW480)來阻滯結(jié)腸癌細胞的增殖,而這種殺傷作用對正常腸上皮細胞幾乎無影響。水應(yīng)激蛋白還可通過G1/S阻滯誘導(dǎo)生長,介導(dǎo)含半胱氨酸蛋白酶(caspase)依賴途徑,誘導(dǎo)細胞的凋亡[5]。通過靶向受體FZD1,水應(yīng)激蛋白通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路,從而發(fā)揮抗結(jié)腸癌的效應(yīng)[17]。同時,郭松佳[33]進行了裸鼠實驗,同樣證實了在機體水平,水應(yīng)激蛋白可以損傷腫瘤細胞,而對正常細胞無影響。

在腫瘤發(fā)展過程中,腫瘤轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的重要環(huán)節(jié),通?？赏ㄟ^黏附改變,誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移開端[34]。近年來,郭松佳等[35]發(fā)現(xiàn):水應(yīng)激蛋白能夠抑制結(jié)腸癌細胞的侵襲和浸潤。這一過程是通過促進人結(jié)直腸腺癌上皮細胞(DLD1)細胞間的黏附,以降低細胞-基質(zhì)間黏附的實現(xiàn),同時,此過程由鈣黏蛋白E(E-cadherin)及神經(jīng)鈣黏素(N-cadherin)等關(guān)鍵分子以及下調(diào)PI3K/ AKT/mTOR通路激活自噬介導(dǎo),證實了念珠藻水應(yīng)激蛋白具有顯著的抗結(jié)腸癌活性[36]。目前,本課題組正在研究水應(yīng)激蛋白抗胃癌及對其他腫瘤的效果,以期可以為腫瘤患者提供新的治療方法。

4.4 糖苷酶活性

水應(yīng)激蛋白具有β-D-半乳糖苷酶活性,并且與1,4-β-D-木糖苷酶活性相關(guān),可參與細胞周圍高分子聚合物的水解[37]。β-D-半乳糖苷酶通過催化乳糖,可進一步水解生成葡萄糖和半乳糖[38]。1,4-β-D-木糖苷酶在木聚糖降解的過程中起著重要的作用,可通過木糖和木糖寡糖的非還原末端連續(xù)去除β-木糖基殘基,從而在木聚糖水解期間減輕內(nèi)切木聚糖酶的終產(chǎn)物抑制效應(yīng)。降解之后的木糖對于念珠藻共生的細菌及真菌生長過程均具有重要作用,可幫助細胞擴散,從而擴大該藍藻的菌落[39]。

5 應(yīng)用前景與展望

5.1 提取工藝的優(yōu)化

目前,水應(yīng)激蛋白的提取工藝,諸如:丙酮沉淀提取法具有殘留雜質(zhì)多、會破壞有效成分等缺點,而基因工程表達的蛋白常常會形成不溶性的包涵體,喪失其原有生物功能。因此,尋找合適的蛋白提取工藝,尤其是將各法所提取的蛋白在各項指標上進行比對,具有重要意義。

5.2 農(nóng)作物抗旱及抗輻射的應(yīng)用

對于植物抗干旱能力的提高已成為目前作物研究的一大熱點。但尚未有過表達水應(yīng)激蛋白能否改善作物抗干旱能力的相關(guān)報道,因此,深入利用水應(yīng)激蛋白的抗旱特性,有望提高作物抵御嚴重干旱和抗紫外線輻射的能力。

5.3 抗消化系統(tǒng)腫瘤的應(yīng)用前景與對分子機制的研究

目前,水應(yīng)激蛋白對于腫瘤細胞的調(diào)控機制尚不完全清楚,并且缺乏其激活下游信號通路的機制說明。根據(jù)已獲取的基因序列,對水應(yīng)激蛋白及受體蛋白的結(jié)合效果進行模擬,以尋找受體蛋白,對于篩選出靶標受體具有重要的參考價值。目前,國內(nèi)外研究者仍在不斷挖掘中草藥中的抗癌成分,并以此為基礎(chǔ),提取了大量有抗癌潛力的成分。研究提示:水應(yīng)激蛋白在消化道腫瘤中可能發(fā)揮著重要的作用,具有重大的研究意義。

5.4 蛋白制劑的開發(fā)

藥物研發(fā)人員可以根據(jù)水應(yīng)激蛋白的特性,利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)進一步開發(fā)出適用于腫瘤患者的蛋白藥物。基因工程可以實現(xiàn)水應(yīng)激蛋白的大量制備。然而對于蛋白質(zhì)類藥物而言,其相對分子量大,給藥周期長而頻繁。如何利用新的生物技術(shù),以提高水應(yīng)激蛋白的生物利用度,對水應(yīng)激蛋白進行改造修飾,穩(wěn)定其生物活性,仍值得進一步研究。因此,水應(yīng)激蛋白仍具有巨大的醫(yī)學(xué)應(yīng)用潛力。