谷 梁,張鳳強(qiáng),王 磊

1.河北省眼科醫(yī)院內(nèi)科，邢臺 050010；2.秦皇島軍工醫(yī)院內(nèi)分泌科，秦皇島 066000；3.曲陽縣人民醫(yī)院腎內(nèi)科，保定 073100

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病患者最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，其特征在于血流動力學(xué)和代謝因素的相互復(fù)雜作用［1-2］。研究表明，炎癥在糖尿病并發(fā)癥進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，抑制炎癥反應(yīng)已成為DN 的潛在治療策略［3］。β型蛋白酶體亞基8（proteasome subunitβtype 8，Psmb8）為炎癥相關(guān)基因，其編碼的蛋白可與Psmb9 和Psmb10 共同構(gòu)成免疫蛋白酶體［4］，免疫蛋白酶體則有助于調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）途徑的激活［5］，表明抑制Psmb8/NF-κB 軸可能是實(shí)現(xiàn)DN 抗炎的途徑之一。燈盞細(xì)辛（erigeron breviscapus，EB）為燈盞花的干燥全株，主要活性成分為黃酮類化合物，具有保護(hù)神經(jīng)、保護(hù)心腦血管、抗氧化、抗癌及抗炎等藥理作用［6］。本研究擬通過構(gòu)建DN 大鼠模型探討EB 對DN 大鼠炎癥反應(yīng)的影響及可能的作用機(jī)制，以期為DN 治療機(jī)制的研究及藥物的選擇提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

16580 50 型電泳儀及電泳槽均購自美國Bio-Rad公司；Spectra Max 190 型酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices 公司）；MIK RO 220 型超速低溫離心機(jī)（德國Hettich 公司）；羅氏卓越精采型血糖儀（德國羅氏公司）；RM2135 型石蠟切片機(jī)（德國徠卡公司）；7180 全自動生化分析儀（日本日立公司）。

1.2 試藥

燈盞細(xì)辛注射液（規(guī)格為10 mL，云南生物谷藥業(yè)股份有限公司）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，上海源葉生物科技有限公司）；大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和白細(xì)胞介素-18（interleukin-18，IL-18）ELISA 試劑盒及Psmb8 抗體均購自北京索萊寶科技有限公司；核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65、p-NF-κB p65 抗體均購自美國CST 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（美國Abcam 公司）。

1.3 動物

SPF 級7 周齡雄性SD 大鼠60 只，體質(zhì)量為（200±20） g，購于西安交通大學(xué)動物醫(yī)學(xué)中心，許可證號為SCXK（陜西）2018-006。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度為20～25 ℃，相對濕度為45%～55%，12 h 光照/12 h 黑暗循環(huán)，充分給予飲水和飼料。

2 方法

2.1 動物模型的制備

60 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，用隨機(jī)數(shù)字表選擇10 只作為正常組，剩余大鼠持續(xù)4 周給予高脂飲食，正常組普通飼養(yǎng)。4 周后所有大鼠禁食但不禁水12 h，高脂飲食組大鼠一次性腹腔注射STZ 35 mg·kg-1，正常組大鼠腹腔注射等量生理鹽水［7］。分別于注射后第3、5、7 天檢測高脂飲食組大鼠尾靜脈隨機(jī)血糖，若有≥2 次血糖值≥16.7 mmol·L-1，則糖尿病大鼠成功造模［8］。4 周后收集所有造模大鼠尿液，檢測24 h 尿蛋白（urine protein，UPro）。若UPro＞30 mg·24 h-1，則為DN 大鼠造模成功［9］，成功造模41 只。

2.2 分組與干預(yù)

成功造模大鼠共41 只，隨機(jī)剔除1 只后，將剩余大鼠隨機(jī)分為模型組、EB 低劑量組、EB 中劑量組和EB 高劑量組，每組10 只。EB 低劑量、EB 中劑量和EB 高劑量組分別灌胃EB 20、40、80 mg·kg-1·d-1，正常組和模型組大鼠給予等量生理鹽水，持續(xù)給藥8 周。

2.3 標(biāo)本采集、血糖與生化指標(biāo)的檢測

給藥8 周后，測量大鼠體質(zhì)量；將各組大鼠分別置于獨(dú)立代謝籠中，采集所有大鼠24 h 尿液，期間保證無食物殘?jiān)廴?。將所采集尿液于室溫環(huán)境下以3 000 r·min-1離心（離心半徑為10 cm）10 min，吸取上清液，保存于-80 ℃冰箱中備用，檢測UPro。采集尾靜脈血，用血糖儀測定空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）。用20 g·L-1戊巴比妥鈉2.5 mL·kg-1麻醉大鼠后，取下腔靜脈血液，4 ℃靜置過夜收集血清，置于-80 ℃冰箱中保存。

取所有大鼠雙側(cè)腎臟，用4 ℃的生理鹽水沖洗，濾紙吸干后稱定質(zhì)量并計(jì)算腎臟指數(shù)（kidney index，KI），KI=雙側(cè)腎臟質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量。取左腎置于100 mL·L-1的中性甲醛中固定，做病理檢查；右腎取新鮮腎組織100 mg，加生理鹽水（1∶9）進(jìn)行勻漿，以3 500 r·min-（1離心半徑為10 cm）離心15 min，取上清液于-80 ℃冰箱保存，用于相關(guān)分子檢測，剩余右腎組織置于液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 腎組織病理學(xué)的觀察

組織常規(guī)固定、脫水透明及石蠟包埋切片后，切片常規(guī)脫蠟入水，用蘇木素染細(xì)胞核1～2 min，水洗，用10 mL·L-1的鹽酸乙醇分化數(shù)秒，水洗，用氨水反藍(lán)數(shù)秒，用流水沖洗，鏡下觀察細(xì)胞核成藍(lán)色，用伊紅染色數(shù)秒，水洗，梯度乙醇脫水，用二甲苯透明，用樹膠封片。封片后均用光學(xué)顯微鏡采集照片。

2.5 腎功能指標(biāo)及炎癥因子的檢測

取一部分血清，用全自動生化分析儀檢測血清肌酐（serum creatinine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平。剩余血清用ELISA 檢測TNF-α、IL-1β和IL-8 水平，向酶標(biāo)板各孔中加入稀釋后的上述抗原100 μL，置于37 ℃下孵育90 min。棄上清液后用50 g·L-1胎牛血清封閉40 min。加入對應(yīng)酶標(biāo)抗體，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長處測定吸光度，根據(jù)各因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其水平。

2.6 腎組織Psmb8 和NF-κB p65 mRNA 表達(dá)水平的檢測

用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測Psmb8 和NF-κB p65 的mRNA 表達(dá)水平。稱定每組大鼠腎組織質(zhì)量，每10～20 mg 組織加入裂解液300 μL。 充分研磨組織，在勻漿中加入RNase 590 μL 和蛋白酶K 10 μL，混合，于56 ℃孵育20 min，于4 ℃以12 000 r·min-1離心5 min。去除上清液，按照試劑盒說明書提取RNA。用核酸定量儀測定質(zhì)量濃度。將溶液置于無酶管內(nèi)，-80 °C 保存。以3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCt法，用qRT-PCR 試劑盒對每種mRNA 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量，基因相對表達(dá)量=2-ΔΔCt。引物序列見表1。

2.7 腎組織諸項(xiàng)指標(biāo)蛋白表達(dá)量的測定

將腎組織標(biāo)本從-80 ℃冰箱內(nèi)取出，稱定質(zhì)量，置于培養(yǎng)皿中，用手術(shù)剪剪碎，按照0.1 g·mL-1加入冷Lysis Buffer （Lysis Buffer-磷酸酶抑制劑-PMSF 100∶1∶1），混勻，冰上研磨3 min，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中，于4 ℃以12 000 r·min-1（離心半徑為10 cm）離心10 min，提取上清液，BCA 蛋白定量分析，4∶1 加蛋白上樣緩沖液，100 ℃變性10 min。SDS-PAGE 蛋白凝膠電泳：制膠，上樣，120 V 恒壓電泳90 min，PVDF 轉(zhuǎn)膜（200 mA恒流，2 h），用50 g·L-1脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗Psmb8、NF-κB p65（1∶500）和p-NF-κB p65（1∶500），4 ℃孵育過夜。用TBST 洗滌3 次，加入二抗（1∶5 000），常溫下孵育1 h，用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)檢測蛋白條帶，用軟件Image J計(jì)算灰度值。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 24.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量結(jié)果以（±s）表示，多組間樣本均數(shù)比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 EB 對DN 大鼠FBG 水平及KI 的影響

大鼠FBG 水平及KI 組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，其他4 組大鼠FBG和KI 明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，EB 低、中、高劑量組大鼠FBG 和KI 均下降（P＜0.05）；EB低劑量、EB 中劑量和EB 高劑量組諸項(xiàng)指標(biāo)水平變化呈劑量依賴性（P＜0.05）。見表2。

表2 EB 對DN 大鼠FBG 水平及KI 的影響 （±s，n=10）Tab.2 Effects of EB on FBG and renal weight index in DN rats(±s, n=10)

表2 EB 對DN 大鼠FBG 水平及KI 的影響 （±s，n=10）Tab.2 Effects of EB on FBG and renal weight index in DN rats(±s, n=10)

注：與正常組比較，※P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與EB低劑量組比較，＃P＜0.05；與EB中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別正常組模型組EB 低劑量組EB 中劑量組EB 高劑量組FBG/（mmol·L-1）5.31±2.64 24.67±2.27※22.61±2.08※△20.63±1.76※△＃18.81±2.01※△＃▲KI 4.10±0.52 9.04±0.84※7.25±0.56※△6.69±0.59※△＃6.13±0.56※△?！?/p>

3.2 EB 對大鼠Scr、BUN 及24 hUPro 水平的影響

大鼠Scr、BUN 及24 hUPro 水平組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，其他4 組大鼠Scr、BUN 及24 hUPro 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，EB 低、中、高劑量組大鼠Scr、BUN 及24 hUPro 水平降低（P＜0.05）；且EB 低劑量、EB 中劑量及EB 高劑量組諸項(xiàng)指標(biāo)水平變化呈劑量依賴性（P＜0.05）。見表3。

表3 EB 對DN 大鼠Scr、BUN 及24 h UPro 水平的影響 （±s，n=10）Tab.3 Effects of EB on Scr, BUN and 24-hour UPro levels in DN rats (±s, n=10)

表3 EB 對DN 大鼠Scr、BUN 及24 h UPro 水平的影響 （±s，n=10）Tab.3 Effects of EB on Scr, BUN and 24-hour UPro levels in DN rats (±s, n=10)

注：與正常組比較，※P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與EB低劑量組比較，＃P＜0.05；與EB中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別正常組模型組EB 低劑量組EB 中劑量組EB 高劑量組Scr/（μmol·L-1）64.11±9.13 106.98±11.16※96.17±9.87※△86.28±10.53※△＃76.13±10.47※△?！鳥UN/（mmol·L-1）6.68±1.33 16.11±2.22※13.18±2.22※△11.07±2.03※△＃8.89±1.96※△＃▲24 h UPro/（mg·24 h-1）9.80±1.66 55.62±6.73※48.81±7.08※△43.19±3.81※△＃31.47±4.40※△?！?/p>

3.3 EB 對各組大鼠腎組織形態(tài)的影響

HE 染色結(jié)果顯示，正常組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)完整，形狀規(guī)則，未見炎癥細(xì)胞浸潤；模型組中可見腎小球萎縮，細(xì)胞外基質(zhì)增多，胞漿浸潤炎性細(xì)胞，間質(zhì)水腫且有大量炎細(xì)胞浸潤；與模型組比較，EB 低劑量、EB 中劑量和EB 高劑量組大鼠腎組織系膜細(xì)胞增生程度、間質(zhì)內(nèi)炎細(xì)胞浸潤量等病理改變及炎癥表象均有不同程度的改善。見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟組織HE 染色結(jié)果 （×400）Fig.1 HE staining results of rat kidney tissue in each group (×400)

3.4 EB 對大鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-18 含量的影響

大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-18 含量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，其他4 組大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-18 含量均升高（P＜0.05）；與模型組比較，EB 低劑量、EB 中劑量和高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-18 含量均降低（P＜0.05），且EB 低劑量、EB 中劑量和EB 高劑量組諸項(xiàng)指標(biāo)水平變化呈劑量依賴性（P＜0.05）。見表4。

表4 EB 對DN 大鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-18 含量的影響 （±s，n=10）Tab.4 Effect of EB on the content of TNF-α, IL-1β and IL-18 in serum of DN rats (±s, n=10)

注：與正常組比較，※P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與EB 低劑量組比較，＃P＜0.05；與EB 中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別正常組模型組EB 低劑量組EB 中劑量組EB 高劑量組TNF-α/（ng·mL-1）57.81±5.65 132.36±10.45※104.21±8.53※△96.93±6.66※△＃76.29±6.36※△?！鳬L-1β/（ng·mL-1）16.03±1.91 47.37±5.48※41.03±5.28※△35.39±6.02※△＃22.39±2.75※△?！鳬L-18/（ng·mL-1）14.59±1.74 59.67±6.74※45.76±6.19※△36.63±5.64※△＃25.79±2.86※△＃▲

3.5 EB 對Psmb8/NF-κB 軸信號蛋白mRNA 表達(dá)量的影響

大鼠腎組織中Psmb8 和NF-κB p65 mRNA 相對表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，其他4 組大鼠腎組織中Psmb8 和NF-κB p65 mRNA 相對表達(dá)量升高（P＜0.05）；與模型組比較，EB 低劑量、EB 中劑量和EB 高劑量組大鼠腎組織中Psmb8 和NF-κB p65 mRNA 相對表達(dá)量降低（P＜0.05），且EB 低劑量、EB 中劑量和EB 高劑量組諸項(xiàng)指標(biāo)水平變化呈劑量依賴性（P＜0.05）。見表5。

表5 EB 對腎臟組織中Psmb8 和NF-κB p65 mRNA 表達(dá)量的影響 （xˉ±s，n=10）Tab.5 Effects of EB on Psmb8 and NF-κB p65 mRNA expression in kidney tissue (±s, n=10)

表5 EB 對腎臟組織中Psmb8 和NF-κB p65 mRNA 表達(dá)量的影響 （xˉ±s，n=10）Tab.5 Effects of EB on Psmb8 and NF-κB p65 mRNA expression in kidney tissue (±s, n=10)

注：與正常組比較，※P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與EB 低劑量組比較，＃P＜0.05；與EB 中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別正常組模型組EB 低劑量組EB 中劑量組EB 高劑量組Psmb8 1.02±0.02 4.31±0.34※3.86±0.35※△2.59±0.11※△＃1.69±0.13※△＃▲NF-κB p65 1.01±0.02 5.61±0.43※4.53±0.15※△3.42±0.12※△＃2.24±0.10※△?！?/p>

3.6 EB 對大鼠Psmb8/NF-κB 軸信號蛋白表達(dá)量的影響

大鼠Psmb8、NF-κB p65 和p-NF-κB p65 蛋白相對表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，其他4 組大鼠腎組織中Psmb8、NFκB p65 和p-NF-κB p65 蛋白相對表達(dá)量升高（P＜0.05）；與模型組比較，EB 低劑量、EB 中劑量和EB 高劑量組大鼠腎組織中Psmb8、NF-κB p65 和p-NF-κB p65 蛋白相對表達(dá)量降低（P＜0.05），且EB低劑量、EB 中劑量和EB 高劑量組諸項(xiàng)指標(biāo)水平變化呈劑量依賴性（P＜0.05）。見圖2、表6。

圖2 各組大鼠腎臟組織中Psmb8、NF-κB p65 和p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoresis of protein expression of Psmb8, NF-κB p65 and p-NF-κB p65 in kidney tissue of rats in each group

表6 EB 對腎臟組織相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響 （±s，n=10）Tab.6 Effects of EB on the expression of related proteins in kidney tissue (±s, n=10)

表6 EB 對腎臟組織相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響 （±s，n=10）Tab.6 Effects of EB on the expression of related proteins in kidney tissue (±s, n=10)

注：與正常組比較，※P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與EB 低劑量組比較，＃P＜0.05；與EB 中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別正常組模型組EB 低劑量組EB 中劑量組EB 高劑量組Psmb8 0.32±0.05 0.89±0.12※0.68±0.08※△0.47±0.07※△＃0.38±0.05※△?！鳱F-κB p65 0.46±0.08 0.92±0.03※0.64±0.06※△0.92±0.05※△＃0.78±0.10※△?！鴓-NF-κB p65 0.28±0.04 0.62±0.09※0.56±0.07※△0.42±0.08※△＃0.38±0.07※△＃▲

4 討論

DN 是一種嚴(yán)重的糖尿?。╠iabetes meltitus，DM）并發(fā)癥，可引起腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化［10］，同時(shí)也是導(dǎo)致DM 患者死亡傷殘的重要原因，并且最終會導(dǎo)致蛋白尿或非蛋白尿型的終末期腎病［11］。DN 的典型表現(xiàn)是早期的腎小球高濾過和蛋白尿，然后是進(jìn)行性腎功能下降，已成為導(dǎo)致DM 高死亡率的重要因素。針對特定炎癥介質(zhì)（如細(xì)胞因子）和細(xì)胞內(nèi)信號通路的DN 抗炎策略已在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭酗@示出關(guān)聯(lián)性，在一定程度上減少了蛋白尿和腎臟的病理變化［12］。由此可見，靶向炎癥對糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）進(jìn)行治療，可有效延緩疾病進(jìn)展，改善疾病癥狀。

燈盞花有效成分為燈盞乙素、咖啡奎寧酸及原兒茶酸等黃酮類化合物，具有活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)及消炎止痛的功效［13］。動物實(shí)驗(yàn)表明，燈盞花可減輕DN 大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而延緩腎小球硬化［14］。臨床研究結(jié)果顯示，燈盞花可用于輔助治療2 型DN 患者，有助于抑制炎癥反應(yīng)，減少白蛋白漏出，保護(hù)腎功能［15］。在炎癥發(fā)生、發(fā)展過程中，Psmb8/NF-κB軸同樣是極其重要的一環(huán)，Psmb8 可以作為免疫蛋白酶體的一個(gè)亞單位誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)［16］；NF-κB 則是炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的DN 進(jìn)展的主要轉(zhuǎn)錄因子［17-18］。高糖環(huán)境下，在腎小球系膜細(xì)胞（mesangial cells，MCs）內(nèi)經(jīng)免疫蛋白酶體活化的NF-κB 能夠誘導(dǎo)包括IL-18 和TNF-α等炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生［19］，Psmb8 能通過構(gòu)成免疫蛋白酶體而活化NFκB，促進(jìn)DN 炎癥的發(fā)生與發(fā)展［20］。

本研究從DN 炎癥發(fā)病機(jī)制出發(fā)，選取Psmb8/NF-κB 軸作為藥物潛在靶點(diǎn)，以下游炎癥因子TNFα、IL-1β和IL-18 為標(biāo)志物，研究EB 對STZ 誘導(dǎo)的DN 大鼠腎臟炎癥的抑制作用及其作用機(jī)制。結(jié)果表明，EB 低劑量、EB 中劑量和EB 高劑量組大鼠FBG、體質(zhì)量和KI 比模型組表現(xiàn)出明顯改善，而且大鼠的Scr、BUN 水平以及24 h UPro 排泄量降低；提取腎組織樣本進(jìn)行染色后，EB 低、中、高劑量組大鼠腎組織的炎癥病理改變有所改善；ELISA 檢測結(jié)果表明，血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-18 的水平亦有所降低。未用EB 干預(yù)的模型組大鼠，Psmb8、NF-κB p65 以及p-NF-κB p65 的蛋白表達(dá)和Psmb8以及NF-κB p65 mRNA 表達(dá)水平均升高，說明在DN 病程中，Psmb8/NF-κB 軸被激活并進(jìn)一步誘導(dǎo)下游因子的表達(dá)，這可能是DN 中炎癥發(fā)病的原因之一；經(jīng)EB 干預(yù)的實(shí)驗(yàn)大鼠通路蛋白和mRNA 的表達(dá)水平則相對降低，證實(shí)了EB 可通過Psmb8/NF-κB軸對DN 進(jìn)行抑制，并且此種抑制作用與其降低下游炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-18 的表達(dá)水平有關(guān)。

綜上所述，本研究分別從機(jī)體、組織、蛋白和mRNA 4 個(gè)角度探討了EB 對DN 大鼠炎癥反應(yīng)的影響，在對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，EB 對DN 炎癥有一定程度的抑制作用，而且這種作用可能與Psmb8/NF-κB 軸及其下游炎癥因子有關(guān)，但其具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。