王 凱,孫林成,余 婓,劉鳳勛

1.河南省南陽市第一人民醫(yī)院腎病內(nèi)科，南陽 473000；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，鄭州 450000

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）作為終末期腎功能衰竭的主要原因，是糖尿病患者最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一［1］，DN 特征包括持續(xù)性白蛋白尿（albuminuria，Alb）、腎小球濾過率降低和出現(xiàn)糖尿病腎臟組織病理學(xué)衰退［2］。DN 蛋白尿增多與足細(xì)胞損傷相關(guān)，其中足細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）通過誘導(dǎo)足細(xì)胞脫離或凋亡，廣泛參與糖尿病足細(xì)胞損傷缺失的早期階段［3］。自噬過度激活或抑制均可導(dǎo)致足細(xì)胞損傷，研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病引起的代謝紊亂可降低機體細(xì)胞自噬水平，導(dǎo)致足細(xì)胞自噬不足［4-5］。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator-1，Sirt 1）為自噬核底物，可通過自噬蛋白微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（icrotubule associated protein 1 light chain 3，LC3）參與細(xì)胞質(zhì)自噬體-溶酶體降解［6］激活Sirt 通路，可增強自噬并減輕DN 氧化應(yīng)激［7］。番瀉葉苷A（sennoside A，SA）具有降血糖、抗纖維化、抗炎、抗菌等多種藥理特性［8］，還可改善DN［9］。本實驗擬通過觀察SA 對鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)的DN 大鼠腎組織及足細(xì)胞的作用探討其可能的機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

FC 型全自動酶標(biāo)儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）；FluorChem M 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國ProteinSimple 公司）。

1.2 試藥

番瀉葉苷A（sennoside A，SA，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號81-27-6，上海滬崢生物科技有限公司）；鹽酸貝那普利片（規(guī)格為10 mg，成都地奧制藥集團有限公司）；鏈脲佐菌素（批號S8050，北京索萊寶科技有限公司）；白蛋白尿酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（上海瓦蘭生物科技有限公司）；兔抗LC3 多克隆抗體（Proteintech 中國公司）；兔抗Bcl-2 相互作用蛋白（Bcl-2 interacting coiled-coil protein 1，Beclin-1）多克隆抗體（武漢艾美捷生物科技有限公司）；兔抗腎病蛋白nephrin 單克隆抗體、兔抗E-鈣黏蛋白（Ecadherin，E-cad）、兔抗波形蛋白（vimentin，Vim）、兔抗Sirt1 單克隆抗體均購自美國Abcam 公司。

1.3 動物

SPF 級雄性7 周齡Wistar 大鼠60 只，體質(zhì)量為（180±20） g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK（湘）2019-0013。恒溫（24±2） ℃、恒濕（相對濕度為50%～60%）環(huán)境下飼養(yǎng)，給予充足水和普通飼料，12 h 光-暗交替，適應(yīng)性培養(yǎng)1 周。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥

隨機挑選10 只大鼠作為正常組，剩余大鼠用于構(gòu)建DN 大鼠模型［10］：斷食12 h，連續(xù)2 d 腹腔注射55 mg·kg-1STZ（檸檬酸緩沖液稀釋），每日1 次，72 h后經(jīng)尾靜脈采血檢測空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），當(dāng)FBG 值連續(xù)3 d≥16.7 mmol·L-1視為糖尿病大鼠，1 周后檢測Alb，陽性表達表明功能損害，DN模型大鼠成功構(gòu)建。正常組大鼠注射等量檸檬酸緩沖液。成功建模的41 只大鼠，隨機剔除1 只，剩余大鼠隨機分為模型組、SA 低劑量組、SA 高劑量組及貝那普利組，每組10 只。SA 低劑量組、SA 高劑量組大鼠每日分別灌胃給予SA 40、80 mg·kg-1，貝那普利組大鼠每日灌服給予鹽酸貝那普利片10 mg·kg-1，模型組及正常組大鼠每日灌服等量生理鹽水，連續(xù)給藥21 d。

2.2 樣品采集與處理

末次給藥結(jié)束后，通過代謝籠單獨收集每只大鼠的24 h 尿液以檢測Alb 含量；腹腔注射戊巴比妥鈉45 mg·kg-1麻醉大鼠，尾靜脈采血、眼眶采血，用全自動生化分析儀檢測各組大鼠空腹FBG、血清肌酐（serum creatinine，Scr）及血尿素氮（BUN）；頸椎脫臼處死大鼠，采集腎臟，將左腎部分保存于多聚甲醛中，用于組織病理學(xué)染色；取右腎1 cm3腎皮質(zhì)保存于戊二醛中，用于超微結(jié)構(gòu)分析；剩余部分均保存于液氮中，用于蛋白印跡法（Western blotting）檢測。

2.3 ELISA 法檢測24 h Alb 含量

24 h 尿液于4 °C 以3 500 r·min-1離心10 min，收集上清液。設(shè)置對照品孔和樣本孔，分別加入對應(yīng)體積對照品及稀釋（5 倍稀釋）后樣品，于各孔加入HRP 標(biāo)記的抗體，37 °C 溫育1 h，洗板，加入底物A、B 避光孵育，終止液終止反應(yīng)，在450 nm 波長處測定各孔吸光度（A）值，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、A值為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算Alb 含量。

2.4 HE 染色

腎組織經(jīng)多聚甲醛固定過夜，常規(guī)石蠟包埋并制備成2 μm 厚度切片，常規(guī)脫蠟至水，用蘇木精染液染色5 min，用鹽酸乙醇分化5 s，用伊紅染色3 min，脫水、透明，用中性樹膠封片，鏡下觀察并采集圖片。

2.5 Masson 染色

組織切片常規(guī)脫蠟至水，用Weigert 鐵蘇木素染色液染色5 min，用鹽酸乙醇分化20 s，用藍(lán)化液返藍(lán)，用麗春紅染色5 min，用乙酸工作液洗滌，用磷鉬酸處理，用乙酸工作液洗滌，脫水、透明，用中性樹膠封片，鏡下觀察并采集圖片。膠原纖維染色呈藍(lán)色，用于評估腎纖維化。

2.6 PAS 染色

組織切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水，高碘酸氧化20 min，水洗，用Schiff 染液避光染色15 min，水洗，用蘇木素染色5 min，用水洗10 min 返藍(lán)，脫水、透明、封片，用中性樹膠封片，鏡下觀察并采集圖片。PAS 糖原陽性呈紫紅色。

2.7 透射電鏡觀察腎組織自噬體的形成

用戊二醛固定過夜，用鋨酸溶液固定1.5 h，用梯度乙醇及丙酮脫水，脫水后組織塊嵌入丙酮與環(huán)氧樹脂等體積混合的浸透液中，4.5 h 后包埋，用超薄切片機制成超薄切片（50 nm），覆蓋于200 目銅網(wǎng)上，在透射電子顯微鏡下觀察自噬體形成。

2.8 Western blotting 檢測腎組織中相關(guān)蛋白的表達水平

取液氮保存的腎組織，研缽碾碎，于4 ℃裂解液內(nèi)裂解，以12 000 r·min-1離心10 min，取上清。測定蛋白質(zhì)量濃度并加熱變性，SDS-PAGE 電泳（壓縮膠60 V，25 min；分離膠120 V，70 min）分離蛋白，濕轉(zhuǎn)（200 mA，120 min）蛋白至PVDF 膜，將膜于50 mg·mL-1脫脂乳中封閉2 h，一抗（1×TBST 行1∶1 000 稀釋）內(nèi)4 ℃孵育14 h；1×TBST 洗膜6 次，二抗（1×TBST 行1∶8 000 稀釋）內(nèi)孵育2 h，1×TBST 洗膜6 次，用增強型化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑于化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)顯影并記錄。用Image J 軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白LC3、Beclin-1、E-cad、Vim、Sirt1、nephrin 與內(nèi)參GAPDH 灰度值比值表示蛋白的相對表達水平。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

SPSS 26.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計量結(jié)果以（±s）表示，多計量樣本比較用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠24 h Alb 含量

組間大鼠24 h Alb 含量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，其他4 組大鼠24 h Alb 含量升高（P＜0.05）；與模型組比較，SA 低劑量組、SA 高劑量組及貝那普利組大鼠24 h Alb 含量降低（P＜0.05）；與SA 低劑量組比較，SA 高劑量組及貝那普利組大鼠24 h Alb含量降低（P＜0.05），貝那普利組大鼠24 h Alb含量最低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠24 h Alb 含量的比較 （±s，n=10）Tab.1 Comparison of 24-hour Alb content of rats in each group (±s, n=10)

表1 各組大鼠24 h Alb 含量的比較 （±s，n=10）Tab.1 Comparison of 24-hour Alb content of rats in each group (±s, n=10)

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與SA 低劑量組比較，cP＜0.05；與SA 高劑量組比較，dP＜0.05。

組別正常組模型組SA 低劑量組SA 高劑量組貝那普利組尿Alb/（mg·d-1）6.01±0.55 22.39±2.78a 19.37±2.35ab 14.17±1.96abc 10.88±2.02abcd

3.2 大鼠FBG、Scr 及BUN 水平

組間大鼠FBG 及Scr、BUN 水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，其他4 組3 項水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，SA 低劑量組、SA 高劑量組及貝那普利組3 項水平降低（P＜0.05）；與SA 低劑量組比較，SA 高劑量組及貝那普利組3 項水平降低（P＜0.05），貝那普利組3 項水平最低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠FBG 及Scr、BUN 水平的比較 （±s，n=10）Tab.2 Comparison of FBG, Scr and BUN levels of rats in each group (±s, n=10)

表2 各組大鼠FBG 及Scr、BUN 水平的比較 （±s，n=10）Tab.2 Comparison of FBG, Scr and BUN levels of rats in each group (±s, n=10)

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與SA 低劑量組比較，cP＜0.05；與SA 高劑量組比較，dP＜0.05。

組別正常組模型組SA 低劑量組SA 高劑量組貝那普利組FBG/（mmol·L-1）5.17±0.72 26.36±3.12a 23.12±2.32ab 16.73±1.80abc 11.44±0.93abcd Scr/（μmol·L-1）66.56±7.49 145.20±13.15a 126.72±7.57ab 98.56±6.48abc 82.53±8.10abcd BUN/（mmol·L-1）5.71±0.82 11.36±1.91a 9.52±1.14ab 7.42±0.67abc 6.43±0.59abcd

3.3 大鼠腎臟組織的病理學(xué)變化

HE 染色結(jié)果顯示，正常組大鼠腎組織中腎小球、腎小管形狀規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整，未見有炎性浸潤；模型組大鼠腎組織中腎小球增大膨出，腎小管管腔不完整，腎小球系膜及腎小管管腔厚度顯著增加；SA低劑量組、SA 高劑量組及貝那普利組大鼠腎組織病理損傷情況有不同程度地減輕。見圖1。

3.4 大鼠腎臟組織的膠原纖維沉積情況

Masson 染色結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠腎組織膠原纖維嚴(yán)重沉積，腎小球及腎小管藍(lán)染較深；與模型組比較，3 個給藥組腎組織藍(lán)染范圍逐漸縮小，膠原纖維沉積程度均逐漸減輕。見圖2。

圖2 各組大鼠腎組織Masson 染色結(jié)果（400×）Fig.2 Masson staining results of renal tissue of rats in each group (400×)

3.5 大鼠腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)增生的情況

PAS 染色結(jié)果顯示，正常組糖原陽性染色區(qū)域較小，顏色較淺，腎小球基底膜較薄；模型組大鼠腎組織中腎小球基底膜和系膜糖原沉積明顯，腎小球基底膜、系膜增厚；3 個給藥組糖原陽性沉積程度逐漸減弱，區(qū)域有不同程度地縮小。見圖3。

圖3 各組大鼠腎組織PAS 染色的結(jié)果（400×）Fig.3 Results of PAS staining of renal tissue of rats in each group (400×)

3.6 大鼠腎組織中自噬體的形成情況

透射電鏡觀察結(jié)果顯示，細(xì)胞中自噬體呈雙層囊泡樣結(jié)構(gòu)。組間大鼠腎組織中自噬體數(shù)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，其他4 組大鼠腎組織中自噬體數(shù)量減少（P＜0.05）；與模型組比較，3 個給藥組組織中自噬體數(shù)量增加（P＜0.05）；與SA 低劑量組比較，SA 高劑量組及貝那普利組自噬體數(shù)量增加（P＜0.05），貝那普利組自噬體數(shù)量顯著增加（P＜0.05）。見表3、圖4。

圖4 各組大鼠腎組織在透射電鏡下自噬體-溶酶體觀察（30 000×）Fig.4 Observation of autophagy lysosome in renal tissue of rats in each group under transmission electron microscope (30 000 ×)

表3 各組大鼠腎組織中自噬體的數(shù)量（±s，n=10）Tab.3 The number of autophagosomes in renal tissue of rats in each group (±s, n=10)

表3 各組大鼠腎組織中自噬體的數(shù)量（±s，n=10）Tab.3 The number of autophagosomes in renal tissue of rats in each group (±s, n=10)

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與SA 低劑量組比較，cP＜0.05；與SA 高劑量組比較，dP＜0.05。

組別正常組模型組SA 低劑量組SA 高劑量組貝那普利組自噬體數(shù)量/（個·視野-1）6.20±0.87 1.60±0.66a 2.70±0.78ab 4.20±0.98abc 5.10±0.83abcd

3.7 大鼠腎組織中蛋白的相對表達情況

組間大鼠腎組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin-1、E-cad、Vim、nephrin 及Sirt1 蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，其他4 組大鼠腎組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin-1、E-cad、nephrin 及Sirt1 蛋白的相對表達量降低，Vim蛋白的相對表達量升高（P＜0.05）；與模型組比較，3 個給藥組LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值、Beclin-1、E-cad、nephrin 及Sirt1 蛋白相對表達量升高，Vim 蛋白相對表達量降低（P＜0.05）；與SA 低劑量組比較，SA 高劑量組及貝那普利組上述指標(biāo)水平變化規(guī)律相同（P＜0.05），貝那普利組更顯著（P＜0.05）。見表4、圖5。

圖5 各組大鼠腎組織內(nèi)相關(guān)蛋白Western blotting 條帶Fig.5 Western blotting bands of related proteins in renal tissue of rats in each group

表4 各組大鼠腎組織內(nèi)目的蛋白的相對表達量（ ±s，n=10）Tab.4 The relative expression of target proteins in renal tissue of rats in each group (±s, n=10)

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與SA 低劑量組比較，cP＜0.05；與SA 高劑量組比較，dP＜0.05。

組別正常組模型組SA 低劑量組SA 高劑量組貝那普利組LC3Ⅱ/LC3I 2.62±0.42 0.31±0.04a 0.42±0.03ab 0.67±0.04abc 1.12±0.27abcd Beclin-1 0.42±0.04 0.11±0.02a 0.15±0.02ab 0.25±0.03abc 0.31±0.04abcd E-cad 0.56±0.05 0.18±0.02a 0.24±0.03ab 0.32±0.03abc 0.39±0.04abcd Vim 0.10±0.02 0.33±0.04a 0.29±0.03ab 0.21±0.03abc 0.13±0.02abcd Nephrin 0.88±0.05 0.13±0.02a 0.19±0.03ab 0.28±0.04abc 0.38±0.04abcd Sirt1 0.92±0.05 0.17±0.02a 0.21±0.03ab 0.32±0.03abc 0.45±0.04abcd

4 討論

蛋白尿是早期DN 的常見特征，與腎小球肥大、腎小球基底膜增厚和系膜細(xì)胞外基質(zhì)擴張有關(guān)［11］；足細(xì)胞是一種高度分化的上皮細(xì)胞，附著在腎小球基底膜外表面，共同形成最終的過濾屏障以防蛋白質(zhì)流失，其損傷時可致蛋白尿［12］。本研究經(jīng)連續(xù)單次注射STZ，與正常組比較，模型組大鼠FBG、Scr、BUN 水平及24 h Alb 含量顯著升高，表明成功構(gòu)建DN 大鼠模型，另表明DN 大鼠腎臟機能受損；病理染色結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠腎組織明顯可見腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)異常、完整性缺失，基底膜及系膜增厚，膠原蛋白嚴(yán)重沉積等病理變化，表明DN 大鼠腎功能受損可能是因為腎組織病理改變引起足細(xì)胞損傷進而導(dǎo)致過濾屏障受損。

SA 作為大黃的主要活性成分可廣泛用于治療肥胖和便秘，可通過腸道細(xì)菌轉(zhuǎn)化為活性代謝物大黃酸蒽酮［13］。一項關(guān)于大黃治療動物DN 的系統(tǒng)評價和薈萃分析結(jié)果顯示，大黃酸可降低高血糖、增加胰島素敏感性、保護腎功能并顯著改善DN［14］。徐博等［15］研究表明，SA 可減輕STZ 誘導(dǎo)的DN 大鼠腎組織細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，SA 可減輕DN 大鼠腎小球、腎小管病理性損傷及膠原纖維沉積，降低FBG、Scr、BUN 及24 h Alb 含量，表明SA 經(jīng)灌胃后，可能通過減輕足細(xì)胞損傷而發(fā)揮一系列腎臟保護作用。

足細(xì)胞損傷可作為DN 演變的臨床預(yù)測指標(biāo)，足細(xì)胞自噬能降解蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，其功能障礙被認(rèn)為是足細(xì)胞損傷的重要誘導(dǎo)因素，也是提示體外和體內(nèi)足細(xì)胞凋亡/損傷的指標(biāo)［16-17］。LC3 是自噬體指示蛋白，自噬體膜脂化形式（LC3Ⅱ）/胞質(zhì)形式（LC3Ⅰ）比值用于監(jiān)測自噬發(fā)生；Beclin1 參與調(diào)節(jié)自噬體形成與成熟［18］，自噬可刺激LC3、Beclin 1 蛋白的表達［19］。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠腎組織中自噬體數(shù)量顯著減少，而經(jīng)SA 治療后，自噬體數(shù)量顯著增加，且LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及Beclin1 蛋白相對表達水平顯著升高，表明足細(xì)胞中自噬的抑制導(dǎo)致DN 腎功能障礙，SA 可能通過促進足細(xì)胞自噬體形成及成熟，改善其自噬功能，進而減輕DN 大鼠腎組織病理損傷。若足細(xì)胞損傷時呈進行性，足細(xì)胞將經(jīng)歷EMT 并逃避凋亡，從而導(dǎo)致成熟足細(xì)胞上皮樣表型標(biāo)志物（如Ecad）丟失，獲得間充質(zhì)細(xì)胞樣表型標(biāo)志物（如Vim）［20］。nephrin 是一種黏附蛋白，在腎小球的足細(xì)胞細(xì)胞間連接處表達，其表達水平是足細(xì)胞脫離、丟失的先兆［21］。LU Z［22］等研究表明，當(dāng)足細(xì)胞免受損傷和EMT 時，nephrin、E-cad 表達上調(diào)，波形蛋白表達下調(diào)。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腎組織中Ecad、nephrin 蛋白相對表達量顯著降低，Vim 蛋白相對表達水平顯著升高，表明DN 大鼠足細(xì)胞可能因損傷刺激而發(fā)生EMT，導(dǎo)致足細(xì)胞缺失；而經(jīng)SA 治療后，nephrin、E-cad 表達上調(diào)，波形蛋白表達下調(diào)，表明SA 可能通過改善DN 大鼠腎組織病理損傷，促進足細(xì)胞自噬恢復(fù)，減少足細(xì)胞損傷，減緩EMT 防止足細(xì)胞丟失，進而減輕腎功能障礙。

Sirt-1 是維持細(xì)胞骨架完整性和足細(xì)胞存活所必需的蛋白質(zhì)，WANG W 等［23］研究認(rèn)為，Sirt-1 涉及DN 發(fā)病機制中代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥、自噬損害、缺氧、異常血管生成、細(xì)胞凋亡和腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活等多種信號通路；研究發(fā)現(xiàn)，一些合成藥物和天然化合物作為Sirt-1 激活劑發(fā)揮藥理活性時，均涉及通過Sirt-1 通路減輕腎臟組織病理損傷、降低STZ 誘導(dǎo)的DN 大鼠Alb 水平［24］、改善自噬障礙［25］及預(yù)防EMT 所致的腎組織纖維化［26］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腎組織中Sirt 蛋白的相對表達量顯著降低，經(jīng)SA 治療后，其表達量顯著升高，結(jié)合上述結(jié)果，提示SA 可能作為Sirt-1 激活劑參與并激活Sirt-1通路，發(fā)揮一系列腎臟保護作用。

綜上所述，SA 可減輕腎功能障礙，其機制可能與激活Sirt-1 通路，進而改善DN 大鼠腎組織病理損傷、促進足細(xì)胞自噬恢復(fù)、減少足細(xì)胞損傷及減緩EMT 發(fā)生有關(guān)。