范宏芳,王孜涵,王 莉,馬韻翼,鈕紅麗,翟俊英,姜李樂

1.河南大學(xué)附屬南陽市第一人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，南陽 473000；2.河南省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，鄭州 450000

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種常見的內(nèi)分泌紊亂和代謝異常的婦科疾病，其主要臨床表現(xiàn)為持續(xù)性無排卵、卵巢多囊樣改變、高雄激素血癥以及胰島素抵抗［1］，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞凋亡可能是其發(fā)病的主要原因［2］。研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷聯(lián)合二甲雙胍治療PCOS 大鼠可改善其內(nèi)分泌紊亂，抑制炎癥反應(yīng)，改善胰島素抵抗和子宮內(nèi)膜損傷［3］。另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷聯(lián)合二甲雙胍可逆轉(zhuǎn)PCOS 大鼠卵巢多囊性改變，其機(jī)制可能與抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)［4］。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路與細(xì)胞增殖、分化和凋亡密切相關(guān)。研究表明，隱丹參酮通過激活PI3K 途徑可改善PCOS 大鼠生殖機(jī)能異常［5］?；谝陨涎芯浚緦?shí)驗(yàn)通過建立PCOS 大鼠模型，探討黃芩苷對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞增殖和凋亡的影響及對(duì)PI3K/Akt 信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器

酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）；電泳儀（北京六一儀器廠）；低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 試藥

黃芩苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)B20570，上海源葉生物科技有限公司）；脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA，武漢華美科技集團(tuán)有限公司）；炔雌醇環(huán)丙孕酮片（達(dá)英-35），拜耳醫(yī)藥保健有限公司）；黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、睪酮（testosterone，T）、雌二醇（estradiol，E2）試劑盒均購自上海碧云天生物科技有限公司；磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、磷酸化磷脂肌醇3-激酶（phospho PI3K，p-PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、磷酸化蛋白激酶B（phospho Akt，p-Akt）及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）抗體均購自美國(guó)Abcam 公司。

1.3 動(dòng)物

健康清潔級(jí)雌性SD 大鼠60 只，8 周齡，體質(zhì)量為180～200 g，購自北京天誠(chéng)醫(yī)藥科技有限公司，許可證號(hào)為SYXK（京）2016-0047。

2 方法

2.1 造模與分組

PCOS 大鼠模型的制備：隨機(jī)選取48 只大鼠，按照0.6 g·kg-1的劑量將DHEA 經(jīng)頸背部皮下注射入大鼠體內(nèi)，每日1 次，連續(xù)20 d，光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠陰道涂片，若陰道上皮細(xì)胞持續(xù)角化，動(dòng)情周期消失即視為模型制備成功［6］。將造模成功的48 只大鼠隨機(jī)分為模型組、黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組和陽性對(duì)照組，每組12 只。黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組大鼠分別灌胃25、50 mg·kg-1黃芩苷，陽性對(duì)照組大鼠灌胃0.339 2 mg·kg-1達(dá)英-35，對(duì)照組和模型組灌胃等體積生理鹽水，每日1 次，連續(xù)3 周。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）

藥物干預(yù)結(jié)束后第2 天，尾靜脈采血2 mL，以3 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為8 cm），根據(jù)ELISA 試劑盒說明書將對(duì)照品稀釋至所需質(zhì)量濃度，酶標(biāo)板設(shè)置空白孔、對(duì)照品孔和待測(cè)樣品孔，將稀釋后的對(duì)照品50 μL 置于對(duì)照品孔中，待測(cè)樣品孔中加入稀釋液40 μL，再加入待測(cè)樣品10 μL，37 ℃孵育30 min，洗滌液洗滌5 次，拍板，甩干，加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）標(biāo)記的鏈霉親和素50 μL，再加入四甲基聯(lián)苯胺50 μL，反應(yīng)15 min，置于酶標(biāo)儀上，在490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）值。

2.3 蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色

采血完成后，頸椎脫臼法處死大鼠，取出左側(cè)卵巢組織，置于4 g·L-1多聚甲醛中固定，脫水、包埋、切片后，用蘇木素和伊紅染液染色，中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察大鼠卵巢組織病理學(xué)變化。

2.4 顆粒細(xì)胞分離

取大鼠右側(cè)卵巢組織，生理鹽水沖洗3 次，去除多余脂肪組織，解剖鏡下用無菌注射器針頭刺破卵巢上的卵泡，釋放顆粒細(xì)胞，用生理鹽水沖洗，200 目篩過濾，以1 500 r·min-1離心5 min，棄上清液，用生理鹽水將沉渣重懸，再次離心，上層細(xì)胞即為顆粒細(xì)胞［7］。

2.5 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（cell Counting Kit-8，CCK-8）

調(diào)整細(xì)胞密度為106個(gè)·mL-1，接種于96 孔板中，加入200 μL 含10 g·L-1胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，取出培養(yǎng)板，每孔加入20 μL CCK-8 溶液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定A值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值）×100%。

2.6 流式細(xì)胞儀法

調(diào)整細(xì)胞密度為106個(gè)·mL-1，接種于96 孔板中，加入200 μL 含培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，離心收集細(xì)胞，加入結(jié)合緩沖液500 μL 將細(xì)胞重懸，加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）和膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）各5 μL，充分混勻，避光反應(yīng)15 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2.7 蛋白印跡法

收集顆粒細(xì)胞，加入放射免疫沉淀法緩沖液（radioimmunoprecipitation assay buffer，RIPA）裂解細(xì)胞，在4 ℃條件下以12 000 r min-1離心10 min，收集上清液，二奎啉甲酸法（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度。加蛋白樣品，120 V 恒壓進(jìn)行凝膠電泳，0.3 A 恒流進(jìn)行濕轉(zhuǎn)，洗膜，脫脂奶粉室溫封閉，一抗4 ℃孵育過夜，洗膜，二抗室溫孵育1 h，洗膜，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑法顯色，Image J 分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參灰度值。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料均以（±s）表示，多樣本計(jì)量資料比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 血清激素含量測(cè)定結(jié)果

FSH、E2、LH 和T 含量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，模型組FSH、E2含量降低，LH、T 含量升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組和陽性對(duì)照組FSH 和E2 含量升高，LH 和T 含量降低（P＜0.05）；與黃芩苷低劑量組比較，黃芩苷高劑量組和陽性對(duì)照組FSH、E2 含量升高，LH、T 含量降低（P＜0.05）；與黃芩苷高劑量組比較，陽性對(duì)照組FSH、E2 含量升高，LH、T 含量降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清激素含量的比較 （n=12, ±s）Tab.1 Comparison of serum hormone content in each group （n=12,±s）

表1 各組大鼠血清激素含量的比較 （n=12, ±s）Tab.1 Comparison of serum hormone content in each group （n=12,±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與黃芩苷低劑量組比較，cP＜0.05；與黃芩苷高劑量組比較，dP＜0.05。

項(xiàng)目對(duì)照組模型組黃芩苷低劑量組黃芩苷高劑量組陽性對(duì)照組FP FSH/（U·L-1）6.09±1.07 2.09±0.82a 3.15±0.81ab 4.22±0.97abc 5.15±0.77abcd 35.833＜0.001 E2/（pmol·L-1）130.71±7.42 36.06±5.01a 55.00±5.98ab 73.77±7.26abc 102.39±12.16abcd 267.404＜0.001 LH/（U·L-1）3.44±0.45 14.94±1.64a 10.63±1.47ab 8.07±0.88abc 5.43±1.01abcd 171.950＜0.001 T/（nmol·L-1）21.70±4.45 147.21±10.20a 118.30±9.18ab 84.23±8.20abc 49.33±8.82abcd 423.011＜0.001

3.2 HE 染色結(jié)果

對(duì)照組大鼠可見黃體，未見囊狀擴(kuò)張卵泡；模型組大鼠卵巢體積增大，少見黃體，可見囊狀擴(kuò)張卵泡；黃芩苷低劑量組和高劑量組以及陽性對(duì)照組大鼠卵巢體積減小，可見黃體，囊狀卵泡擴(kuò)增不明顯。見圖1。

圖1 HE 染色觀察卵巢組織的病理變化（×200）Fig.1 The pathological changes of ovarian tissue observed by HE staining (×200)

3.3 CCK-8 法檢測(cè)結(jié)果

細(xì)胞存活率組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞存活率降低（P＜0.05）；與模型組比較，黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組和陽性對(duì)照組細(xì)胞存活率升高（P＜0.05）；與黃芩苷低劑量組比較，黃芩苷高劑量組和陽性對(duì)照組細(xì)胞存活率升高（P＜0.05）；與黃芩苷高劑量組比較，陽性對(duì)照組細(xì)胞存活率升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞存活率的比較（n=12, ±s）Tab.2 Comparison of the survival rate of ovarian granulosa cells in each group (n=12,±s)

表2 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞存活率的比較（n=12, ±s）Tab.2 Comparison of the survival rate of ovarian granulosa cells in each group (n=12,±s)

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與黃芩苷低劑量組比較，cP＜0.05；與黃芩苷高劑量組比較，dP＜0.05。

項(xiàng)目對(duì)照組模型組黃芩苷低劑量組黃芩苷高劑量組陽性對(duì)照組FP細(xì)胞存活率100.00%59.33%±5.35%a 69.08%±8.63%ab 82.04%±4.30%abc 93.16%±2.86%abcd 128.688＜0.001

3.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

細(xì)胞凋亡率組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組和陽性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與黃芩苷低劑量組比較，黃芩苷高劑量組和陽性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與黃芩苷高劑量組比較，陽性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）。見表3、圖2。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率Fig.2 The apoptosis rate measured by flow cytometry

表3 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率的比較 （n=12，±s）Tab.3 Comparison of apoptosis rate of ovarian granulosa cells of rats in each group (n=12，±s)

表3 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率的比較 （n=12，±s）Tab.3 Comparison of apoptosis rate of ovarian granulosa cells of rats in each group (n=12，±s)

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與黃芩苷低劑量組比較，cP＜0.05；與黃芩苷高劑量組比較，dP＜0.05。

項(xiàng)目對(duì)照組模型組黃芩苷低劑量組黃芩苷高劑量組陽性對(duì)照組FP細(xì)胞凋亡率2.36%±0.66%9.18%±0.84%a 8.17%±0.82%ab 6.99%±0.77%abc 4.49%±0.92%abcd 138.887＜0.001

3.5 蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果

p-PI3K 和p-Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，模型組p-PI3K 和p-Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）；與模型組比較，黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組和陽性對(duì)照組p-PI3K 和p-Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）；與黃芩苷低劑量組比較，黃芩苷高劑量組和陽性對(duì)照組p-PI3K 和p-Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）；與黃芩苷高劑量組比較，陽性對(duì)照組p-PI3K 和p-Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）。PI3K 和p-Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4、圖3。

圖3 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.3 Electrophoretic map of protein expression

表4 各組大鼠卵巢組織中蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較 （n=12, ±s）Tab.4 Comparison of relative protein expression levels in ovarian tissues of rats in each group (n=12,±s)

表4 各組大鼠卵巢組織中蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較 （n=12, ±s）Tab.4 Comparison of relative protein expression levels in ovarian tissues of rats in each group (n=12,±s)

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與黃芩苷低劑量組比較，cP＜0.05；與黃芩苷高劑量組比較，dP＜0.05。

項(xiàng)目對(duì)照組模型組黃芩苷低劑量組黃芩苷高劑量組陽性對(duì)照組FP p-PI3K 0.98±0.04 0.11±0.02a 0.35±0.05ab 0.64±0.06abc 0.89±0.03abcd 877.820＜0.001 PI3K 0.99±0.03 0.98±0.04 0.95±0.05 0.99±0.03 0.95±0.06 2.372 0.065 p-Akt 0.98±0.06 0.10±0.02a 0.42±0.06ab 0.73±0.06abc 0.86±0.05abcd 549.872＜0.001 Akt 0.97±0.05 0.94±0.03 0.94±0.06 0.98±0.03 0.95±0.06 1.566 0.198

4 討論

卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)精細(xì)而復(fù)雜的過程，而卵巢顆粒細(xì)胞在其中發(fā)揮重要作用，在竇前卵泡后期，顆粒細(xì)胞出現(xiàn)FSH 受體，F(xiàn)SH 誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞芳香化酶合成，而芳香化酶可使顆粒細(xì)胞將睪酮轉(zhuǎn)化成雌激素，竇卵泡期FSH 受體大量合成，產(chǎn)生大量雌激素，從而促進(jìn)卵泡發(fā)育，形成優(yōu)勢(shì)卵泡，但顆粒細(xì)胞凋亡可阻止睪酮轉(zhuǎn)變?yōu)榇萍に?，?dǎo)致雄激素累積，發(fā)生高雄激素血癥［8］。雄激素的大量積累造成卵泡發(fā)育阻滯，優(yōu)勢(shì)卵泡的選擇出現(xiàn)障礙，大量小竇狀卵泡積聚，卵巢發(fā)生多囊狀改變［9］。由此可見，顆粒細(xì)胞凋亡可能是發(fā)生PCOS 的重要機(jī)制。且SHEN H R 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，PCOS 大鼠顆粒細(xì)胞凋亡率升高，用黃連素處理后可降低細(xì)胞凋亡率、抑制炎癥反應(yīng)、改善激素代謝異常。但是顆粒細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

黃芩苷是一種黃酮類化合物，已有研究表明，黃芩苷可調(diào)整PCOS 大鼠激素代謝異常，改善卵巢組織病理學(xué)改變和卵泡發(fā)育，同時(shí)降低炎癥反應(yīng)［11］。黃芩苷在抑制細(xì)胞凋亡方面的作用已有很多研究，YU H 等［12］研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷可通過激活Nrf2/HO-1信號(hào)軸有效抑制缺氧誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞凋亡。黃芩苷還可減輕三氧化二砷誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷和細(xì)胞凋亡［13］。本研究HE 染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠可見黃體，未見囊狀擴(kuò)張卵泡；模型組大鼠卵巢體積變大，少見黃體，可見囊狀擴(kuò)張卵泡；黃芩苷低劑量組、高劑量組及陽性對(duì)照組大鼠卵巢體積變小，可見黃體，囊狀卵泡擴(kuò)增不明顯。此外，通過CCK-8 法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)黃芩苷對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞增殖和凋亡的影響結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，模型組顆粒細(xì)胞存活率降低，凋亡率升高；與模型組比較，黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組顆粒細(xì)胞存活率升高，凋亡率降低。結(jié)果表明，黃芩苷可抑制顆粒細(xì)胞凋亡、促進(jìn)增殖。正常生理狀況下，卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育通過多種激素的精密調(diào)控有序進(jìn)行，包括T、LH、E2 和FSH，而PCOS 患者由于激素代謝紊亂，通常表現(xiàn)為血清T 和LH 含量升高，而E2 和FSH 含量降低［14-15］。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中FSH 和E2 含量降低，而T 和LH 含量升高；黃芩苷治療后與模型組比較，大鼠血清中FSH 和E2含量升高，而T 和LH 含量降低。表明黃芩苷可改善PCOS 大鼠性激素代謝異常。

PI3K/Akt 通路在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化及細(xì)胞周期進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用［16-17］。XIE F 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素通過激活PI3K-Akt 通路抑制顆粒細(xì)胞自噬和凋亡，改善PCOS 大鼠卵巢功能障礙。YU J等［19］研究表明，黃連素通過激活PI3K/AKT 途徑對(duì)PCOS 的有益作用包括改變血清激素水平、恢復(fù)卵巢形態(tài)病變、改善胰島素抵抗、增強(qiáng)細(xì)胞活力和抑制顆粒細(xì)胞凋亡。此外，葛根素能有效降低PCOS 大鼠血糖及胰島素水平，改善胰島素抵抗，且呈濃度依賴性，其作用可能與激活PI3K/AKT/FoxO1 信號(hào)通路有關(guān)［20］。本研究結(jié)果顯示，模型組p-PI3K 和p-Akt蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組降低，黃芩苷低劑量組和黃芩苷高劑量組p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)水平較模型組升高。表明黃芩苷可激活PI3K/Akt 信號(hào)通路。

綜上所述，黃芩苷可改善PCOS 大鼠性激素代謝紊亂、減輕卵巢病理損傷、促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖、抑制顆粒細(xì)胞凋亡，其可能是通過激活PI3K/Akt 信號(hào)通路發(fā)揮作用的，可為臨床治療PCOS 提供新的研究思路。