許桂丹綜述,鄧益斌審校

0 引 言

地中海貧血(地貧)是全球分布最廣、累及人群最多、危害性最大的一種單基因病。地貧難治可防,通過產(chǎn)前診斷阻止重型患兒出生是目前國內(nèi)外公認(rèn)的首選預(yù)防措施。絨毛膜吸取、羊膜腔穿刺和臍靜脈血穿刺是目前常用的產(chǎn)前診斷技術(shù),但均屬于侵入性操作,除母體細(xì)胞污染導(dǎo)致的基因型誤診風(fēng)險,還有一定流產(chǎn)、宮內(nèi)感染、胎兒損傷甚至死亡等并發(fā)癥的風(fēng)險。孕婦外周血胎兒游離DNA(cell-free fetal DNA,cffDNA)的發(fā)現(xiàn)為遺傳性疾病的無創(chuàng)產(chǎn)前DNA檢測(noninvasive prenatal testing,NIPT)提供了新的途徑。近年來,數(shù)字PCR、突變序列富集法、分子大小分離法、飛行時間質(zhì)譜分析和下一代測序(next-generation sequencing, NGS)的發(fā)展與應(yīng)用,使無創(chuàng)產(chǎn)前地貧診斷成為現(xiàn)實,相關(guān)技術(shù)的進一步發(fā)展有望推動其他遺傳病無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的應(yīng)用。本文主要就cffDNA和NGS的地貧NIPT研究進展作一綜述。

1 NIPT的發(fā)展概況

傳統(tǒng)的血清學(xué)產(chǎn)前篩查及超聲檢查檢測時間窗窄,且漏診率和假陽性高,絨毛、羊水和臍靜脈血穿刺產(chǎn)前診斷均屬于侵入性。一直以來,研究學(xué)者們?yōu)閷で蟀踩行У漠a(chǎn)前診斷技術(shù)做了相關(guān)大量工作,早在1954年,Chown等[1]研究發(fā)現(xiàn),在失血性貧血胎兒中發(fā)現(xiàn)有胎兒紅細(xì)胞進入母體血液循環(huán)。1997年,Lo等[2]從孕婦血漿中檢出男性胎兒Y染色體上特異序列,并且發(fā)現(xiàn)孕婦血漿cffDNA在孕早期可以檢測,其含量明顯高于其他胎兒成分,這一重大發(fā)現(xiàn)在NIPT史上具有里程碑意義。2008年,Chiu等[3]檢測了28例孕婦孕早期和孕中期的血漿樣本,測序結(jié)果14例21號染色體三體胎兒和14例正常胎兒全部驗證,這一重要研究發(fā)現(xiàn)開啟了NIPT時代。2010年,Lo等[4]證實cffDNA包含整個胎兒基因組,并且以相對恒定的比例與母體基因組共存于孕婦外周血中。利用孕婦外周血中cffDNA進行遺傳性疾病的NIPT具有安全、無創(chuàng)、準(zhǔn)確率高(有些疾病可達99%以上)、檢測時間窗長,檢測周期短等優(yōu)勢,而成為產(chǎn)前診斷的研究熱點。

2 母體血液中cffDNA的生理特性

孕母血漿中的cffDNA主要來源于凋亡和損傷的胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞[4],在孕7周就可檢出,其含量隨著孕周的增大而增加[5]。cffDNA具有以下特點:①含量低,cffDNA僅占血漿總游離DNA的4%～37%,其余為母親的游離DNA,母體內(nèi)cffDNA的百分比也稱胎兒濃度(fetal fraction, FF)[6];②片段化,cffDNA片段被降解,平均大小為166bp[7];③半衰期短,cffDNA半衰期僅為4～30min,分娩2h后在母體內(nèi)迅速清除,不受既往妊娠影響或影響下一胎孕期檢測[8];④影響因素,cffDNA受孕婦體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、孕早期篩查參數(shù)和吸煙狀況等因素的影響[9-10]。因此,單基因病的NIPT檢測面臨著許多技術(shù)挑戰(zhàn):①如何檢測與高濃度母源性DNA共存的cffDNA?②當(dāng)cffDNA測出的突變型別中有與孕婦相同的突變時,如何明確胎兒的基因型?③如何運用短片段的cffDNA檢測缺失型突變。為克服以上難題,大量的可行性診斷策略不斷探索[3-11]。

3 地貧NIPT的研究進展

目前,將cffDNA應(yīng)用于胎兒染色體非整倍體NIPT的已經(jīng)成熟應(yīng)用于臨床,針對21、13、18三大染色體非整倍體疾病的檢測準(zhǔn)確率高達99%以上,具有早期、快速、安全、無創(chuàng)、準(zhǔn)確率高等特點[12]。NIPT plus是在21、13、18三大染色體的基礎(chǔ)上,增加其他的常染色體非整倍體以及各種微缺失/微重復(fù)的檢測[13-14]。目前,NIPT還廣泛應(yīng)用于各種單基因遺傳病測定,可檢測涉及30個基因25種疾病的相關(guān)變異[15]。近期的研究表明,在地貧NIPT技術(shù)具有較好的應(yīng)用前景[16-17]。

3.1β-地貧NIPT的研究進展2002年,Chiu等[18]首次報道運用NIPT技術(shù)進行地貧產(chǎn)前診斷,利用cffDNA和特異性熒光定量PCR技術(shù),定性檢測cffDNA是否存在父源性突變基因型,通過排除父源性突變判斷檢測對象是否為重型地貧兒,這一研究開啟了地貧NIPT的道路。通過檢測cffDNA中是否存在父源性突變的方法適用于夫婦雙方攜帶不同β-地貧基因型的情況,未檢測出父源性突變則可排除胎兒為重型地貧兒,但如果檢出父源性突變位點,胎兒仍需要進行侵入性產(chǎn)前診斷以排除是否同時遺傳了母源性突變。當(dāng)夫婦雙方攜帶的β-地貧基因型相同時,以上方法則不適用。2004年,Ding等[19]報道夫婦攜帶同種β-地貧基因型的NIPT策略,先篩選出一組與父源突變基因連鎖且區(qū)別于孕婦的特異性SNP標(biāo)簽,通過檢測cffDNA是否存在特異性標(biāo)簽來判斷胎兒基因型。如何特異性識別cffDNA是NIPT最大的技術(shù)難題[20]?；贚o等[4]關(guān)于cffDNA以相對恒定的比例與母體DNA共存于孕婦外周血的理論,通過不同SNP對β-地貧基因突變位點進行捕獲,運用相對突變劑量(relative mutation dosage,RMD)分析或序列概率比檢驗方法構(gòu)建單體型相對劑量模型(Relative Haplotype Dosage, RHDO)讓NIPT識別母源性基因位點具有可行性。Xiong等[21]利用NGS技術(shù)和RMD,對49例已經(jīng)確診為父源性β-地貧遺傳性的cffDNA樣本,鑒定出48例存在母源性等位基因中,有44例(91.7%)與確診結(jié)果一致,有1例為假陽性,3例為假陰性。Saba等[22]運用NGS技術(shù)檢測37名孕婦的cffDNA,通過構(gòu)建RHDO模型實現(xiàn)對β-地貧c.118C>T的NIPT。Erlich等[16]結(jié)合目標(biāo)區(qū)域捕獲測序技術(shù)和SNP分析估計FF,綜合家系結(jié)果,推斷胎兒突變基因型,結(jié)果證實探針捕獲NGS技術(shù)在β-珠蛋白異常血紅蛋白的NIPT中具有潛在的應(yīng)用價值。

探針捕獲NGS的應(yīng)用使游離孕婦外周血中低濃度cffDNA的有效識別成為可能,這將極大推動已知突變位點的β-地貧NIPT的發(fā)展,但目前仍缺乏高靈敏性和特異性識別cffDNA的生物信息學(xué)分析方法,仍需要不斷的探索與驗證[23-24]。

3.2α-地貧NIPT的研究進展中國南方是地貧高發(fā)區(qū),常見的α-地貧突變的類型主要為缺失型,其中以--SEA基因型為主[25-28],我們前期對桂滇黔省際邊界民族地區(qū)38 812對77 624例育齡夫婦研究表明,α-地貧同型夫婦高達3414對,其中有808對夫婦有可能生育巴氏胎兒,有1849對夫婦有可能生育中間型地貧[27]。有研究人員應(yīng)用超聲技術(shù)中的頸項透明層、胎兒心胸比值、胎盤厚度、胎兒大腦中動脈血流速度、胎兒超聲心動圖等重要指標(biāo)進行無創(chuàng)性診斷巴氏水腫胎兒的研究[29-32],但是超聲技術(shù)診斷巴氏水腫胎兒特異性欠佳。因此,準(zhǔn)確的α-地貧NIPT技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用對我國南方具有重要意義。

缺失型α-地貧往往片段較大,臨床上常用gap-PCR、多重連接探針擴增和多重?zé)晒舛縋CR等技術(shù)進行檢測,用以上方法檢測高度片段化cffDNA中的大片段缺失存在很大的困難。重型α-地貧患兒的父母均為α-地貧大片段缺失,孕婦外周血漿中最大成分的母源性DNA本身含有1∶1的缺失型片段和野生型序列,父源性等位基因排除法不適用。Yan等[33]用類似Ding等[19]的策略,先篩選和設(shè)計出可特異性識別父系遺傳的SNP等位基因標(biāo)簽,對已經(jīng)進行侵入性的67例孕婦進行該策略的評估,結(jié)果有33例準(zhǔn)確排除了巴氏水腫胎,與傳統(tǒng)參考方法完全一致,有2例因溶血而結(jié)果不準(zhǔn)確,該方法在地貧NIPT的應(yīng)用上具有良好的應(yīng)用前景。Ge等[34]結(jié)合利用目標(biāo)序列捕獲測序法,通過與正常對照組比較,利用母親血漿的相對拷貝比,結(jié)合二項統(tǒng)計數(shù)值R評分(R-score)和L評分(L-score)分析,計算出胎兒拷貝數(shù)的信號,在5例--SEA純合子高風(fēng)險的胎兒進行驗證,結(jié)果提示,有1例基因型為--SEA純合缺失、2例為--SEA雜合缺失,另外兩例正常,結(jié)果與侵入性產(chǎn)前診斷一致,但是,該方法對FF要求高,加上孕婦血漿中目標(biāo)區(qū)域的捕獲特異性遠(yuǎn)不如基因組的捕獲,因此仍需要不斷進行條件的優(yōu)化。Wang等[35]基于cffDNA的原理通過靶向捕獲測序和單倍型輔助分析對兩個生育重型地貧風(fēng)險的家庭進行無創(chuàng)產(chǎn)前分析,結(jié)果證實與羊水產(chǎn)前診斷結(jié)果一致。Chen等[36]招募了59對有重型地貧胎兒風(fēng)險的夫婦,基于人群數(shù)據(jù)單倍型分析,成功推斷出94.1%胎兒等位基因,通過侵入性產(chǎn)前診斷確認(rèn)其準(zhǔn)確率達99.1%,從而認(rèn)為基于人群數(shù)據(jù)單倍型分析的地貧NIPT是一種敏感、快速、經(jīng)濟的策略。

4 結(jié)語與展望

無創(chuàng)、準(zhǔn)確、安全、簡便的產(chǎn)前診斷技術(shù)一直是遺傳性疾病診斷的方向和目標(biāo)。NGS技術(shù)的發(fā)展極大地推動了NIPT的應(yīng)用。目前,利用孕婦外周血漿中的cffDNA檢測胎兒染色體非整倍體項目已經(jīng)成熟應(yīng)用于臨床。隨著技術(shù)的不斷完善和創(chuàng)新,檢測靈敏度不斷提高,NIPT技術(shù)甚至應(yīng)用到胎兒表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因組學(xué)等各方面,利用孕母血漿進行測定獲取胎兒表達調(diào)控、拷貝數(shù)變異及微缺失/微重復(fù),從而實現(xiàn)胎兒疾病早期診斷、干預(yù)和避免患病胎兒出生的目的。但是,由于cffDNA 含量較低、地貧基因突變型別的復(fù)雜性和多樣性、技術(shù)操作的繁瑣以及數(shù)據(jù)分析復(fù)雜等問題, NIPT應(yīng)用于地貧產(chǎn)前診斷仍需要大量的探索和實驗驗證。隨著研究的不斷深入,檢測技術(shù)日趨成熟,獲取信息日益豐富,測序成本不斷降低,在不久的將來地貧無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)有望應(yīng)用于臨床。