夏枯草多倍體的誘導(dǎo)與鑒定

齊琳琳，溫春秀，劉靈娣，姜濤

（河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所/ 河北省藥用植物工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050051）

夏枯草（Prunella vulgarisL.）為唇形科夏枯草的干燥果穗[1]，又名夏枯球、棒柱頭花、六月干，因“此草夏至后即枯”而得名[2]，是常用的傳統(tǒng)中藥材之一，具有很高的藥用價(jià)值[3]，其干燥果穗具有清肝、明目、散結(jié)、消腫、止痛之功效[4，5]，還具有降糖、降壓、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗病毒等藥理作用[6]，用于治療目赤腫痛、目珠夜痛、頭痛眩暈等癥[7]。夏枯草產(chǎn)地分布于全國各地[8]，主產(chǎn)區(qū)為江蘇、安徽、浙江、河南等，其中河南省桐柏縣所產(chǎn)最優(yōu)[9]。

藥用植物多倍體由于染色體加倍，一般表現(xiàn)為植株矮壯、莖粗、葉寬厚、色深、花大、果實(shí)大、種子大而少等[10]。器官的增大提高了以相應(yīng)部位入藥的藥材產(chǎn)量。四倍體黃芩株型緊湊，葉片大且厚，生長勢旺，適應(yīng)性強(qiáng)，產(chǎn)量較普通二倍體黃芩高52.5%[11]。四倍體金銀花“九豐一號”較二倍體增產(chǎn)58.7%[12]。同時(shí)，藥用植物在誘導(dǎo)加倍后，往往能提高體內(nèi)所含藥用活性成分的含量[13]。潘平等[14]對多倍體（十六倍體）半夏與八倍體半夏原球莖中的草酸鈣晶體含量進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，多倍體中的草酸鈣含量是單倍體的1倍以上。溫春秀等[15]利用秋水仙素處理二倍體紫蘇幼苗生長點(diǎn)，選育出四倍體紫蘇新品種“多紫2 號”，其葉片揮發(fā)油含量達(dá)到0.79%，莖中迷迭香酸含量達(dá)1.34%，藥用成分含量明顯高于二倍體紫蘇。夏枯草由于具有重要的藥用價(jià)值和廣泛的藥理作用，越來越受到人們的關(guān)注。因此，誘導(dǎo)夏枯草染色體加倍，培育夏枯草優(yōu)良多倍體株系具有重要意義。

多年來，國內(nèi)外學(xué)者對夏枯草進(jìn)行了廣泛研究，尤其是在化學(xué)成分和藥理作用方面進(jìn)行了較為深入的探討[16]。但截至目前，針對夏枯草種質(zhì)資源倍性的系統(tǒng)研究尚未見報(bào)道。本研究采用秋水仙素處理植株生長點(diǎn)誘導(dǎo)染色體加倍的方法，通過流式細(xì)胞術(shù)和根尖染色體鑒定獲得了5 個(gè)夏枯草多倍體株系，為新品種選育提供了種質(zhì)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物試材為河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所藥用植物研究中心用夏枯草種子繁育的幼苗。

試驗(yàn)儀器主要有D3024R 賽洛捷克離心機(jī)（廣州碩譜生物科技有限公司）、CytoFLEX 流式細(xì)胞儀（貝克曼庫爾特）、BCD-315TNGS 冰箱（青島海爾股份有限公司）、B-260 恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）、Nikon E100 顯微鏡（廣州市明美光電技術(shù)有限公司）、Waters2695-2998 高效液相色譜儀（杭州瑞析科技有限公司）、PR124ZHZ 電子天平（奧豪斯儀器有限公司）、數(shù)顯游標(biāo)卡尺（桂林量具有限責(zé)任公司）和FW100 高速粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

試劑主要有秋水仙素（源葉生物，生物技術(shù)級，含量98%）、DAPI 染色液（北京博奧拓達(dá)科技有限公司，1 mg/mL）、RNA 酶（北京博奧拓達(dá)科技有限公司，活性＞50～100 U/mg）、無水乙醇（天津市優(yōu)譜化學(xué)試劑有限公司，分析純）、冰乙酸（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，含量99.5%）、鹽酸（北京化工廠，分析純）、改良石碳酸復(fù)紅染色液（北京索萊寶科技有限公司）、Tris-HCl 緩沖液（北京索萊寶科技有限公司，1 mol/L，pH 值7.5）、KCL（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純）、NaCl（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純）、EDTA-Na2（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純）、C2H6OS（北京索萊寶科技有限公司，純度≥99.0%）和TritonX-100（北京索萊寶科技有限公司，分析純）。

1.2 試驗(yàn)方法

采用秋水仙素處理幼苗生長點(diǎn)的方法，誘導(dǎo)夏枯草多倍體的產(chǎn)生；通過植株形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞術(shù)鑒定、根尖染色體鑒定對其變異株進(jìn)行倍性鑒定，并對不同濃度與處理時(shí)間的植株誘變效果進(jìn)行比較；對大田生長的變異株與對照植株的迷迭香酸含量進(jìn)行比較。

1.2.1 多倍體植株誘導(dǎo) 夏枯草幼苗長出第2 對真葉時(shí)，將脫脂棉球用秋水仙素溶液濕透后貼敷在幼苗生長點(diǎn)上進(jìn)行誘導(dǎo)處理，試驗(yàn)秋水仙素濃度設(shè)0.05%、0.10%、0.20%、0.30%和0.40%計(jì)5 個(gè)處理；以后每天9：00 和16：00 均在棉球上滴1 次相應(yīng)處理濃度的秋水仙素溶液，使棉球濕透，分別在處理后的第3、第4 和第5 天去掉棉球。以不添加秋水仙素處理為對照（CK）。每處理100 株幼苗，3 次重復(fù)。去掉棉球2 周后，觀察并記錄夏枯草幼苗的成活數(shù)量。計(jì)算幼苗死亡率。

1.2.2 多倍體植株鑒定 多倍體植株鑒定程序?yàn)椋翰捎弥仓晷螒B(tài)學(xué)鑒定法篩選目標(biāo)植株—采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定法初步得到變異植株—采用根尖染色體鑒定法對變異植株進(jìn)行明確。

1.2.2.1 植株形態(tài)學(xué)鑒定。將秋水仙素處理后長出新芽的夏枯草植株與對照植株進(jìn)行比較，依據(jù)葉片變厚、葉色變綠、葉片皺縮、植株生長緩慢等多倍體植株的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，篩選目標(biāo)植株。記錄目標(biāo)植株的數(shù)量。

1.2.2.2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定。取夏枯草待檢測植株第2對真葉以上的幼嫩葉片1 cm2置于培養(yǎng)皿中，加提取緩沖液（按表1 配方取各成分，加去離子水至1 000 mL，pH 值7.5，用300 目尼龍網(wǎng)過濾2 遍，4℃儲(chǔ)存）1.5mL，用鋒利的刀片將葉片迅速垂直切碎，然后用300 目濾網(wǎng)過濾到1.5mL 離心管中，得到細(xì)胞懸浮液；1000r/min離心3 min，倒出上清液，向管中分別加入提取緩沖液和DAPI 染液（染液中加入適量RNA 酶，排除雙鏈RNA 的干擾，濃度為50 μg/mL）各50 μL，混勻后避光染色1 min，利用流式細(xì)胞儀對植株倍性進(jìn)行初步檢測，熒光通道選擇PB450-A。記錄變異植株的編號和數(shù)量。

表1 提取緩沖液的配方Table 1 Formula of extracting buffer

1.2.2.3 根尖染色體鑒定。將變異株系和對照株系的幼苗移栽入試驗(yàn)田，在相同條件下培養(yǎng)。待植株成熟收獲果穗后，取其種子進(jìn)行催芽，采用壓片法進(jìn)行根尖染色體檢測。選擇夏枯草幼根根尖分裂最活躍的時(shí)期（8：00～11：00）取其根尖1 cm 左右，置于冰水混合物中于4 ℃冰箱中預(yù)處理24 h。用卡諾固定液〔V（95%乙醇）：V（冰醋酸）＝3 ∶1〕處理24 h，流動(dòng)水洗2～3 次；在1 mol/L 的稀鹽酸中解離，60 ℃恒溫水浴5 min 左右，流動(dòng)水洗2～3 次。吸干根表面的水分后切取長1～3 mm 的分生組織，用改良石碳酸復(fù)紅染色液染色20 min 左右，壓片。使用Nikon E100 光學(xué)顯微鏡鏡檢、拍照，觀察染色體數(shù)目。變異植株的染色體數(shù)目較對照植株染色體數(shù)目成倍增加的，即確定為多倍體植株。記錄多倍體植株的編號和數(shù)量。計(jì)算誘導(dǎo)率（變異植株數(shù)量/目標(biāo)植株數(shù)量×100%）。

1.2.3 多倍體植株的選育 通過農(nóng)藝性狀比較和藥用成分含量分析，進(jìn)行夏枯草多倍體植株的選育。

1.2.3.1 農(nóng)藝性狀調(diào)查。經(jīng)鑒定為多倍體的株系，育苗后移栽入試驗(yàn)田，進(jìn)行連續(xù)多年的田間篩選鑒定。6 月下旬夏枯草開花期，用直尺測量葉片大小，用游標(biāo)卡尺測量花冠大小，用電子天平稱量4 cm2葉片的重量（表示葉片厚度）；10 月下旬植株成熟收獲果穗后，用游標(biāo)卡尺測量果穗和種子的大小，用電子天平稱量1 000 粒種子的重量。選育出多倍體性狀特征明顯、農(nóng)藝性狀較好的株系進(jìn)一步擴(kuò)大繁殖，以便進(jìn)行品種比較試驗(yàn)和示范推廣應(yīng)用。

1.2.3.2 藥用成分含量分析。移入田間的多倍體植株和對照植株果穗采收后，用高速粉碎機(jī)磨成粉狀，采用高效液相色譜法[5]測定迷迭香酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素不同濃度與時(shí)長處理的夏枯草誘導(dǎo)效果

秋水仙素不同濃度與時(shí)長處理的夏枯草幼苗存活數(shù)和突變數(shù)差異較大，其中0.05%秋水仙素處理誘導(dǎo)夏枯草染色體加倍的成功率較高，且致死率低；該濃度下，處理時(shí)長4 d 的效果最好，致死率為46.00%，誘導(dǎo)率為16.00%（表2）。

表2 秋水仙素不同濃度與時(shí)長處理的誘導(dǎo)效果Table 2 Induction effects of colchicine with different concentrations and duration

2.2 四倍體夏枯草的鑒定

2.2.1 流式細(xì)胞術(shù)鑒定 該鑒定法制樣簡單、靈敏度高、分辨率高、準(zhǔn)確性好，且數(shù)據(jù)的可重復(fù)性好、測試速度快、植物損傷性小，目前已成為倍性鑒定的主要方法，尤其適合大量樣品的染色體倍性分析[7]。流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果（圖1）顯示，對照植株的二倍體峰值處于30×104道附近；四倍體植株的四倍體峰值處于60×104道左右，約為對照的2 倍?？梢钥闯觯逯党霈F(xiàn)與染色體倍性關(guān)系準(zhǔn)確。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果Fig.1 Results of flow cytometry

2.2.2 根尖染色體鑒定 根尖染色體鑒定結(jié)果（圖2）顯示，夏枯草二倍體植株的根尖染色體數(shù)目為2n=2x=28；四倍體植株的根尖染色體數(shù)目為2n=4x=56，增加了1 倍?？梢钥闯?，四倍體植株的根尖染色體數(shù)目明顯多于二倍體植株。

圖2 根尖染色體數(shù)目鑒定結(jié)果Fig.2 Identification results of root tip chromosomes

2.3 四倍體夏枯草的選育

2.3.1 四倍體夏枯草的田間農(nóng)藝性狀 四倍體夏枯草植株的各農(nóng)藝性狀與二倍體植株相比均發(fā)生了明顯變化（表3），田間表現(xiàn)為葉片厚大、葉片泡皺程度較強(qiáng)（圖3）、果穗短粗（圖4）、種子明顯較大（圖5）。

圖3 二倍體與四倍體夏枯草的葉片比較Fig.3 Comparison of leaf between diploid and tetraploid P.vulgaris

圖4 二倍體與四倍體夏枯草的果穗比較Fig.4 Comparison of ear between diploid and tetraploid P.vulgaris

圖5 二倍體與四倍體夏枯草的種子比較Fig.5 Comparison of seed between diploid and tetraploid P.vulgaris

表3 二倍體與四倍體夏枯草的農(nóng)藝性狀比較Table 3 Comparison of agronomic characters between diploid and tetraploid P.vulgaris

2.3.2 四倍體夏枯草的藥用成分含量 依據(jù)《中國藥典》對四倍體夏枯草株系的迷迭香酸含量進(jìn)行檢測，結(jié)果（圖6）顯示，四倍體植株的迷迭香酸含量高于二倍體株系，且明顯高于《中國藥典》 含量標(biāo)準(zhǔn)（0.020%），最高含量達(dá)到2.23%。

圖6 二倍體與四倍體夏枯草迷迭香酸含量的比較Fig.6 Comparison of rosmarinic acid content between diploid and tetraploid P.vulgaris

3 結(jié)論與討論

自然界多倍體雖然分布廣泛，但數(shù)量有限[17]，因此，需要采用人工誘導(dǎo)的方法獲得多倍體品種。目前在多倍體育種中，秋水仙素是應(yīng)用較為廣泛的化學(xué)試劑之一[18]。本研究利用秋水仙素作為誘變劑，對夏枯草幼苗生長點(diǎn)進(jìn)行了不同濃度和時(shí)長處理，以誘導(dǎo)率高且致死率低為目標(biāo)，對秋水仙素溶液處理的適宜濃度和時(shí)長進(jìn)行篩選，結(jié)果表明，秋水仙素溶液處理的最佳濃度為0.05%、最佳時(shí)長為4 d，該條件下多倍體誘導(dǎo)率最高達(dá)到16.00%、致死率最低為46.00%。經(jīng)農(nóng)藝性狀調(diào)查和藥用成分含量檢測，得到四倍體夏枯草優(yōu)良株系5 個(gè)，分別為X33-35、X88-67、X39-31、X12-2 和X88-37。與二倍體植株相比，四倍體植株葉片厚大、皺縮，葉色濃綠，果穗短粗，種子大且飽滿，藥用成分含量高，為新品種選育提供了種質(zhì)材料。

本試驗(yàn)獲得的夏枯草多倍體植株，將開展多年連續(xù)單株收種、株行種植，并進(jìn)行田間性狀觀察，以獲得穩(wěn)定的多倍體株系；同時(shí)，對穩(wěn)定株系開展生物學(xué)特性、農(nóng)藝性狀、營養(yǎng)成分及藥用成分等方面的比較分析，以產(chǎn)量和藥用成分含量作為核心選育目標(biāo)，以期選育出優(yōu)良的多倍體新品系。