馮亞文,張秋娜,吳 蘭,陳 靜,張 娜,李會(huì)平,張培訓(xùn),安莎莎,孔紅君

(1.河北省獸藥飼料工作總站,石家莊 050000;2.保定冀中生物科技有限公司,河北 保定 071000;3.保定冀中藥業(yè)有限公司,河北 保定 071500; 4.河北省中獸藥技術(shù)創(chuàng)新中心,河北 保定 071500)

玉屏風(fēng)口服液源于元代《丹溪心法》,具有益氣固表,提高機(jī)體免疫力的功能;主治表虛不固,易感風(fēng)邪。由保定冀中藥業(yè)有限公司研制生產(chǎn)的玉屏風(fēng)口服液于2010年獲得新獸藥證書,至今上市已超過12年,現(xiàn)收錄于《中華人民共和國獸藥典》2020年版二部。

該制劑臨床使用安全有效,但隨著時(shí)代的發(fā)展,其原有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也需要進(jìn)一步優(yōu)化提升。查閱文獻(xiàn),近年來,廣大學(xué)者[1-8]對(duì)玉屏風(fēng)散、玉屏風(fēng)口服液、玉屏風(fēng)顆粒等人用藥品進(jìn)行深入的多指標(biāo)含量測(cè)定及指紋圖譜研究,多集中于黃酮-色原酮藥效物質(zhì)群。可見其原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載的黃芪甲苷的含量測(cè)定過于片面,無論是藥效還是物質(zhì)基礎(chǔ)都已不能滿足對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)提升的需求。

研究中,采用高效液相色譜(HPLC)法同時(shí)對(duì)玉屏風(fēng)口服液中的升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷及毛蕊異黃酮葡萄糖苷進(jìn)行定量檢測(cè),同時(shí)優(yōu)化原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的薄層鑒別項(xiàng),為全面提升玉屏風(fēng)口服液的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù),也實(shí)現(xiàn)了提升產(chǎn)品品質(zhì)、保證療效、提高養(yǎng)殖戶用藥認(rèn)可度的目標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試藥 e2695高效液相系統(tǒng),2489UV檢測(cè)器,Empower3色譜工作站(美國Waters公司)、CPA225D電子分析天平(德國Sartorius公司)。色譜柱:SymmetryC18(5 μm 4.6×250 mm)。

標(biāo)準(zhǔn)品:升麻素苷(批號(hào):111522-201913,純度為94.6%)、5-O-甲基維斯阿米醇苷(批號(hào):111523-201811,純度為97.4%)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號(hào):111920-201907,純度為96.8%)均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈(Merck公司,色譜純),磷酸(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司,色譜純),水為超純水。

玉屏風(fēng)口服液樣品共計(jì)6批,保定冀中藥業(yè)有限公司3批,批號(hào)為202201002、202205003、202205004;保定冀中生物科技有限公司3批,批號(hào)為202201001、202202005、202201002。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱(5 μm 4.6 mm×250 mm);乙腈為流動(dòng)相A,0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相B。按表1梯度洗脫;檢測(cè)波長為254 nm,流速:1.0 mL/min,柱溫:30 ℃;進(jìn)樣體積10 μL。

表1 梯度洗脫方法Tab 1 Gradient elution method

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別取升麻素苷對(duì)照品、5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品適量,精密稱定,加50%甲醇定容至刻度,制得濃度分別為400、400、200 μg/mL的儲(chǔ)備液。再分別精密量取各個(gè)對(duì)照品儲(chǔ)備液,加50%甲醇制成每1 mL含升麻素苷20 μg、5-O-甲基維斯阿米醇苷20 μg、毛蕊異黃酮葡萄糖苷10 μg的混合對(duì)照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備 取玉屏風(fēng)口服液2 mL,置25 mL容量瓶中,加50%甲醇定容至刻度,搖勻,用0.22 μm濾膜過濾,取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.2.4 陰性玉屏風(fēng)口服液的制備 參照《中華人民共和國獸藥典》2020版二部,分別制備缺黃芪和缺防風(fēng)的陰性玉屏風(fēng)口服液。

2 結(jié)果和分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 專屬性 通過對(duì)比玉屏風(fēng)口服液樣品和自行制備的陰性樣品,記錄色譜圖,結(jié)果表明在與升麻素苷對(duì)照品(保留時(shí)間9.842 min)、5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品(保留時(shí)間21.543 min)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品(保留時(shí)間14.390 min)保留時(shí)間一致處,玉屏風(fēng)口服液中均見相對(duì)應(yīng)的色譜峰。同時(shí)各陰性樣品在與3種對(duì)照品保留時(shí)間一致處無干擾,見圖1～圖4。因此,該方法的專屬性良好。

圖1 混合對(duì)照品高效液相色譜圖Fig 1 HPLC of mixed standards

圖2 玉屏風(fēng)口服液高效液相色譜圖Fig 2 HPLC of Yupingfeng Oral Liquid

圖3 缺防風(fēng)陰性樣品高效液相色譜圖Fig 3 HPLC of negative Fangfeng sample

圖4 缺黃芪陰性樣品高效液相色譜圖Fig 4 HPLC of negative Huangqi sample

2.1.2 線性 精密稱取升麻素苷對(duì)照品、5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品適量,精密稱定,分別加50%甲醇制成每1 mL含升麻素苷381 μg、含5-O-甲基維斯阿米醇苷354 μg、含毛蕊異黃酮葡萄糖苷203 μg的對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液,備用。

分別取三種儲(chǔ)備液各1 mL分別置100、50、20、10、5 mL容量瓶中,加50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,制成線性1～5的混合對(duì)照品溶液;分別取三種儲(chǔ)備液各3 mL,置10 mL容量瓶中,加50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,制成線性6的混合對(duì)照品溶液,即得升麻素苷濃度為3.81、7.62、19.05、38.10、76.20、114.30,5-O-甲基維斯阿米醇苷濃度為3.54、7.08、17.70、35.40、70.80、106.20,毛蕊異黃酮葡萄糖苷濃度為2.03、4.06、10.15、20.30、40.60、60.90 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。照1.2.1液相條件測(cè)定,并計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù),見表2。

表2 三種對(duì)照品的線性關(guān)系考察Tab 2 Linear relationship investigation of three comparasites

2.1.3 精密度 取供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定。經(jīng)計(jì)算升麻素苷對(duì)照品、5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品的峰面積RSD分別為0.94%、0.95%、0.86%,表明該方法精密度良好。

2.1.4 重復(fù)性 按1.2.3項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液,測(cè)得該批產(chǎn)品中黃升麻素苷對(duì)照品、5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品的平均含量分別為0.156、0.230、0.121 mg/mL,RSD分別為0.57%、0.43%、0.62%,結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.1.5 溶液穩(wěn)定性 取2.1.4項(xiàng)下的同一份供試品溶液,分別于0、4、6、8、10、12、18、24 h進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD分別為1.77%、1.67%、1.70%,結(jié)果表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 準(zhǔn)確度 精密量取已知含量的玉屏風(fēng)口服液1 mL,置25 mL容量瓶中,加入0.156 mg/mL的升麻素苷對(duì)照品溶液,0.230 mg/mL的5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品溶液和0.121 mg/mL的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液各1 mL,加50%甲醇定容至刻度,搖勻,過濾,即得。照上述供試品方法制備6份供試品溶液,照1.2.1所述方法進(jìn)行測(cè)得,計(jì)算平均加樣回收率,結(jié)果見表3。3種物質(zhì)的加樣回收率均在96%～102%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.0%。

表3 玉屏風(fēng)口服液3種成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab 3 Recovery results of 3 compands in Yupingfeng oral liquid(n=6)

2.2 含量測(cè)定 分別取升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品和毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品適量,加50%甲醇稀釋成每1 mL含升麻素苷20 μg、5-O-甲基維斯阿米醇苷20 μg、毛蕊異黃酮葡萄糖苷10 μg的混合對(duì)照品溶液。按照“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,供試品溶液和對(duì)照品溶液各進(jìn)10 μL,以“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè),記錄色譜圖,計(jì)算含量,結(jié)果見表4。

表4 樣品測(cè)定結(jié)果Tab 4 The results of the sample content

3 討論與結(jié)論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)來源與追溯 玉屏風(fēng)口服液歷次標(biāo)準(zhǔn)修訂過程中,主要是對(duì)【鑒別】(1)(3)進(jìn)行了修訂,《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2017年版中藥卷刪除【鑒別】(3)“采用5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品HPLC法鑒別防風(fēng)”,在【鑒別】(1)增加了“采用5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品用于TLC法防風(fēng)的鑒別”,并沿用至今,具體見表5。

表5 玉屏風(fēng)口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比表Tab 5 The Comparison table of the Yupingfeng oral liquid

本研究中,注重藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的關(guān)系,擬將防風(fēng)、黃芪中的有效成分升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷及毛蕊異黃酮葡萄糖苷進(jìn)行定量檢測(cè),同時(shí)用于薄層鑒別研究,進(jìn)一步豐富了檢測(cè)指標(biāo),提升了質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 全面性 相比單一指標(biāo)性成分(黃芪甲苷),藥效組分群含量測(cè)定可更好地表達(dá)玉屏風(fēng)口服液的總體功效。查閱大量文獻(xiàn),發(fā)現(xiàn)玉屏風(fēng)制劑中的研究多集中在黃酮-色原酮組分群[1-3],黃酮-色原酮-內(nèi)酯組分群[4-7],目標(biāo)成分多見于毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、芒柄花苷、芒柄花素、白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯II、白術(shù)內(nèi)酯III,共計(jì)11種。

在諸多成分中,申亞君[8]等通過建立玉屏風(fēng)散的HPLC指紋圖譜,分別對(duì)上述11種成分進(jìn)行進(jìn)行聚類分析(HCA)、主成分分析(PCA)發(fā)現(xiàn),各批次樣品之間的質(zhì)量差異導(dǎo)致15批樣品聚為2類,并進(jìn)一步通過正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)得出毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷是對(duì)玉屏風(fēng)散整體質(zhì)量影響較大的5種成分。但是鑒于前期研究中發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮、芒柄花素均低于0.05 mg/mL,因此本研究中僅對(duì)毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷的含量測(cè)定進(jìn)行研究。

3.3 與藥效相關(guān)性 毛蕊異黃酮葡萄糖苷(CG)是黃芪藥材中的異黃酮成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,CG能夠明顯對(duì)抗4刀豆蛋白A(ConA)誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖和脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞毒性,具有免疫抑制和抗炎作用[9]。姜文月等[10]采用Spearman雙變量相關(guān)分析對(duì)化學(xué)成分與其增強(qiáng)免疫藥效的譜效相關(guān)性進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)CG含量與脾臟指數(shù)呈顯著正相關(guān),是有免疫增強(qiáng)功能的主要藥效物質(zhì)。此外,CG還具有抗炎、抗腫瘤等多種藥理功效。

3.4 結(jié)論 綜上所述,本方法采用高效液相色譜(HPLC)法同時(shí)對(duì)玉屏風(fēng)口服液中的黃芪和防風(fēng)進(jìn)行定量分析,經(jīng)驗(yàn)證定量準(zhǔn)確、快速、重復(fù)性好,為提升玉屏風(fēng)口服液質(zhì)量控制的全面性提供了方法。