鹿欣雨,高 敏,李海燕,李丹鳳,黃鳳霞,王 琳

(1西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中心,西安 710021;2西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院;3西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院化學(xué)實(shí)驗(yàn)中心;*通訊作者,E-mail：luxyu28nn@163.com)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種慢性、復(fù)發(fā)性腸道炎癥疾病,臨床癥狀以腹瀉、發(fā)燒、腹痛、血便、食欲下降和體質(zhì)量減輕為主,直腸和結(jié)腸黏膜反復(fù)出現(xiàn)的炎癥性病變可能會(huì)引發(fā)結(jié)腸癌[1]。UC的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,炎癥和氧化應(yīng)激在UC的疾病進(jìn)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[2]。免疫系統(tǒng)的失衡會(huì)促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生[3,4],進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素17(IL-17)、干擾素γ(IFN-γ)等促炎性細(xì)胞因子的釋放,最終加重氧化應(yīng)激和腸上皮細(xì)胞損傷[5]。

目前UC的常規(guī)治療藥物具有一定的局限性和副作用[6],而天然植物提取物療效更高,副作用更小[7,8]。石榴皮富含多酚類化合物,主要由酚酸、鞣質(zhì)和類黃酮組成,為我國傳統(tǒng)中藥,具有治療腹瀉、痢疾、感染性炎癥等作用[9,10]。據(jù)報(bào)道,在刀豆球蛋白A誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎小鼠模型中石榴皮提取物(pomegranate peel extract,PPE)能減輕肝臟炎癥并降低TNF-α、IFN-γ和IL-6的分泌[11];本課題組前期研究表明,在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠模型中,口服PPE能通過降低中樞和外周CD4+IL-17+、CD4+IFN-γ+等炎性細(xì)胞因子的分泌,增加免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)來減輕EAE的嚴(yán)重程度[12],然而,PPE在UC中的潛在價(jià)值還需進(jìn)一步挖掘。本研究旨在探討PPE對(duì)葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導(dǎo)的UC小鼠的治療作用和分子機(jī)制,為PPE在UC治療中的作用提供藥理學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周雌性C57BL/6小鼠購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010,小鼠適應(yīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室4 d,飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物室,濕度40%～60%,溫度(20±5)℃,并提供標(biāo)準(zhǔn)食品和蒸餾水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)編號(hào)：XYLS2023085),并按照批準(zhǔn)的機(jī)構(gòu)指南和規(guī)定進(jìn)行。

1.1.2 主要試劑與儀器 石榴皮來源于陜西臨潼農(nóng)家石榴園石榴PunicagranatumL.的干燥果皮。福林酚試劑購自北京索萊寶科技有限公司;安石榴苷、沒食子酸、鞣花酸(分析對(duì)照品,HPLC≥98%)購自成都德斯特生物技術(shù)有限公司;葡聚糖硫酸鈉、糞便隱血試劑盒購自上海翌圣生物科技有限公司;RNA樣本保存液、細(xì)胞/組織RNA快速提取試劑盒購自北京聚合美生物科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄酶、SYBR Green qPCR Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。高效液相色譜儀購于美國Thermo公司,正置顯微鏡購于德國Leica公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PPE的制備及總酚含量測(cè)定 新鮮石榴皮經(jīng)水清洗烘干粉碎,過濾得石榴皮粉末。稱取石榴皮粉末1 g置于50 mL離心管中,加入30 mL 60%乙醇溶液,靜置過夜后進(jìn)行超聲波輔助提取30 min并離心,收集上清液在40 ℃水浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),將旋蒸后的液體置于-80 ℃中冷凍48 h后用冷凍干燥機(jī)冷凍烘干得到PPE粉末。采用Folin-Ciocalteau法計(jì)算PPE總酚含量[13],取沒食子酸對(duì)照品溶液,配制成濃度為0.01,0.02,0.03,0.04,0.05 mg/mL的對(duì)照品溶液。分別取不同濃度的沒食子酸對(duì)照品溶液和PPE溶液0.8 mL置于10 mL棕色容量瓶,依次加入4 mL蒸餾水、0.4 mL福林酚試劑、4.8 mL 29%的碳酸鈉溶液,充分混合,靜置30 min后在760 nm的波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度。縱坐標(biāo)表示吸光度,橫坐標(biāo)表示濃度,制備沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算線性方程。

1.2.2 高效液相色譜法分析PPE成分 根據(jù)對(duì)照品在檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm處響應(yīng)值高低的不同,將沒食子酸、安石榴苷、鞣花酸對(duì)照品以適當(dāng)比例混合,配制成混合對(duì)照品溶液。精密稱定10 mg PPE粉末,加10 mL甲醇超聲溶解,搖勻?yàn)V過,即得樣品溶液。賽默飛高效液相色譜儀U3000,色譜柱Waters Symmetry-C18(4.6 mm×250 mm,5.0 μm),流動(dòng)相分別為：A-乙腈,B-0.1%磷酸水溶液,洗脫程序[14]：0～35 min 2%～8% A,35～47 min 8%～18% A,47～55 min 18%～20% A,柱溫35 ℃,進(jìn)樣量3 μL,流速1.0 mL/min。

1.2.3 動(dòng)物分組及處理 將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、PPE低劑量組和PPE高劑量組,每組6只。正常組小鼠自由用水。模型組和PPE各組小鼠均連續(xù)7 d給予3%的DSS飲用水,第8天接受正常飲用水。從DSS造模給藥第1天起,正常組和模型組每日均以蒸餾水灌胃,PPE各組分別給予200 mg/kg和400 mg/kg的PPE灌胃,連續(xù)10 d,每日固定時(shí)間給藥1次。第11天結(jié)束實(shí)驗(yàn)脫頸處死小鼠,迅速取出結(jié)腸并測(cè)量其長(zhǎng)度;取1 cm的遠(yuǎn)端結(jié)腸進(jìn)行蘇木精和伊紅染色(hematoxylin-eosin,HE);取部分結(jié)腸組織置于裝有RNA保存液的離心管,存于-80 ℃進(jìn)行RT-qPCR,檢測(cè)TNF-α、IL-17A、IFN-γ的表達(dá)水平;再取部分結(jié)腸組織于-80 ℃保存,后續(xù)檢測(cè)氧化應(yīng)激標(biāo)志物。

1.2.4 疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)估 從造模第1天起,每天對(duì)小鼠的體質(zhì)量、大便性狀和血便進(jìn)行記錄和評(píng)分。根據(jù)疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index,DAI)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[15](見表1),兩名實(shí)驗(yàn)人員對(duì)造模小鼠進(jìn)行雙盲評(píng)分,最終取體質(zhì)量下降百分比、大便性狀和血便評(píng)分的平均值作為DAI評(píng)分,并統(tǒng)計(jì)評(píng)分結(jié)果。

表1 DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表2 RT-qPCR引物序列

1.2.5 RT-qPCR檢測(cè)結(jié)腸炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-17A、IFN-γ)的表達(dá) 按動(dòng)物/組織RNA提取試劑盒說明書步驟提取RNA,并用核酸蛋白儀(Nono-

1.2.6 HE檢測(cè)各組小鼠結(jié)腸組織的病理變化 結(jié)腸組織用4%多聚甲醛固定,經(jīng)脫水和包埋后用石蠟輪轉(zhuǎn)切片機(jī)切為6 μm薄片,結(jié)腸切片用HE進(jìn)行組織學(xué)分析,在光學(xué)顯微鏡下觀察切片并拍照分析。組織學(xué)評(píng)分0～4分,依據(jù)為上皮損傷(0分,無組織損傷;1分,局部損傷;2分,中度損傷,3分,重度損傷)、隱窩損失(0分,無損失;1分,輕度;2分,中度;3分,重度;4分,無隱窩)、絨毛損傷(0分,無;1分,輕度;2分,中度;3分,重度;4分,完全損傷)、炎癥細(xì)胞浸潤程度(0分,無;1分,隱窩周圍輕度浸潤;2分,黏膜肌層出現(xiàn)浸潤;3分,黏膜肌層普遍浸潤;4分,嚴(yán)重浸潤)[16]。

1.2.7 結(jié)腸組織氧化應(yīng)激標(biāo)志物(MDA、SOD、GPX)活性測(cè)定 結(jié)腸組織用生理鹽水勻漿,3500 r/min,4 ℃下離心10 min收集上清。結(jié)腸中MDA、SOD、GPX活性根據(jù)試劑盒方法測(cè)定。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 8統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖和分析,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PPE總酚含量及主要成分分析

沒食子酸對(duì)照品溶液濃度在0.01～0.05 mg/mL線性關(guān)系良好,標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=2.150 2x+0.052 1,R2=0.998 6,測(cè)得PPE中總酚含量為(295.76±3.15)mg/g。PPE樣品色譜圖與混合對(duì)照品色譜圖對(duì)比顯示樣品中含有沒食子酸、安石榴苷及鞣花酸,其中安石榴苷以同分異構(gòu)體(安石榴苷A和B)存在(見圖1),化合物色譜信息分析結(jié)果顯示安石榴苷峰面積的百分比最高(見表3)。

注：1.沒食子酸;2.安石榴苷A;3.安石榴苷B;4.鞣花酸。圖1 混合對(duì)照品和PPE樣品色譜結(jié)果Figure 1 Chromatogram of mix-standard sample and PPE sample

表3 PPE樣品色譜信息

2.2 PPE對(duì)UC小鼠體質(zhì)量、DAI指數(shù)和結(jié)腸長(zhǎng)度的影響

與正常組相比,模型組和PPE各組小鼠從DSS造模給藥第3天開始陸續(xù)呈現(xiàn)活動(dòng)減少、軟便、腹瀉和體質(zhì)量下降趨勢(shì),表明UC模型已成功建立。與正常組相比,模型組小鼠體質(zhì)量降低(P<0.01),DAI指數(shù)增加(P<0.000 1),結(jié)腸長(zhǎng)度縮短(P<0.01);在第7天時(shí),與模型組相比,PPE低劑量組和高劑量組體質(zhì)量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),DAI指數(shù)均降低(P<0.01);在第11天時(shí),與模型組相比,PPE低劑量組體質(zhì)量下降程度緩解(P<0.01),PPE高劑量組體質(zhì)量仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),DAI指數(shù)均降低(P<0.01,見圖2)。此外,與模型組與相比,PPE低劑量組和高劑量組小鼠結(jié)腸縮短程度均得到明顯改善(P<0.05,見圖2)。提示PPE能緩解結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度。

注：與正常組比較,**P<0.01,****P<0.000 1;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001。圖2 PPE對(duì)UC小鼠體質(zhì)量、DAI指數(shù)和結(jié)腸長(zhǎng)度的影響Figure 2 Effects of PPE on body weight, DAI score, and colon length in mice with DSS-induced colitis

2.3 PPE對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)的影響

正常組小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞和隱窩結(jié)構(gòu)完整,杯狀細(xì)胞沒有減少,組織學(xué)評(píng)分也最低;與正常組相比,模型組出現(xiàn)上皮損傷、杯狀細(xì)胞丟失、炎性細(xì)胞浸潤、隱窩結(jié)構(gòu)破壞情況,組織學(xué)評(píng)分較高(P<0.000 1);與模型組相比,PPE低劑量組和高劑量組小鼠黏膜損傷較少,隱窩結(jié)構(gòu)破壞程度減輕,炎性細(xì)胞浸潤明顯減少,組織學(xué)評(píng)分降低(P<0.05,見圖3)。由此可見,PPE對(duì)UC小鼠結(jié)腸黏膜損傷有明顯的改善作用。

2.4 PPE對(duì)炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響

與正常組相比,模型組TNF-α、IL-17A和IFN-γ的表達(dá)水平增加(P<0.05);與模型組相比,PPE低劑量組和高劑量組結(jié)腸組織中TNF-α、IL-17A和IFN-γ的表達(dá)水平均下調(diào)(P<0.05,見圖4)。以上結(jié)果表明PPE給藥可以有效逆轉(zhuǎn)炎性細(xì)胞因子的異常產(chǎn)生。

注：與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001。圖4 PPE對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織促炎細(xì)胞因子的影響Figure 4 Effects of PPE on pro-inflammatory cytokines in colon tissues of mice with DSS-induced colitis

2.5 PPE對(duì)氧化應(yīng)激標(biāo)志物的影響

與正常組相比,模型組小鼠結(jié)腸組織中MDA濃度升高(P<0.01),SOD和GPX活性降低(P<0.01);與模型組相比,PPE低劑量組和高劑量組小鼠結(jié)腸MDA水平均明顯降低(P<0.01),SOD水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),同時(shí)PPE低劑量組小鼠GPX水平增加(P<0.05),而PPE高劑量組GPX活性未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05,見圖5)。表明PPE可以通過降低MDA水平、增加SOD和GPX活性來抑制氧化應(yīng)激。

3 討論

UC是一種常見的胃腸道疾病,由于其病因的復(fù)雜性,預(yù)防和治療該疾病的有效方法仍然很有限。因此,迫切需要開發(fā)新的安全有效的治療藥物。石榴皮來源天然,安全性較高,具有極高的開發(fā)價(jià)值。本研究表明PPE能明顯改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠的DAI評(píng)分、結(jié)腸長(zhǎng)度縮短和組織病理學(xué)損傷情況,且低劑量的PPE(200 mg/kg)改善UC的治療效果更為顯著,我們推測(cè)可能由于PPE中所含的有效成分在高濃度時(shí)會(huì)刺激腸道從而減弱UC的治療效果。

炎性細(xì)胞因子的分泌在腸道免疫系統(tǒng)和UC的病理生理中起著關(guān)鍵作用。巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞來源的TNF-α在UC中具有刺激中性粒細(xì)胞并啟動(dòng)其他細(xì)胞因子分泌的作用[17];Yang等[18]證實(shí)IFN-γ信號(hào)通路及其核心基因在UC表型中上調(diào)并促進(jìn)免疫炎癥反應(yīng)的加重;IL-17A是一種有效的促炎細(xì)胞因子,可通過促其他炎癥介質(zhì)(如TNF-α、IL-6)的釋放以及誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞相關(guān)基因參與炎癥過程[19]。因此,抑制這些促炎細(xì)胞因子的分泌可以減輕UC。據(jù)報(bào)道許多植物提取的多酚可以降低炎性細(xì)胞因子的水平,從而減弱炎癥反應(yīng),例如,咖啡櫻桃殼多酚、紫山藥多酚、青豌豆殼多酚提取物通過降低DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸組織中IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17A等其他促炎細(xì)胞因子的水平來改善結(jié)腸炎[20-22]。本研究結(jié)果與此一致的是,與模型組相比,PPE低劑量組和高劑量組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IFN-γ、IL-17A水平降低,表明PPE治療能抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá),有效改善炎癥反應(yīng)。

氧化應(yīng)激也是UC發(fā)病的潛在機(jī)制,炎性細(xì)胞浸潤產(chǎn)生的自由基會(huì)破壞內(nèi)源性防御系統(tǒng)和上皮細(xì)胞的完整性,誘發(fā)腸黏膜免疫功能障礙,延緩腸黏膜恢復(fù),而SOD與GPX的協(xié)同作用可以保護(hù)結(jié)腸黏膜免受過氧化物引起的損傷[4]。DSS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化通常表現(xiàn)為MDA含量增加以及GPX、SOD活性降低[23]。同樣,本研究中,與模型組相比,PPE低劑量組和高劑量組結(jié)腸組織中MDA水平降低,SOD和GPX活性提高,而且PPE低劑量組抗氧化能力高于PPE高劑量組,可能是由于多酚在高劑量給予時(shí)會(huì)充當(dāng)促氧化劑[24]。

綜上所述,PPE可以通過降低炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平,調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激來改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。因此,PPE可以作為一種有潛力的天然抗炎、抗氧化劑,為UC等炎癥性疾病的預(yù)防、治療和藥物開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。