劉文超, 楊 凱, 趙玉紅,3,*

(1.東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所, 黑龍江 哈爾濱 150081;3.黑龍江省森林食品資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 黑龍江 哈爾濱 150040)

紅松(Pinuskoraiensis)是松屬松科植物,又稱海松、果松、朝鮮松,是中國珍貴的用材樹種之一,產(chǎn)于長白山、小興安嶺天然林中,在俄羅斯、日本、朝鮮、韓國也有分布。紅松種子含油脂,“中國紅松子”口味好,并有滋補(bǔ)、祛風(fēng)寒等功效,是傳統(tǒng)出口食品,享有美譽(yù)。紅松的松子仁中蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為16.5%,松二蛋白是一種營養(yǎng)價(jià)值較高的植物蛋白,具有氨基酸比例合理[1]、降血糖[2]、抗氧化[3]等優(yōu)點(diǎn)。目前對松仁蛋白的研究主要集中在制備功能性肽、加工食品、功能性質(zhì)以及蛋白改性等方面[4-7]。

天然松仁蛋白(pine kernel protein,PKP)乳液的穩(wěn)定性較差,易出現(xiàn)絮凝、分層等不良現(xiàn)象。PKP的溶解度較差、乳化性能不佳,束縛了松仁蛋白在食品生產(chǎn)中的應(yīng)用范圍。有研究對松仁蛋白進(jìn)行磷酸化改性,以提高其乳化性[8];然而化學(xué)修飾會(huì)損壞蛋白的一級結(jié)構(gòu),可能產(chǎn)生不受歡迎的副產(chǎn)物[9]。也有使用加壓、烤制等物理方法提高松仁蛋白功能特性的研究[10-11],但生產(chǎn)工藝復(fù)雜、加熱蛋白變性等問題依然可能存在。

研究發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用可改善蛋白質(zhì)的功能特性,如酪蛋白和大米蛋白[12]、小麥面筋蛋白和大豆分離蛋白[9]、大豆蛋白和水稻蛋白[13]等的相互作用,改善了蛋白質(zhì)的溶解性和乳化性。乳清濃縮蛋白(whey protein concentrate,WPC)具有營養(yǎng)價(jià)值高、易于消化、生物利用度高、較高的溶解度和親水性的特點(diǎn)[14],是制備復(fù)合蛋白的較佳選擇。Alrosan等[15]研究發(fā)現(xiàn)將乳清分離蛋白(whey protein isolate,WPI)按照一定的比例添加到小扁豆蛋白中,通過蛋白質(zhì)復(fù)合物分子間作用力(靜電相互作用、疏水相互作用和氫鍵)的作用,小扁豆蛋白的溶解度可提高到90%以上。Wang等[16]在研究水稻蛋白和WPI的相互作用時(shí)也發(fā)現(xiàn)WPI的加入可使水稻蛋白的溶解性顯著提高。李良等[17]采用大豆分離蛋白-WPI作為乳化劑制備水包油型(O/W型)乳液,發(fā)現(xiàn)添加WPI后顯著改善了乳液的穩(wěn)定性。其他研究也發(fā)現(xiàn),WPI易與其他植物蛋白相互作用形成復(fù)合蛋白,WPI制得的復(fù)合蛋白乳液具有良好的乳液穩(wěn)定性[18-19]。目前,關(guān)于松仁蛋白和乳清濃縮蛋白相互作用提高松仁蛋白的溶解度和乳液穩(wěn)定性的研究尚未見報(bào)道。

本研究通過制備可溶性松仁蛋白-乳清濃縮蛋白(pine kernel protein-whey protein concentrate,PKP-WPC)復(fù)合蛋白,研究復(fù)合蛋白的結(jié)構(gòu)變化,了解松仁蛋白和乳清濃縮蛋白之間相互作用的機(jī)制及二者產(chǎn)生穩(wěn)定O/W型乳液的可行性。希望可為新型蛋白產(chǎn)品的研發(fā)提供理論基礎(chǔ),拓寬松仁蛋白在加工食品中的應(yīng)用范圍,推動(dòng)PKP-WPC雙蛋白乳液研究的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅松松子由黑龍江省林科院提供;乳清濃縮蛋白(蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為78.79%),天津銀河偉業(yè)進(jìn)出口有限公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉、β-巰基乙醇,北京索萊寶生物科技有限公司;考馬斯亮藍(lán)G-250、尼羅藍(lán)、尼羅紅,上海源葉生物科技有限公司;硫脲、氯化鈉、8-苯胺基-1-萘磺酸鈉(ANS),上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TDL-40B-W型高速離心機(jī),上海恒勤儀器設(shè)備有限公司;722型紫外-可見分光光度計(jì),上海光譜儀器有限公司;FD5-2.5E型冷凍干燥機(jī),北京金西盟儀器有限公司;LS55型熒光分光光度計(jì),美國PE公司;Chirascan V10型圓二色譜儀,英國應(yīng)用光物理公司上海代表處;90Plus型Zeta電位分析儀,美國布魯克海文儀器公司;FA25型高剪切分散乳化機(jī),上海歐河機(jī)械設(shè)備有限公司;90Plus型Brookhaven激光粒度儀,美國布魯克海文儀器公司;LSM800型激光共聚焦顯微鏡,北京創(chuàng)誠致佳科技有限公司;AR2000ex型旋轉(zhuǎn)流變儀,美國TA公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1脫脂松仁粕預(yù)處理

紅松松子手工去殼皮,粉碎機(jī)打碎,索氏抽提法去油,通風(fēng)櫥中室溫風(fēng)干,干燥的松仁粕粉碎,過60目篩,4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2松仁蛋白的提取

參考Yan等[20]方法并略作改動(dòng)。按m(脫脂松仁粕)∶V(蒸餾水)=1∶10 g/mL的料液比溶解,用1.0 mol/L NaOH將懸浮液調(diào)節(jié)至pH值為 9.0,在室溫下磁力攪拌1 h,4 000 r/min離心15 min,收集上清液。用1.0 mol/L HCl將上清液的pH值調(diào)節(jié)至4.6,磁力攪拌1 h,4 000 r/min離心15 min,收集沉淀。將沉淀的蛋白質(zhì)調(diào)至中性,冷凍干燥,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3松仁蛋白-乳清濃縮蛋白復(fù)合蛋白的制備

參考He等[9]方法并略作改動(dòng)。在室溫下,將1.0 g PKP分散在100 mL去離子水中,獲得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的懸浮液,分別加入0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 g的WPC,制成PKP與WPC質(zhì)量比為1.0∶0.1、1.0∶0.5、1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0的水溶液。用1.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至12.0,磁力攪拌2 h以確保充分水合。水合的蛋白溶液用0.1 mol/L HCl緩慢中和至pH值為7.0,10 000 r/min離心10 min,收集的上清液為復(fù)合蛋白原液;使用3 400 Da的透析袋透析24 h以除去多余的鹽,冷凍干燥,即為PKP-WPC復(fù)合蛋白。除非另有說明,以下表征均用新鮮制備的上清液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。為了進(jìn)行比較,PKP和WPC與上述樣品平行處理,作為對照,與復(fù)合物一起進(jìn)行表征。

1.3.4松仁蛋白溶解度的測定

蛋白質(zhì)的溶解度采用氮溶解指數(shù)(nitrogen solubility index,NSI)表示[21]。將pH循環(huán)后的PKP-WPC復(fù)合蛋白10 000 r/min離心10 min,收集上清液和沉淀物,凱氏定氮法進(jìn)行氮測量。松仁蛋白的NSI計(jì)算方法見式(1)。

(1)

式(1)中,mp為松仁蛋白的初始質(zhì)量,g;mk為離心后沉淀物中的蛋白質(zhì)質(zhì)量,g。

1.3.5復(fù)合蛋白分子質(zhì)量的測定

參照Mohamed等[22]方法略作修改。采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)對PKP、WPC、不同復(fù)配比例的復(fù)合蛋白的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量進(jìn)行鑒定分析。取樣品溶液,用去離子水稀釋至質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL,按1∶1的體積比加入上樣緩沖液,100 ℃下煮沸5 min。上樣量為20 μL,分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%,濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%。開始電壓為80 V, 進(jìn)入分離膠后為120 V,電泳時(shí)間約2.5 h。電泳后,用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。離心后產(chǎn)生的沉淀也通過SDS-PAGE進(jìn)行檢測。

1.3.6復(fù)合蛋白結(jié)構(gòu)的測定

1.3.6.1 內(nèi)源性熒光光譜的測定

參考He等[9]的研究方法采用熒光分光光度計(jì)測定蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)變化。分別用pH值為12.0、11.0、10.0、9.0、8.0、7.0的去離子水將樣品溶液質(zhì)量濃度稀釋至0.01%,使用熒光分光光度計(jì)在280 nm的激發(fā)波長下獲得300～450 nm波長范圍內(nèi)的熒光光譜。狹縫寬度為10 nm。

1.3.6.2 紫外-可見光譜的測定

參考Wang等[12]的研究方法采用紫外-可見光譜測定蛋白質(zhì)的立體構(gòu)象變化情況。分別用pH值為12.0、11.0、10.0、9.0、8.0、7.0的去離子水將樣品溶液質(zhì)量濃度稀釋到0.01%。使用紫外-可見分光光度計(jì)在波長為190～350 nm處獲得蛋白質(zhì)溶液的紫外光譜。

1.3.6.3 圓二色譜的測定

參考Wang等[16]的研究方法采用圓二色譜儀測定蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)變化。將復(fù)合蛋白溶液分別用pH值為12.0、11.0、10.0、9.0、8.0、7.0的去離子水將質(zhì)量濃度稀釋至0.5 mg/mL。波長為190～250 nm,使用0.1 cm的石英比色皿,掃描參數(shù)為:步長0.1 nm,平均時(shí)間2 s,平均掃描3次。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量通過與已知構(gòu)象的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的光譜線性擬合進(jìn)行計(jì)算。

1.3.7復(fù)合蛋白表面性質(zhì)的測定

1.3.7.1 表面疏水性的測定

用ANS作為熒光探針測定蛋白質(zhì)的表面疏水性[23]。用濃度為10 mmol/L的PBS緩沖液(pH=7.0)制備質(zhì)量濃度為0～2 mg/mL的樣品溶液。將3 mL樣品溶液與30 μL濃度為 8.0 mmol/L ANS溶液混合。激發(fā)波長為390 nm,發(fā)射波長為470 nm,記錄熒光強(qiáng)度,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為10 nm。

1.3.7.2 ζ-電位的測定

參考Yan等[24]的方法略作修改,采用ζ-電位分析儀測量蛋白質(zhì)溶液的ζ-電位,上樣體積為1 mL,溫度平衡時(shí)間為2 min。測試條件為:溫度為25 ℃、散射角為173°、蛋白質(zhì)和分散介質(zhì)的折射率分別為1.45和1.33、電導(dǎo)率范圍為 0～200 ms/cm。

1.3.8乳液的制備

參考Turan等[25]的方法略作修改,以蛋白溶液為原料,分別模擬牛奶、冰淇淋和奶油的含油量,制備油相體積分?jǐn)?shù)為3%、10%和50%的乳液。將所需量的大豆油和蛋白溶液混合,于高剪切分散乳化機(jī)16 000 r/min處理3 min,每隔20 s停頓1次,得到最終的乳液。

1.3.9乳液性質(zhì)的測定

1.3.9.1 乳液平均粒徑的測定

參考Shao等[26]的方法,采用Brookhaven激光粒度儀測定乳液的平均粒徑。樣品乳液用質(zhì)量濃度為10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)稀釋100倍,以避免多重光散射效應(yīng)的影響。分散介質(zhì)為水,顆粒折射率為1.46,分散介質(zhì)折射率為1.33,吸收參數(shù)為0.001,測試溫度為25 ℃。

1.3.9.2 乳液ζ-電位的測定

參考Shi等[27]的方法略作修改。樣品乳液用質(zhì)量濃度為0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)稀釋100倍。測定方法參考1.3.7.2節(jié)。

1.3.9.3 乳液乳層析指數(shù)的測定

參考Benetti等[28]的方法測定乳液乳層析指數(shù)。室溫條件下將制備好的樣品靜置10 d,分別在第0、1、3、7、10 天的同一時(shí)刻記錄乳液在比色管分層界面的刻度,用以衡量乳液分離的程度。乳層析指數(shù)(CI)的計(jì)算見式(2)。

(2)

式(2)中,HC為清液高度,cm;HE為乳液總高度,cm。

1.3.9.4 乳液微觀結(jié)構(gòu)的測定

參考Zhang等[18]的研究方法采用激光共聚焦顯微鏡測定乳液的微觀結(jié)構(gòu)。將20 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的尼羅藍(lán)和20 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的尼羅紅染液混合,吸取1 mL乳液樣品與40 μL混合染液避光染色30 min。將10 μL染色乳液樣品滴到載玻片上,用蓋玻片覆蓋。使用10倍放大透鏡觀察樣品,利用Ar/Kr和 He/Ne雙通道激光模式采集圖像,對于蛋白質(zhì)和油,氬-氪和氦-氖激光激發(fā)波長分別為488 nm和633 nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。組間差異顯著性采用t檢驗(yàn)分析(P<0.05),數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 20.0軟件,用Origin 2018、Excel軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 松仁蛋白溶解度分析結(jié)果

通過在pH 值為12.0條件下共溶PKP和WPC,并在pH值為7.0條件下重新收集,制備了可溶性復(fù)合蛋白。PKP的NSI大致計(jì)算為溶解在溶液中的PKP質(zhì)量與反應(yīng)中使用的初始PKP質(zhì)量的百分比,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。由圖1 (a)可知,PKP(對照)的溶解度為48.53%,添加WPC后,溶解度顯著提高,當(dāng)PKP與WPC質(zhì)量比為1.0∶1.0時(shí),PKP的溶解度為92.43%。減少乳清濃縮蛋白添加量會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)混合物顯著沉淀,而乳清濃縮蛋白添加量的進(jìn)一步增加不會(huì)顯著改變PKP的溶解度。這一現(xiàn)象與Wang[12]研究的添加酪蛋白對水稻蛋白的溶解度的影響一致。值得注意的是,制備的復(fù)合蛋白可以完全溶解在水中 [圖1 (b)]。以溶解度為評價(jià)指標(biāo),最終選擇了PKP與WPC質(zhì)量比為1.0∶1.0的比例進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 WPC對PKP溶解度的影響Fig.1 Effect of WPC on solubility of PKP

2.2 復(fù)合蛋白分子質(zhì)量分析結(jié)果

用SDS-PAGE研究了蛋白質(zhì)亞基對復(fù)合蛋白形成的貢獻(xiàn),結(jié)果見圖2。由圖2可知,幾乎所有的WPC亞基都溶解在上清液中,并在與PKP相互作用后進(jìn)一步收集,因此,WPC的不溶性亞基的數(shù)量可被忽略;PKP在23、33、53 kDa處有顯著的蛋白條帶,這與Adelina[29]觀察到的PKP亞基條帶一致。WPC(第3條通道)的電泳圖顯示,在16 kDa和66 kDa處有清晰的亞基條帶,Wang等[16]在研究WPI的電泳圖時(shí)也看到了類似的條帶。通過以不同的比例將PKP和WPC構(gòu)建成復(fù)合物,PKP和WPC的亞基條帶清晰地呈現(xiàn)在通道4～8中,表明復(fù)合蛋白完整保留了2種蛋白質(zhì)的亞基。隨著WPC添加量的增加,16 kDa處的條帶因其更多地并入PKP而變得更加明顯。Wang等[13]也報(bào)道過類似的結(jié)論,復(fù)合蛋白含有來自2種原始蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)亞基,其分子質(zhì)量沒有顯著變化,表明本研究中的pH循環(huán)誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用能有效保證2種蛋白質(zhì)的分子完整性。

通道1～3分別為 Marker、PKP和WPC,4～8表示PKP與WPC質(zhì)量比分別為1.0∶0.1、1.0∶0.5、1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0構(gòu)建的復(fù)合蛋白。

2.3 復(fù)合蛋白結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

2.3.1內(nèi)源性熒光光譜分析結(jié)果

對中和至pH值為 7.0的復(fù)合蛋白進(jìn)行熒光光譜分析,以證明PKP和WPC之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,這可以區(qū)分這種結(jié)構(gòu)反應(yīng)與兩種蛋白質(zhì)的簡單混合,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。由圖3(a)可知,PKP和WPC在338 nm處都有一個(gè)明顯的峰值強(qiáng)度(Fmax),這是色氨酸的主要發(fā)射。PKP在280 nm激發(fā)下具有較高的Fmax,然而,添加WPC后,該峰強(qiáng)度基本上被猝滅,大量研究證實(shí),蛋白質(zhì)與外來物質(zhì)的相互作用明顯地淬滅了蛋白質(zhì)的固有熒光[30],這表明PKP和WPC是相互作用的。隨著酸化過程的進(jìn)行,Fmax逐漸增大 [圖3 (b)],表明蛋白質(zhì)被還原成更高階構(gòu)象。最終,熒光強(qiáng)度在pH值為 7.0時(shí)達(dá)到頂峰,但仍然遠(yuǎn)低于對照PKP,表明PKP與WPC相互作用發(fā)生三級結(jié)構(gòu)變化,PKP的結(jié)構(gòu)復(fù)性受到WPC的抑制。

圖3 蛋白樣品的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of protein samples

為了探究形成復(fù)合蛋白所參與的具體非共價(jià)作用力,在pH循環(huán)之前向樣品中添加NaCl、硫脲和SDS三種阻斷劑。上述阻斷劑的不同處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)復(fù)合物之間或內(nèi)部不同分子力的破壞,并且可以通過熒光發(fā)射光譜反映出來。由圖3 (c)可看出,富含NaCl的反應(yīng)蛋白溶液的熒光強(qiáng)度最高,其次是富含硫脲和SDS的反應(yīng)蛋白溶液,這表明在PKP-WPC復(fù)合蛋白中,靜電力是主導(dǎo)力,其次是氫鍵和疏水力。Alrosan等[15]在研究小扁豆蛋白和WPI之間的相互作用時(shí)也發(fā)現(xiàn)靜電力占主導(dǎo)地位。因此,PKP和WPC的復(fù)合主要受靜電相互作用的影響,有氫鍵和疏水相互作用的輔助,但影響程度較小。當(dāng)PKP與WPC反應(yīng)的pH值降低時(shí),PKP與WPC之間形成靜電相互作用、氫鍵和疏水相互作用,控制PKP與WPC之間的相互作用。因此,這些分子力可能有利于PKP-WPC復(fù)合蛋白的形成。

2.3.2紫外-可見光譜分析結(jié)果

紫外-可見光譜對蛋白質(zhì)構(gòu)象很敏感。蛋白質(zhì)構(gòu)象折疊與230 nm處的吸光度有關(guān),折疊的構(gòu)象在230 nm處的吸光度比未折疊的構(gòu)象要強(qiáng)[31],蛋白質(zhì)的紫外-可見光譜結(jié)果見圖4。

圖4 蛋白樣品的紫外-可見光譜Fig.4 UV-Vis spectra and secondary structure of protein samples

由圖4(a)可知,復(fù)合蛋白的A230顯著低于PKP,說明復(fù)合蛋白中含有未折疊的蛋白基團(tuán),其抗折疊能力強(qiáng)。PKP-WPC復(fù)合蛋白的pH值降低導(dǎo)致A230的增加[圖4(b)],這證明了蛋白質(zhì)的重新折疊,Wang等[16]在研究WPI與水稻蛋白相互作用時(shí)也發(fā)現(xiàn):酸化使A230顯著增長,蛋白質(zhì)發(fā)生了重折疊。在pH值降低的過程中,復(fù)合蛋白在約230 nm處吸光度明顯增長,當(dāng)pH值從8.0降至7.0時(shí),增長幅度最大。這可能是因?yàn)樵诖藀H范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)經(jīng)歷了最大限度的復(fù)性。添加WPC使PKP更耐復(fù)性。這些發(fā)現(xiàn)表明,堿性環(huán)境中的PKP-WPC復(fù)合蛋白對中和過程中的結(jié)構(gòu)變化具有顯著的抵抗力[15]。

2.3.3圓二色譜分析結(jié)果

圓二色(circular dichroism,CD)譜能夠反映蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的有關(guān)信息,結(jié)果見圖5。由圖5 (a)可知,所有蛋白樣品的CD光譜在 200～260 nm 都有較寬的負(fù)帶,表明具有復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)。與PKP相比,復(fù)合蛋白的強(qiáng)度顯著降低,表明蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化,2種蛋白并不是簡單地混合。類似地,正如He等[9]報(bào)導(dǎo),所有蛋白樣品在pH 值為7.0時(shí),在200～240 nm都有寬的負(fù)譜帶,表明具有復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)。蛋白樣品之間存在顯著差異,由圖5 (c)可看到,與單一蛋白相比,復(fù)合蛋白的α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量增加,β-折疊含量降低,與黎露露[32]研究的大米蛋白-豌豆蛋白的二級結(jié)構(gòu)含量變化一致。說明蛋白分子的剛性結(jié)構(gòu)減弱,柔性結(jié)構(gòu)增強(qiáng),分子由有序結(jié)構(gòu)變?yōu)闊o序,這也是蛋白質(zhì)功能特性改善的原因之一。由圖5 (b)可知,酸化過程中,極值的強(qiáng)度減小,并伴有紅移,說明在pH 值為12.0時(shí),由于結(jié)構(gòu)展開暴露出更多的帶電基團(tuán),蛋白內(nèi)部基團(tuán)間的強(qiáng)烈排斥作用使蛋白質(zhì)膨脹和延伸,故能在堿性條件下形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。在中和的過程中,蛋白質(zhì)會(huì)由于表面電荷的減少而趨于聚集,但是,WPC的加入會(huì)抑制PKP的折疊能力,從而起到抑制蛋白質(zhì)聚集的效果,因此在中性條件下也能形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[21]?？傊?絡(luò)合不是通過在PKP表面涂覆WPC開始的,而是由于協(xié)同結(jié)構(gòu)相互作用,即PKP和WPC的結(jié)構(gòu)可能通過肽鏈或二級結(jié)構(gòu)而不是三級或更高結(jié)構(gòu)的絡(luò)合進(jìn)行相互作用。

2.4 復(fù)合蛋白表面性質(zhì)分析結(jié)果

表面疏水性和表面電荷對維持蛋白質(zhì)溶液體系的穩(wěn)定性起著重要作用。因此,對蛋白樣品的表面疏水性和表面電荷進(jìn)行了表征,結(jié)果見圖6。

不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。

由圖6 (a)可知,添加WPC后顯著降低了PKP的表面疏水性,復(fù)合蛋白的表面疏水性在酸化過程中逐漸增強(qiáng) [圖6 (b)],并在pH值為 7.0時(shí)達(dá)到頂峰,但顯著低于PKP的表面疏水性(P<0.05)。復(fù)合蛋白的疏水性隨著pH值的降低而增加,這是蛋白質(zhì)復(fù)性的另一個(gè)證據(jù)。在這方面,疏水性增加的主要原因不是疏水基團(tuán)增加,而是共折疊的蛋白質(zhì)鏈?zhǔn)狗菢O性基團(tuán)聚集在一起,從而形成疏水區(qū)域被ANS檢測到[33]。

由圖6(c)可知,復(fù)合蛋白的ζ-電位的絕對值是34.74 mV,顯著高于PKP和WPC的12.31和 24.43 mV。添加WPC后,表面疏水性降低,而ζ-電位絕對值增加,表明水穩(wěn)定性提高。由圖6(d)可看到,在酸化過程中,ζ-電位絕對值略有降低,但都顯著高于單一蛋白。這表明大多數(shù)帶電基團(tuán)很好地保持在復(fù)合蛋白的表面。該結(jié)果與Alrosan等[15]研究小扁豆蛋白與WPI復(fù)合后表面電荷的變化趨勢相同。在pH值為12.0時(shí),蛋白質(zhì)具有最高的表面電荷,說明在堿性環(huán)境中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開并大量暴露于帶電基團(tuán)的溶劑中,產(chǎn)生了足夠的靜電排斥,從而增強(qiáng)了復(fù)合蛋白的穩(wěn)定性,并使其在絡(luò)合后溶解在水中時(shí)抵抗聚集。ζ-電位分析和表面疏水性分析再次揭示了復(fù)合蛋白的抗折疊結(jié)構(gòu),并解釋了WPC添加后導(dǎo)致PKP溶解度增加的原因。

2.5 乳液性質(zhì)分析結(jié)果

2.5.1乳液平均粒徑分析結(jié)果

平均粒徑是評價(jià)乳液穩(wěn)定性的重要因素,液滴粒徑越小,乳析速度越慢,乳液越穩(wěn)定[34]。不同乳液樣品的平均粒徑見圖7。由圖7可知,PKP-WPC復(fù)合乳液的平均粒徑顯著低于PKP乳液。這可能是由于兩種蛋白發(fā)生相互作用,蛋白的構(gòu)象重排,能夠快速吸附到油滴表面,降低油水界面張力,乳液穩(wěn)定性提高。PKP乳液在油相體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)平均粒徑最小,為225.14 nm。在固定的蛋白濃度下,當(dāng)油相體積分?jǐn)?shù)從3%增加到50%時(shí),可用于穩(wěn)定界面的蛋白質(zhì)顆粒減少,因此會(huì)形成大液滴。WPC乳液和PKP-WPC復(fù)合乳液隨著油相體積分?jǐn)?shù)的增加,平均粒徑逐漸增大,含油量過高導(dǎo)致蛋白質(zhì)不足以穩(wěn)定在所有油滴表面,使乳液液滴發(fā)生了聚結(jié)。這一結(jié)果與Li等[35]研究油相體積分?jǐn)?shù)對細(xì)菌纖維素納米纖維乳液的液滴大小的影響結(jié)果一致。

不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。

2.5.2乳液ζ-電位分析結(jié)果

ζ-電位在一定程度上可以反映乳液液滴之間相互作用的強(qiáng)度。ζ-電位的絕對值越大,說明液滴間斥力越大,可避免液滴聚結(jié)變大,體系越穩(wěn)定[36],結(jié)果見圖8。由圖8可知,在所有的油相體積分?jǐn)?shù)下,WPC乳液的ζ-電位絕對值最大,在油相體積分?jǐn)?shù)為3%時(shí),WPC乳液的ζ-電位值為-44.46 mV,說明此時(shí)液滴之間的靜電斥力大,乳液較穩(wěn)定。PKP-WPC復(fù)合乳液的ζ-電位絕對值顯著高于PKP乳液,這可能是由于帶負(fù)電的PKP和WPC之間的靜電排斥作用抑制了液滴的絮凝,PKP和WPC的共同吸附可能導(dǎo)致凈電荷增加,因?yàn)樗鼈兌紟ж?fù)電[37]。李良等[17]在研究大豆分離蛋白-乳清分離蛋白對O/W型乳液穩(wěn)定性的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)復(fù)合乳液液滴表面均帶有負(fù)電荷,且ζ-電位絕對值顯著高于單一蛋白乳液。PKP乳液在油相體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)ζ-電位絕對值最大,說明此時(shí)乳液最穩(wěn)定。在WPC乳液和PKP-WPC復(fù)合乳液中,ζ-電位絕對值隨著油相體積分?jǐn)?shù)的增加而減小。3%時(shí)的乳液較穩(wěn)定,這與平均粒徑的結(jié)果一致。

不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。

2.5.3乳液乳層析指數(shù)分析結(jié)果

儲存10 d期間乳液的乳層析指數(shù)分析結(jié)果與乳液的外觀圖見圖9。由圖9(a)可知,復(fù)合乳液的乳層析指數(shù)顯著低于PKP乳液,說明復(fù)合蛋白制備的乳液較穩(wěn)定。由圖9(b)可看到,剛制備(第0天)的乳液均表現(xiàn)出均勻的外觀,含油量為50%的乳液,在第1天就發(fā)生了明顯的乳析現(xiàn)象。在第3天時(shí),含油量為3%和10%的3種蛋白乳液都沒有發(fā)生明顯的乳析現(xiàn)象。儲存7 d后,才出現(xiàn)明顯的乳析現(xiàn)象,乳層析指數(shù)顯著升高。儲存10 d后,WPC-3和PKP-WPC-3沒有明顯的乳脂化,但仍然可以觀察到乳液底部的混濁程度降低。且隨著儲存時(shí)間的增長,乳層析指數(shù)逐漸增加。PKP乳液在儲存10 d后明顯觀察到有油滴析出,WPC乳液和PKP-WPC復(fù)合乳液未觀察到有油滴析出。PKP-WPC-3的乳液乳層析指數(shù)較低,說明乳液穩(wěn)定性較好。

圖9 不同乳液樣品的乳層析指數(shù)及乳液外觀Fig.9 Creaming index and appearance of different emulsion samples

2.5.4乳液微觀結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果

激光共聚焦顯微鏡通常用于分析乳液的微觀結(jié)構(gòu),它可以從本質(zhì)上反映乳液粒子的粒徑分布、分散性和穩(wěn)定性[18],乳液的微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)見圖10。由圖10可知,紅色和綠色區(qū)域分別代表油滴和蛋白質(zhì)。油相呈球形,表明油滴完全被乳液中的水包裹。乳液液滴的微觀結(jié)構(gòu)因蛋白種類和油相體積分?jǐn)?shù)的不同而有很大差異。對于PKP乳液,PKP-10的液滴分布較均勻,PKP-3發(fā)生了顆粒堆積效應(yīng),這可能是由于在較低的油相體積分?jǐn)?shù)下,高剪切乳化后,更多的未被吸附的蛋白質(zhì)會(huì)相互結(jié)合形成聚集體。PKP-50的液滴較大,且不均勻,表明此時(shí)液滴大量聚集,乳液穩(wěn)定性低。WPC乳液和PKP-WPC復(fù)合乳液的微觀結(jié)構(gòu)基本相似,隨著油相體積分?jǐn)?shù)的增加,液滴逐漸增大,且變得聚集。WPC-3和PKP-WPC-3的乳液液滴小,分布均勻且有序,說明乳液穩(wěn)定性好。含油量為50%的乳液液滴變大,可觀察到液滴絮凝。王一丹[38]在研究芝麻蛋白乳液性質(zhì)時(shí)也發(fā)現(xiàn)液滴大小與油相體積分?jǐn)?shù)呈正相關(guān),且液滴尺寸增大,液滴間的聚集越明顯。與PKP乳液相比,添加WPC后復(fù)合乳液液滴尺寸明顯減小,且分散性好,這可能是由于復(fù)合蛋白濃度適宜且添加WPC后在油-水界面形成更加致密的膜結(jié)構(gòu)。這與李良等[17]對大豆分離蛋白-乳清分離蛋白復(fù)合乳液的微觀形態(tài)的研究結(jié)果相類似。PKP-WPC-3乳液結(jié)構(gòu)均一、穩(wěn)定。以上現(xiàn)象證實(shí)了測定的平均粒徑、ζ-電位和乳層析指數(shù)的結(jié)果。

圖10 不同乳液樣品的微觀形態(tài)Fig.10 Microscopic morphology of different emulsion samples

3 結(jié) 論

采用pH循環(huán)法成功制備了可溶性PKP-WPC復(fù)合蛋白。PKP與WPC相互作用改變了PKP的結(jié)構(gòu)和功能特性。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)(α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲),由于蛋白質(zhì)絡(luò)合而發(fā)生顯著變化。靜電相互作用、疏水相互作用和氫鍵有利于PKP-WPC復(fù)合蛋白的形成。在酸化過程中,兩種蛋白質(zhì)之間的相互作用抑制了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)復(fù)性,并維持了蛋白質(zhì)的帶電表面,從而顯著提高了PKP的溶解度。PKP-WPC復(fù)合乳液顯示出較好的乳液穩(wěn)定性,PKP-WPC-3乳液的穩(wěn)定性顯著高于PKP-WPC-10和PKP-WPC-50,乳液的平均粒徑、ζ-電位、乳層析指數(shù)分析以及顯微鏡觀察證明了這一點(diǎn)。研究結(jié)果可為新型蛋白產(chǎn)品的研發(fā)提供理論基礎(chǔ),有助于拓寬松仁蛋白在加工食品中的應(yīng)用范圍。