楊碧云 胡衛(wèi)華 邱美純 紀(jì)曉虹 燕道貴 林學(xué)鎂

拉芳家化股份有限公司，廣東汕頭，515041

近年來(lái)，對(duì)表面活性劑復(fù)配協(xié)同增效的研究引起了越來(lái)越多的重視，不同結(jié)構(gòu)的表面活性劑組成的復(fù)配體系不僅可以形成多種多樣的體相締合結(jié)構(gòu)，而且在界面可以發(fā)生協(xié)同吸附，比單一表面活性劑體系降低界面張力的力更強(qiáng)[1]。目前在洗去型產(chǎn)品中最常用的表面活性劑是陰離子表面活性劑，應(yīng)用最廣的有烷基硫酸酯鹽、烷基聚氧乙烯醚硫酸鹽和N-酰氨基酸鹽類表面活性劑等。輔助表面活性劑常為非離子表面活性劑和兩性表面活性劑。非離子表面活性劑在洗發(fā)水中一般起到穩(wěn)泡、增稠等作用；兩性表面活性劑具有良好的去污、起泡、殺菌、抑菌和柔軟等性能，耐硬水，對(duì)酸、堿和各種金屬離子都比較穩(wěn)定，毒性低，對(duì)皮膚的刺激性小，具有良好的生物降解性，廣泛應(yīng)用于成人洗發(fā)香波、沐浴露，嬰幼兒用品等。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是用于多因素多水平的一種方法，它是從全面試驗(yàn)中挑選出部分有典型代表的點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)，它是部分因子設(shè)計(jì)的主要方法，具有很高的效率，應(yīng)用廣泛[2]。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法的主要優(yōu)點(diǎn)是能在很多試驗(yàn)方案中挑選出代表性強(qiáng)的少數(shù)幾個(gè)試驗(yàn)方案，并且通過(guò)分析這少數(shù)試驗(yàn)方案的試驗(yàn)結(jié)果，推斷出最優(yōu)方案，同時(shí)還可以做進(jìn)一步的分析，得到與試驗(yàn)結(jié)果本身有關(guān)各因素的信息[3]。

目前關(guān)于表面活性劑的不同復(fù)配比例的綜合性能的研究較少，本文旨在用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法研究市面上常用表面活性劑（月桂醇聚醚硫酸酯鈉、十二烷基硫酸鈉、椰油酰胺丙基甜菜堿和月桂酰肌氨酸鈉）復(fù)配的最佳使用比例，探討表面活性劑對(duì)體系的泡沫、洗后皮膚水分含量及刺激性的影響。雞胚絨毛尿囊膜試驗(yàn)是一種較早被采用的體外刺激性評(píng)估方法，利用孵化的雞蛋胚胎中期血管化透明的絨毛尿囊膜，將一定量被評(píng)估物質(zhì)滴加在上面，一段時(shí)間后觀察絨毛尿囊膜上的血管及其網(wǎng)絡(luò)的形態(tài)結(jié)構(gòu)、顏色和通透性的變化，結(jié)合絨毛尿囊膜蛋白質(zhì)性質(zhì)改變，判斷其受損程度，評(píng)估受試物的刺激性[4]。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

試劑：RSAW ESB70/ZA，w＝70%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以下皆是)，RSAW LXNS/ZA，w＝94%，湖南麗臣奧威實(shí)業(yè)有限公司；TC-CAB 35AB，w＝29.5%，RSAW LS30/ZA，w＝30%，廣州天賜高新材料股份有限公司；Citric Acid Anhydrous，w＝100%，山東檸檬生化有限公司；氫氧化鈉，w＝100%，西隴化工股份有限公司。

儀器：電子天平，購(gòu)自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；多功能皮膚測(cè)試儀（MPA580）；pH計(jì)，購(gòu)自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，購(gòu)自雅馬拓科技貿(mào)易（上海）有限公司；懸臂式攪拌器（LABORATORY EQUIPMENT IKA）；LED高亮度冷光源照蛋器；移液槍（DRAGONLAB）。

1.2 測(cè)試方法

1.2.1 泡沫測(cè)試方法

樣品泡沫性能的測(cè)定參考GB/T 13173—2021《表面活性劑 洗滌劑試驗(yàn)方法》中的洗滌劑發(fā)泡力的測(cè)定（Ross-Miles法）。

1.2.2 pH值的測(cè)試方法

參考GB/T 13531.1—2008《化妝品通用檢驗(yàn)方法 pH值的測(cè)定》對(duì)本文樣品進(jìn)行pH值的測(cè)定，采用直測(cè)法，測(cè)試方法如下：

電極、洗滌用水和標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液的溫度均調(diào)整至25 ℃，按照儀器使用說(shuō)明校正pH計(jì)。儀器校正后，用純水沖洗電極，用濾紙吸干將電極小心插入試樣中，使電極浸沒(méi)，待pH計(jì)讀數(shù)穩(wěn)定，記錄讀數(shù)。重復(fù)一次，讀取兩次測(cè)量數(shù)據(jù)，取平均值。

1.2.3 皮膚水分含量測(cè)試方法

測(cè)試環(huán)境：溫度23.0～25.0℃，相對(duì)濕度50%～55%。功效測(cè)試方法參考QB/T 4256—2011《化妝品保濕功效評(píng)價(jià)指南》。

本次試驗(yàn)遵循《赫爾辛基宣言》和中國(guó)有關(guān)臨床試驗(yàn)研究規(guī)范、法規(guī)進(jìn)行。本次試驗(yàn)方案已經(jīng)由倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。每位志愿者入選本研究前，試驗(yàn)人員已通過(guò)書面文字形式向其完整、全面地介紹了本研究的目的、程序和可能的風(fēng)險(xiǎn)。試驗(yàn)前，每位入選的受試者均已簽署志愿者知情同意書。

測(cè)試方法：（1）篩選30名20-45歲人群，無(wú)嚴(yán)重系統(tǒng)疾病，無(wú)免疫缺陷或自身免疫性疾病者，無(wú)活動(dòng)性過(guò)敏性疾病者，既往對(duì)化妝品無(wú)嚴(yán)重過(guò)敏史者，近1個(gè)月未曾使用過(guò)激素類藥物及免疫抑制劑者，在皮膚測(cè)試部位沒(méi)有由于瘢痕、色素、萎縮、鮮紅斑痣或其他瑕疵而影響試驗(yàn)結(jié)果的判定者，未參加其他臨床測(cè)試者[5]。選擇前臂內(nèi)側(cè)作為測(cè)試部位，測(cè)試部位測(cè)試前2-3 d不能使用任何產(chǎn)品（化妝品或外用藥品），1-3 h不能接觸水。根據(jù)隨機(jī)表，將兩側(cè)手臂分為對(duì)照區(qū)和樣品區(qū)（對(duì)照區(qū)和樣品區(qū)均應(yīng)隨機(jī)且均勻地出現(xiàn)在樣本總體左右側(cè)的其中一側(cè)手臂），各定位3個(gè)測(cè)試區(qū)域（同側(cè)手臂測(cè)試區(qū)域間隔1 cm），依次進(jìn)行角質(zhì)層水分含量測(cè)試。

（2）篩選入組后，受試者需要統(tǒng)一用清水清潔測(cè)試部位，用干的面巾紙擦拭干水分，在符合環(huán)境要求的房間內(nèi)靜坐20 min，期間不能喝水和飲料。測(cè)試部位暴露，呈測(cè)試狀態(tài)放置，保持放松。

（3）用Corneometer水分測(cè)試探頭測(cè)試受試者對(duì)照區(qū)、樣品區(qū)的角質(zhì)層水分含量值，每個(gè)區(qū)域重復(fù)測(cè)試3次，取平均值作為初始值。

（4）使用樣品：將0.2 g樣品涂抹于樣品區(qū)域，用清水沾濕，打圈清洗20圈，用清水沖凈，對(duì)照區(qū)采用同樣的手法用清水清洗。

（5）功效測(cè)試：使用樣品后，用干的面巾紙擦拭干水分，即時(shí)測(cè)定樣品區(qū)、對(duì)照區(qū)的角質(zhì)層水分含量，每個(gè)區(qū)域重復(fù)測(cè)3次，取平均值作為即時(shí)測(cè)定值。一個(gè)受試者的測(cè)試必須使用同一儀器由同一個(gè)測(cè)試人員完成，兩次測(cè)量之間應(yīng)清潔測(cè)試探頭。

（6）數(shù)據(jù)處理：對(duì)各測(cè)試區(qū)域的測(cè)量值進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)，包括最小值、最大值、均值、標(biāo)準(zhǔn)差等。計(jì)算各測(cè)試區(qū)域即時(shí)測(cè)定值與初始值之間的差值和變化率，然后利用此變化率，統(tǒng)計(jì)分析產(chǎn)品區(qū)與空白對(duì)照區(qū)的差別。變化率為負(fù)值表示使用后角質(zhì)層水含量較使用前降低。

1.2.4 雞胚絨毛尿囊膜測(cè)試方法

（1）雞胚的孵化：購(gòu)入7 d齡內(nèi)的白萊杭雞雞蛋，然后氣室朝上放置在孵化箱的托架上，在室溫20～25 ℃、相對(duì)濕度45%～70%的條件下，孵化箱內(nèi)溫度控制在（37.5±0.5）℃，相對(duì)濕度控制在50%～60%，進(jìn)行持續(xù)孵化。

（2）樣品準(zhǔn)備：樣品溶液測(cè)試前應(yīng)在（37.5±0.5）℃的環(huán)境下恒溫30 min。本次試驗(yàn)所測(cè)試樣品為透明的表面活性劑溶液，10倍稀釋后進(jìn)行測(cè)試。

（3）對(duì)照物及制備：0.9%的NaCl溶液為溶劑對(duì)照。

（4）絨毛尿囊膜試驗(yàn)：試驗(yàn)前洗凈雙手并消毒。將孵化第10-14天的雞胚取出，用LED高亮度冷光源照蛋器找出雞胚的氣室，然后用酒精消毒過(guò)的鑷子尾端敲破氣室上方的蛋殼，使用鑷子的彎尖頭剝?nèi)ゲ糠值皻?，暴露出白色蛋膜，用滴管滴? mL 0.9%NaCl溶液使蛋膜濕潤(rùn)變透，將0.9%NaCl溶液慢慢傾出。用鑷子小心撕除內(nèi)膜，血管膜需完整無(wú)損。將消毒過(guò)的特氟龍O型環(huán)放在雞胚的絨毛尿囊膜上，用微量加樣器滴加30 μL測(cè)試樣品溶液于特氟龍O型環(huán)內(nèi)。滴加完畢后，用保鮮膜密封蛋殼缺口，小心地將雞胚放置在37.5 ℃ ±0.5 ℃的孵化箱中繼續(xù)孵化30 min，盡量避免晃動(dòng)、傾斜等機(jī)械性刺激。

（5）結(jié)果觀察：雞胚孵化30 min后，取出雞胚去掉保鮮膜，借助手電筒觀察并比較環(huán)內(nèi)與環(huán)外CAM血管的變化，評(píng)估環(huán)內(nèi)血管損傷，必要時(shí)拍照記錄每只雞胚血管的變化，每個(gè)樣品做5次試驗(yàn)，評(píng)分取平均值（評(píng)分為0分時(shí)，表示樣品無(wú)刺激性；評(píng)分＜2分，表示為微刺激性；2≤評(píng)分＜4.5分時(shí)，表示為輕度刺激性；評(píng)分≥4.5分時(shí)，表示為嚴(yán)重刺激性），血管效應(yīng)評(píng)分表見(jiàn)表1。

表1 血管效應(yīng)評(píng)分表

2 結(jié)果與討論

2.1 溶液配制

主表面活性劑選擇使用月桂醇聚醚硫酸酯鈉（AES），輔助表面活性劑選用椰油酰胺丙基甜菜堿（CAB）、十二烷基硫酸鈉（K12）和月桂酰肌氨酸鈉（LS30），每種表面活性劑的試驗(yàn)比例設(shè)置如表2所示。這是一個(gè)四水平的試驗(yàn)，因此要選擇一張Ln(4m)型正交表，本試驗(yàn)共有4個(gè)因素，且不考慮因素間的交互作用，所以采用五因素四水平（L1645）的正交試驗(yàn)來(lái)研究四種表面活性劑的搭配比例。（注：本文中，四種表面活性劑的用量均指原料商品名的用量，結(jié)論中提及的各種表面活性劑用量也均是指原料商品名的用量。）

表2 因素水平表格

根據(jù)L1645正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)表格整理出表3的試驗(yàn)方案，共16組。溶液配制按照下列表面活性劑的比例進(jìn)行，每組試驗(yàn)的溶液的pH值用檸檬酸、氫氧化鈉調(diào)至5.5～6.0，每組試驗(yàn)均是去離子水至100%。（注：空白列中沒(méi)有因素作用，用于反映隨機(jī)因素所引起的誤差，故不列入試驗(yàn)比例配置，對(duì)試驗(yàn)方案沒(méi)有影響。）

表3 四種表面活性劑的正交試驗(yàn)的方案

2.2 試驗(yàn)結(jié)果

配置好的16組溶液按上述1.2.1、1.2.3和1.2.4測(cè)試方法進(jìn)行泡沫高度測(cè)試、洗后皮膚水分含量測(cè)試和雞胚絨毛尿囊膜試驗(yàn)，其試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4 試驗(yàn)結(jié)果匯總表

2.3 泡沫結(jié)果和分析

2.3.1 溶液活性物與泡沫高度的分析

每組溶液均進(jìn)行3次泡沫高度測(cè)量，表5記錄的泡高數(shù)據(jù)為每組溶液的3次起始泡沫高度的平均值。對(duì)每組溶液活性物進(jìn)行估算后，由表5可知，泡沫高度數(shù)值的多少與表面活性物含量沒(méi)有正相關(guān)關(guān)系。

表5 溶液活性物和泡沫高度記錄表

2.3.2 泡沫高度的數(shù)據(jù)分析

一般來(lái)說(shuō)，各列的極差是不相等的，極差越大，表示該列因素的數(shù)值在試驗(yàn)范圍內(nèi)的變化，會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)指標(biāo)在數(shù)值上有更大的變化，所以極差最大的那一列，就是因素的水平對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響最大的因素，也就是最主要的因素[6]。由表6可知，由于RA＞RC＞RB＞RD，所以各因素從主到次的順序?yàn)椋篈ES、CAB、K12、LS30。分析各列的K值，A因素列：K3＞K4＞K2＞K1；B因素列：K4＞K3＞K2＞K1；C因素列：K3＞K4＞K2＞K1；D因素列：K4＞K2＞K1＞K3；所以，在給定的因素水平數(shù)中，泡沫高度的優(yōu)方案為AES：13%，K12：4%，CAB：6%，LS30：5%。

表6 泡沫高度數(shù)據(jù)分析表

對(duì)于給定的顯著性水平α，檢驗(yàn)因素A對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有無(wú)顯著性影響，可比較F值與臨界值的大小，若FA＞Fα(dfA，dfe)，則因素A對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，若FA＜Fα(dfA，dfe)，則因素A對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著性影響[6]。對(duì)以上數(shù)據(jù)進(jìn)行方差和顯著性分析，由表7可知，對(duì)于給定顯著性水平α＝0.16，AES對(duì)泡沫高度有顯著影響；對(duì)于給定顯著性水平α＝0.19，K12和CAB對(duì)泡沫高度有顯著影響；而LS30對(duì)泡沫高度無(wú)顯著性影響。

表7 泡沫高度的方差和顯著性分析表

2.3.3 四種表面活性劑與泡沫高度的變化趨勢(shì)

將因素水平作為橫坐標(biāo)，以它的試驗(yàn)指標(biāo)的平均值ki為縱坐標(biāo)，畫出因素與指標(biāo)的關(guān)系趨勢(shì)圖，從圖1可知AES、K12、CAB、LS30單個(gè)因素在體系中的泡沫影響趨勢(shì)。由此可以看出，隨著AES的增加，泡沫高度先上升后下降，泡沫高度最高的水平是13%，隨之下降，說(shuō)明AES并非用量越高越好，在與K12和CAB配比時(shí)，最適宜的用量應(yīng)該是13%；同樣規(guī)律的還有CAB，最適宜的用量應(yīng)該是6%；而K12在設(shè)置的水平內(nèi)泡沫高度呈持續(xù)上升的趨勢(shì)，可見(jiàn)并未得到最優(yōu)值，LS30則無(wú)明顯規(guī)律。

圖1 四種表面活性劑的泡沫高度趨勢(shì)變化

2.4 洗后皮膚水分含量結(jié)果和分析

2.4.1 洗后皮膚水分含量的數(shù)據(jù)分析

由表8可知，由于RB＞RD＞RA＞RC，所以各因素從主到次的順序?yàn)椋篕12、LS30、AES、CAB。分析各列的K值，A因素列：K4＞K1＞K2＞K3；B因素列：K3＞K1＞K4＞K2；C因素列：K3＞K2＞K4＞K1；D因素列：K1＞K4＞K2＞K3。所以，在給定的因素水平數(shù)里，洗后皮膚水分含量的優(yōu)方案為AES：14.5%，K12：3%，CAB：6%，LS30：2%。但R空白列＞RD＞RA＞RC，說(shuō)明因素之間可能存在不可忽略的交互作用，或者漏掉了對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有重要影響的其他因素[6]，即對(duì)于洗后皮膚水分含量的測(cè)試，誤差較大。由表9可知，對(duì)于給定顯著性水平α＝0.06時(shí)，K12對(duì)洗后皮膚水分含量有顯著影響；而AES、CAB和LS30對(duì)洗后皮膚水分含量無(wú)顯著性影響。

表8 洗后皮膚水分含量數(shù)據(jù)分析表

表9 洗后皮膚水分含量的方差和顯著性分析表

2.4.2 四種表面活性劑與洗后皮膚水分含量的變化趨勢(shì)

從上述正交試驗(yàn)分析可知，在設(shè)定的水平范圍內(nèi)，表面活性劑對(duì)洗后皮膚水分含量的影響不大，影響較為顯著的是K12，但是由圖2可知，K12也從后續(xù)的擬合分析中看不出明顯趨勢(shì)，因此可認(rèn)為表面活性劑對(duì)洗后皮膚水分含量的影響不大。

圖2 四種表面活性劑洗后皮膚水分含量變化

2.5 雞胚絨毛尿囊膜試驗(yàn)結(jié)果和分析

2.5.1 雞胚評(píng)分的數(shù)據(jù)分析

由表10可知，由于RA＞RD＞RC＞RB，所以各因素從主到次的順序?yàn)椋篈ES、LS30、CAB、K12。分析各列的K值，A因素列：K4＞K3＞K1＞K2；B因素列：K3＞K4＞K2＞K1；C因素列：K1＞K2＝K4＞K3；D因素列：K3＞K4＞K1＞K2。由于測(cè)試結(jié)果是評(píng)分越小，刺激性越低，所以，在給定的因素水平數(shù)里，刺激性最小的優(yōu)質(zhì)方案為AES：11.5%，K12：1%，CAB：6%，LS30：3%。但R空白列＞RB＞RC，說(shuō)明K12和CAB對(duì)雞胚評(píng)分的結(jié)果影響小，誤差較大。由表11可知，對(duì)于給定顯著性水平α＝0.05，AES和LS30對(duì)雞胚試驗(yàn)評(píng)分結(jié)果有顯著影響；而K12和CAB對(duì)雞胚試驗(yàn)評(píng)分結(jié)果無(wú)顯著性影響。

表10 雞胚評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)分析表

表11 雞胚評(píng)分的方差和顯著性分析表

2.5.2 四種表面活性劑與雞胚評(píng)分的變化趨勢(shì)

由圖3可知，AES、K12、CAB、LS30單個(gè)因素在體系中的雞胚評(píng)分影響趨勢(shì)。從圖3可明顯看出規(guī)律：AES在11.5%之后評(píng)分結(jié)果突然增大，說(shuō)明刺激性增大，在13%之后尤為明顯；而LS30有助于降低雞胚評(píng)分，在3%時(shí)效果最好；而K12和CAB無(wú)明顯變化規(guī)律。

圖3 四種表面活性劑雞胚評(píng)分的變化趨勢(shì)

3 結(jié)論

通過(guò)以上正交試驗(yàn)探討AES、K12、CAB和LS30的最佳復(fù)配比例可發(fā)現(xiàn)，側(cè)重指標(biāo)不同，其最優(yōu)方案也不同，整理見(jiàn)表12。由以上試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析可知：

表12 AES、K12、CAB和LS30的最優(yōu)方案整理

（1）泡沫高度與活性物多少不呈正相關(guān)，AES也并非用量越高泡沫越好，泡沫高度最高的水平是13%。

（2）表面活性劑對(duì)洗后皮膚水分含量的影響不大，并無(wú)明顯的變化規(guī)律。

（3）AES在11.5%之后評(píng)分結(jié)果突然增大，說(shuō)明刺激性增大，在13%之后尤為明顯。而LS30有助于降低雞胚評(píng)分，在3%時(shí)效果最好。