王素平 武筱林 王 帥 宋 濤 莊 潔 蘭小磊

（1.青島市第三人民醫(yī)院神經(jīng)康復科，山東 青島，266041；2.青島大學醫(yī)學部中西醫(yī)結合中心，山東 青島，266021；3.青島大學附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，山東 青島，266003）

隨著人口的老齡化，老年性疾病發(fā)病率越來越高。其中，血管性癡呆 （Vascular dementia，VaD）是由腦血管疾病引起的一種腦損害[1]。目前關于VaD的標準定義國際上尚未統(tǒng)一，但Vad肯定會導致認知以及智能障礙，其根本的治療方法是防治腦血管病及其危險因素[2-4]。研究證明，VaD發(fā)病后，隨著病情的發(fā)展，神經(jīng)元逐漸出現(xiàn)大量死亡和凋亡，因此，抑制神經(jīng)元的凋亡可能是治療VaD有效措施之一[5-6]。近年研究發(fā)現(xiàn)，腦蛋白水解物制劑等能通過恢復腦功能而提高患者的認知和智力水平，但具體作用機制尚不明確[7]。神經(jīng)肽制劑腦活素（ Cerebrolysin，CBL）是從純化的腦蛋白中提取的，主要有效成分是氨基酸（80%）和小肽（20%），具有一定的神經(jīng)營養(yǎng)作用，可改善VaD患者認知能力、抑制大腦中動脈遠端閉塞后引起的大鼠丘腦神經(jīng)元凋亡，改善大鼠神經(jīng)功能等[8-11]。國內(nèi)注射用腦蛋白水解物-I（Cerebroprotein Hydrolysate-I，CH-I）采用類似CBL的提取工藝和質(zhì)量標準。已研究證明，注射用CH-I可以通過提高端粒酶活性從而延緩腦衰老，改善腦梗死大鼠的行為功能，其改善VaD大鼠學習認知能力可能與促進腦損傷后的神經(jīng)元修復和生長有關[12-14]。本實驗旨在探討CH-I干預VaD小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡的作用和可能的機制。

1 材料

1.1 實驗動物

成年健康雄性昆明小鼠70只，SPF級，鼠齡4～6周，體質(zhì)量25～30 g，動物合格證號：SCXK（魯）20190003，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供。實驗前將動物置于實驗室鼠齡適應環(huán)境1周，自由飲食，室溫（3±2）℃，12 h間隔晝夜明暗環(huán)境。整個實驗過程嚴格遵守動物倫理學要求（QDYXB-WZLL20230523）。

1.2 藥品與主要試劑

注射用腦蛋白水解物-I（CH-I）（生產(chǎn)企業(yè)：河北智同生物制藥股份有限公司，生產(chǎn)批號：0190501-1）；腦活素（CBL）（生產(chǎn)企業(yè)：EVER Neuro Pharma GmbH，生產(chǎn)批號：PB0947）；HE染色試劑盒（G1120）（生產(chǎn)企業(yè)：北京索萊寶科技公司）、DAB顯色試劑盒（DA1015）（生產(chǎn)企業(yè)：北京索萊寶科技公司）；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（MK1020）（生產(chǎn)企業(yè)：博士德生物工程公司）；Akt（8200S）（生產(chǎn)企業(yè)：Cell Signaling Technology Co. Ltd.）、p-Akt（8200S）（生產(chǎn)企業(yè)：Cell Signaling Technology Co. Ltd.）、山羊抗兔抗體（7074P2）（生產(chǎn)企業(yè)：Cell Signaling Technology Co. Ltd.）；Bcl-2（ab182858）（生產(chǎn)企業(yè)：Abcam）；Casp-3（AF6311）（生產(chǎn)企業(yè)：Affinity Co. Ltd.）、Casp-9（AF6348）抗體（生產(chǎn)企業(yè)：Affinity Co. Ltd.）、雙敏化學發(fā)光試劑均（KF005）（生產(chǎn)企業(yè)：Affinity Co. Ltd.）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（生產(chǎn)企業(yè)：Biosharp Life Science Co. Ltd）。

1.3 實驗儀器

小鼠Y型電迷宮（生產(chǎn)企業(yè)：中國藥物研究所，型號：MG-I）；光學顯微鏡（生產(chǎn)企業(yè)：Olympus，型號：IX70）；全自動酶標檢測儀（生產(chǎn)企業(yè)：Bio-TekCo. Ltd.，型號：H1M）；基礎電泳儀電源（生產(chǎn)企業(yè)：Bio-RadCo. Ltd.）、轉(zhuǎn)膜儀（生產(chǎn)企業(yè)：Bio-RadCo. Ltd.）。

2 方法

2.1 學習訓練

在黑暗、安靜的環(huán)境進行學習訓練。先將小鼠放入三等臂Y型電迷宮，適應性自由活動5 min。然后，按以往報道的學習訓練方法[15]，將小鼠放至Y型電迷宮一臂內(nèi)，持續(xù)電刺激持續(xù)2 s（60 V，0.5～0.7 mA）。固定時間訓練10次/d，連續(xù)5 d，將測試成績達到連續(xù)10次中有9次（9/10）正確反應者（60只）納入試驗，反應遲鈍者（10只）被淘汰。

2.2 記憶測試

小鼠學習訓練完成24 h后測試10次，正確反映記為A，以其所占測試總數(shù)的百分比評價小鼠的記憶能力（A/10×100%），此值越高說明小鼠記憶能力越好。

2.3 VaD小鼠模型制備

將60只小鼠隨機分為假手術（Sham）組10只和造模組50只。采用 雙側頸總動脈阻斷結合尾部放血法[16]造模。10%水合氯醛（4.6 mL/kg）腹腔注射麻醉，仰臥固定，頸部正中切口，鈍性分離雙側頸總動脈，套4號絲線扣。拉緊絲扣，并夾閉動脈阻斷血流20 min，同時剪尾放血；松開絲扣灌注10 min后，再次阻斷血流20 min，第2次再灌后觀察10 min。假手術組僅分離頸總動脈，套絲扣，不阻斷血流，尾部不放血，其余步驟同模型組。

2.4 實驗動物分組及給藥

將造模成功的小鼠40只，隨機分為模型組（VaD）、CH-I給藥低（ VaD +CH-I-L）、中（VaD +CH-I-M）、高（VaD +CHI-H）三個劑量組和CBL陽性藥（VaD+CBL）組，每組各8只。造模后小鼠正常喂養(yǎng)，Sham組和VaD組每天按時注射0.9%氯化鈉溶液0.5 mL，VaD +CH-I-L、VaD +CH-I-M、VaD+CH-I-H各組按照10、20、30 mg/kg體質(zhì)量、VaD+CBL組按照10 mg/kg體質(zhì)量給藥，均為腹腔注射，0.5 mL，連續(xù)4周。

2.4 HE染色檢測 小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞損傷程度

末次給藥后進行行為學測試。每組取4只小鼠，水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)心臟灌注生理鹽水和多聚甲醛固定，完整取腦，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，連續(xù)冠狀切片（8 μm）。切片脫蠟水化，蘇木素染色3 min，分化液分化10 s，伊紅染色1 min。常規(guī)脫水、透明、封片。光鏡下觀察海馬結構，細胞核呈藍色、細胞質(zhì)呈不同程度的紅色。每張切片隨機觀察5個不重疊的高倍（40×）視野，計數(shù)細胞，取其均值。以變性細胞指數(shù)（DCI=變性細胞數(shù)/細胞總數(shù)）表示損傷程度。

2.5 小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡檢測

按照TUNEL試劑盒說明操作，取上述石蠟切片，常規(guī)脫蠟水化，3%H2O2室溫處理腦片10 min，蛋白酶K（1:200）37℃消化15 min；滴加標記液（TdT和Dig-d-UTP）20 μL/片，37℃標記2 h，室溫封閉30 min；滴加生物素化抗Dig抗體（效價1:100），37℃反應30 min；滴加SABC（效價1:100）50μL/片，37℃反應30 min，DAB顯色15 min，蘇木素復染5 s；常規(guī)脫水、透明、封片。光鏡下觀察胞核有棕色顆粒者為陽性細胞。陰性對照切片不加探針，用0.1M PBS代替染色不出現(xiàn)陽性反應。每只小鼠取4張連續(xù)切片，隨機計數(shù)每張切片4個高倍視野中陽性細胞數(shù)，取其均值。

2.6 Western Blot分析蛋白表達水平

每組取4只小鼠，水合氯醛麻醉，取海馬組織40 mg，提取蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗5 min×3次。滴加兔抗小鼠Akt、p-Akt、Casp-3、Casp-9、Bcl-2和β-actin抗體（效價1:1000），4℃孵育過夜。次日TBST溶液洗5 min×3次，HRP標記山羊抗兔IgG（效價1:10000），室溫孵育2 h，以β-actin作為內(nèi)參，ECL化學發(fā)光顯影。凝膠成像分析各條帶灰度值，以相對灰度值（relative value of protein，RVP）表示蛋白表達水平。RVP=目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值。

2.7 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 動物存活情況

模型組小鼠死亡10只，剩余40只隨機分為VaD組、VaD +CH-I-L、VaD +CH-I-M、VaD+CH-I-H組和VaD+CBL組，各8只；Sham組死亡2只，剩余8只。

3.2 CH-I改善VaD小鼠學習記憶能力

圖1A所示：造模前，各組小鼠達標所需要的學習次數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；造模小鼠出現(xiàn)嘗試次數(shù)較Sham組小鼠顯著性增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明造模成功后小鼠的學習能力均顯著下降。治療結束后，VaD組、VaD+CH-I-H組和VaD+CBL組小鼠嘗試次數(shù)較Sham組顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；但VaD+CHI-L組和VaD+CH-I-M組與Sham組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；VaD+CH-I-L、VaD+CH-I-M、VaD+CH-I-H組和VaD+CBL組小鼠嘗試次數(shù)較VaD組均顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。圖1B顯示，造模前，各組小鼠的學習記憶能力比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；造模后各組小鼠測試成功率較Sham組均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；給藥干預后，VaD組、VaD+CH-I-H組和VaD+CBL組小鼠測試成功率仍然低于Sham組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；VaD+CH-I-L、VaD+CH-I-M組測試成功率較VaD組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但VaD+CH-I-H組和VaD+CBL組與VaD組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。綜上表明，CH-I高劑量和CBL組小鼠的學習能力的改善程度低于CH-I低、中劑量組。

圖1 各組小鼠實驗前后學習記憶能力比較分析 （, n=8）

3.3 CH-I減少VaD小鼠海馬區(qū)域神經(jīng)細胞異常

造模成功后，VaD組小鼠海馬神經(jīng)元細胞變性數(shù)量較Sham組顯著增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），細胞形態(tài)異常，數(shù)量減少，胞核固縮，染色加深，排列紊亂。經(jīng)藥物干預治療后，Va D+CH-I-L組、VaD+CH-I-M組、VaD+CH-I-H組、Va D+CBL組小鼠海馬變性細胞數(shù)量較VaD組顯著性減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中，VaD+CH-I-L組和VaD+CH-I-M組的療效優(yōu)于VaD+CH-I-H組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而與VaD+CBL組相比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 治療后各組小鼠海馬區(qū)域HE染色不同倍數(shù)觀察結果 （, n=4）

3.4 CH-I降低VaD小鼠海馬區(qū)域凋亡細胞數(shù)

造模成功后，VaD組小鼠海馬凋亡細胞數(shù)較Sham組顯著明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。經(jīng)藥物干預治療后，各給藥組海馬區(qū)域凋亡細胞數(shù)減少，與VaD組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與VaD+CH-I-H組比較，VaD+C H-I-L組的效果更佳，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而VaD+C H-I-L組和VaD+CH-I-M組與VaD+CBL組相比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 治療后各組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)的高差結果 （, n=4）

3.5 CH-I對VaD小鼠海馬組織Akt、p-Akt表達的影響

造模成功后，VaD組小鼠的p-Akt/Akt表達較Sham組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。經(jīng)藥物干預治療后，給藥各組p-Akt/Akt表達增加，與VaD組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；但VaD+CH-I-L組和VaD+CH-I-M組的治療效果與VaD+CBL組相比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖4。

圖4 治療后各組海馬組織Akt、p-Akt表達情況 （, n=4）

3.6 CH-I對VaD小鼠海馬組織Casp-9、Casp-3、Bcl-2的影響

造模成功后，VaD小鼠海馬組織Casp-9及Casp-3表達較Sham組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而Bcl-2表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。經(jīng)藥物干預治療后，VaD+CH-I-L 組、VaD+CH-I-M組和VaD+CH-I-H組Casp-9及Casp-3表達較VaD組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但VaD+CBL組表達未見顯著性變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；Bcl-2表達相比較，VaD+CH-I-L組和VaD+CH-I-M組表達較VaD組均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），VaD+CH-I-H 組與VaD組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；但VaD+CBL組表達顯著低于Sham組和VaD組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 各組海馬組織Casp-9、Casp-3、Bcl-2表達情況（ , n=4）

4 討論

缺血性卒中是嚴重危害人類健康的疾病，血管性癡呆和卒中后抑郁癥是其后遺癥，給患者自身、家庭和社會均帶來嚴重的負擔。血管性癡呆的發(fā)展過程與慢性腦缺血相關[17]。本實驗采取雙側頸總動脈阻斷結合尾部放血的改良方法，盡可能避免大腦動脈環(huán)的代償作用，以達到更好的腦缺血效果[16]。前海馬體是腦組織中負責情節(jié)記憶、認知的部分[18]，對缺血十分敏感，夾閉沙鼠雙側頸總動脈5 min再灌注后，海馬CA1區(qū)域神經(jīng)元明顯丟失[19]。本實驗發(fā)現(xiàn)，VaD小鼠CA1區(qū)域的海馬神經(jīng)細胞數(shù)量減少，形態(tài)異常，經(jīng)CH-I作用后，異常細胞數(shù)量減少。

本研究顯示，造模成功后的VaD小鼠海馬CA1區(qū)凋亡陽性細胞顯著增加，經(jīng)CH-I干預作用后，凋亡陽性細胞數(shù)目明顯減少，結果表明CH-I可以在一定程度上抑制海馬神經(jīng)細胞的凋亡。細胞凋亡有外源性和內(nèi)源性兩條基本的凋亡信號轉(zhuǎn)導途徑。其中，內(nèi)源性的凋亡途徑是由細胞內(nèi)的各種刺激因素而激活的，它依賴于細胞膜發(fā)生內(nèi)陷、分割包裹胞質(zhì)形成的凋亡小體（Apoptoticbody）而發(fā)揮作用。天冬氨酸蛋白酶-9（Casp-9）是組成凋亡小體的部分之一，在哺乳動物中，Caspases是細胞凋亡的主要執(zhí)行者，其中Casp-3被稱為“凋亡步兵”，其激活過程受到B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2）家族蛋白的嚴格控制[20]。本實驗中，通過TUNEL和免疫組化及WesternBlot對Bcl-2、Casp-9、Casp-3蛋白的檢測，證實了在VaD小鼠模型的海馬組織中存在著神經(jīng)元的凋亡。在CH-I干預治療后，VaD小鼠海馬神經(jīng)細胞Casp-9、Casp-3蛋白水平降低，同時伴隨Bcl-2蛋白水平升高，這一結果表明，CH-I能抑制海馬區(qū)域與這些凋亡相關蛋白有關的神經(jīng)細胞凋亡過程。磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB/Akt）信號轉(zhuǎn)導通路是一條極為重要的促進神經(jīng)細胞生長和存活的信號通路，已被證實與抑制凋亡相關[21]。在腦缺血損傷模型、脊髓損傷模型以及多種其他形式的神經(jīng)元損傷中，也已證實PKB/Akt信號轉(zhuǎn)導在促神經(jīng)元存活中發(fā)揮著重要作用[22]。本研究結果表明，VaD小鼠模型的海馬神經(jīng)細胞中，p-Akt/Akt的比值顯著降低，而經(jīng)過CH-I干預治療后，各組p-Akt/Akt的比值均明顯升高，表明CH-I可能通過激活Akt二產(chǎn)生p-Akt，使其發(fā)揮了重要的促神經(jīng)細胞生存作用。

綜上所述，CH-I可能是通過激活VaD小鼠海馬神經(jīng)細胞的Akt基因，上調(diào)Bcl-2表達，同時下調(diào)Casp-9及Casp-3表達，抑制海馬神經(jīng)細胞凋亡，從而改善VaD小鼠的學習記憶能力。