核酸提取試劑盒對飼料中牛羊源性成分檢測的影響

李 泰,朱英才,駱 璐,彭 強,凌洪權(quán),廖星杰,王 欽,張承雙

(重慶市動物疫病預(yù)防控制中心,重慶 401120)

標準NY/T 1946-2010中給出了檢測飼料中牛羊源性成分的具體方法,但是在日常的檢測工作中,如果僅是按照標準提示,而沒有弄清實驗中若干重要的節(jié)點部分,則會出現(xiàn)相同的檢測樣品,不同的結(jié)果。為了說明這一問題,本試驗購買了市面上提取核酸主要的幾類試劑盒A、B、C和D,D為手提試劑盒,其余三個為機提試劑盒,通過實驗比對,發(fā)現(xiàn)機提試劑盒A和手提試劑盒D提取的DNA在后續(xù)的熒光PCR實驗中有Ct值,其他兩個沒有,而有Ct值的,其結(jié)果也不能很好地相互印證,本研究通過平行實驗的比對,發(fā)現(xiàn)核酸提取試劑盒是影響檢測結(jié)果的主要因素。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要儀器

Bio-Rad CFX96TMReal-Time System C1000 TouchTMThermal Cycler(Bio-Rad, USA),全自動核酸提取儀(S廠家),SmartSpecTMPlus Spectrophotometer(Bio-Rad, USA) 。

1.1.2主要試劑

核酸機提試劑盒A;核酸手提試劑盒D;羊源性成分(Ovine)核酸檢測試劑盒(熒光PCR法),批號:OVIN22072901,生產(chǎn)日期:2022-07-29,有效期至2023-07-28,廣州維伯鑫生物科技股份有限公司;牛源性成分(Bovine)核酸檢測試劑盒(熒光PCR法),批號:BOVI230113011,生產(chǎn)日期:2023-01-13,有效期至2024-01-12,廣州維伯鑫生物科技股份有限公司。

1.1.3主要材料

Low-Profile PCR Tubes 8-tube strip, white, Catalog# TLS0851,BIO-RAD; Optical Flat 8-cap strips for 0.2 ml tube strips/plates, Catalog# TCS0803,BIO-RAD;Sharpie marker, USA.

1.2 方法

首先通過預(yù)試驗,對4個核酸提取試劑盒進行篩選。再稱取魚粉、陰性對照(該陰性對照是以前用普通PCR檢測定性的被檢樣品)、0.1%陽性對照和0.25%陽性對照各兩份,每份50 mg,同時設(shè)置空白對照(水),隨機分成兩組,按照NY/T 1946-2010和核酸提取試劑盒的操作要求,用優(yōu)選的機提試劑盒A和手提試劑盒D分別進行獨立的核酸提取。提取的核酸再分別進行牛源性成分和羊源性成分熒光PCR法核酸檢測,操作步驟和上機檢測程序按照核酸檢測試劑盒說明書執(zhí)行。通過對檢測的Ct值進行比對,了解核酸提取試劑盒的選擇在檢測飼料中牛羊源性成分中的重要性。

2 結(jié)果

空白對照(水)、魚粉和陰性對照分別經(jīng)核酸機提試劑盒A處理,熒光PCR檢測,其牛羊源性成分Ct值均為無,0.1%陽性對照的牛羊源性成分Ct值分別為30.38和28.38,0.25%陽性對照的牛羊源性成分Ct值分別為28.03和27.04。經(jīng)核酸手提試劑盒D處理的空白對照(水),其核酸經(jīng)熒光PCR檢測牛羊源性成分Ct值均為無,魚粉的牛羊源性成分Ct值分別為37.00和39.67,陰性對照的牛羊源性成分Ct值分別為39.33和37.21,0.1%陽性對照的牛羊源性成分Ct值分別為22.97和21.79,0.25%陽性對照的牛羊源性成分Ct值分別為21.87和21.04,實驗結(jié)果見表1。

表1 兩種核酸提取試劑盒的檢測情況

3 討論

從實驗結(jié)果可以看出,0.25%陽性對照經(jīng)核酸手提試劑盒D處理與經(jīng)核酸機提試劑盒A處理,其牛羊源性成分Ct值兩者平均值相差為6;同樣,0.1%陽性對照經(jīng)兩種提取試劑盒處理,其Ct值平均相差為7。經(jīng)核酸手提試劑盒D處理的陰性對照,其牛羊源性成分Ct值的平均值為38.27,那么核酸機提試劑盒A處理的陰性對照,其牛羊源性成分Ct值的平均值就約為44.77;同樣,經(jīng)核酸手提試劑盒D處理的魚粉,其牛羊源性成分Ct值的平均值為38.335,那么核酸機提試劑盒A處理的魚粉其牛羊源性成分Ct值的平均值就約為44.835,但事實上,核酸機提試劑盒A處理的陰性對照和魚粉,其牛羊源性成分Ct值均為無,其實這是因為Ct值44.77和44.835已經(jīng)超出了試劑盒的檢測范圍,而進一步溯源則是因為核酸提取試劑盒不同,經(jīng)核酸手提試劑盒D處理得到的核酸,其濃度和A260/A280值均高于核酸機提試劑盒A所提取核酸的指標(數(shù)據(jù)未展示)。

含牛羊源性成分的動物源性飼料的使用[1],被認為是瘋牛病傳播的主要途徑,禁止疫區(qū)含牛羊源性成分的動物源性飼料的生產(chǎn)、流通和使用,是預(yù)防瘋牛病感染、流行的主要手段之一[2-4]。同時隨著飼料工業(yè)的精細化發(fā)展,特別是部分部門和人群(如進出口貿(mào)易和兒童)對肉品質(zhì)量的更高要求,就亟需嚴把飼料檢測環(huán)節(jié)。為切實強化飼料質(zhì)量安全監(jiān)管,提高畜產(chǎn)品質(zhì)量安全水平,促進畜牧業(yè)高質(zhì)量發(fā)展[5],在運用熒光PCR法檢測飼料中牛羊源性成分時[6-7],更應(yīng)注意核酸提取試劑盒的選擇。