秦 祎,胡文潔,方小偉,郭 騫,田籃鑫,劉 芳,方 春*

(1.長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,荊州 434025;2.衡水市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊(duì),衡水 053000)

產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌(Listeriamonocytogenes,LM)是細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭陽(yáng)性菌,也是一種食源性人獸共患病原菌[1]。產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌具有較強(qiáng)的抗應(yīng)激能力,例如酸性環(huán)境,堿性環(huán)境,低溫等[2]。產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌的生存和繁殖所需的養(yǎng)分來(lái)自宿主細(xì)胞,而如何從宿主細(xì)胞中攝取所需的養(yǎng)分,是LM生存的關(guān)鍵因素[3]。產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌可以通過(guò)污染的食物進(jìn)入胃腸道后擴(kuò)展至血液循環(huán)與淋巴循環(huán)進(jìn)而突破胎盤屏障,血腦屏障等,在其感染過(guò)程的每一步均由特定的毒力因子介導(dǎo)(如InlA與InlB)[4-5]。

磷壁酸是革蘭陽(yáng)性菌的一種特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu),其中包含了脂磷壁酸(lipoteichoic acid, LTA)和壁磷壁酸(wall teichoic acid, WTA)[6]。脂磷壁酸是革蘭陽(yáng)性細(xì)菌中重要的細(xì)胞壁聚合物,通常由聚甘油磷酸骨架組成,該骨架通過(guò)糖脂與膜相連,使用生物信息學(xué)方法已經(jīng)確定參與糖脂(lmo2555和lmo2554)和LTA骨架(lmo0644和lmo0927)合成的產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌基因[7]。lmo0927和lmo0644編碼的蛋白質(zhì)與負(fù)責(zé)聚甘油磷酸骨架合成的葡萄球菌LTA合成酶LtaS具有高度相似性。lmo0644充當(dāng)LTA引發(fā)酶LtaP并將初始甘油磷酸轉(zhuǎn)移到糖脂錨上,而Lmo0927作為L(zhǎng)TA合成酶LtaS,延長(zhǎng)甘油磷酸骨架[7]。

在產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌中,磷壁酸能夠影響參與穿越宿主屏障的蛋白質(zhì)與細(xì)胞壁共價(jià)或非共價(jià)相關(guān)蛋白。如InlA和InlB都是由細(xì)胞表面蛋白或分泌蛋白組成的,它們能夠轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外并且錨定在特定部位,這對(duì)產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌的功能起著關(guān)鍵作用。雖然參與產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌蛋白轉(zhuǎn)位的系統(tǒng)有六個(gè),如菌毛蛋白裝置(FPE)、鞭毛輸出裝置(FEA)、雙精氨酸分泌系統(tǒng)(Tat)以及Sec轉(zhuǎn)位系統(tǒng)等[8],但是Sec分泌系統(tǒng)是最重要的蛋白轉(zhuǎn)位系統(tǒng)之一。InlA和InlB都是通過(guò)Sec體系進(jìn)行轉(zhuǎn)位的,在InlA轉(zhuǎn)位后,其LPXTG基因的基因序列被用 SrtA和細(xì)胞壁進(jìn)行了共價(jià)的連接[9]。而InlB經(jīng)折疊處理后,以非共價(jià)態(tài)固定于GW基鏈上的細(xì)菌表面,并且包含LTA和WTA。本文構(gòu)建脂磷壁酸合成酶ltaS基因缺失株,并且通過(guò)Western blot試驗(yàn)、細(xì)胞黏附侵襲試驗(yàn)、細(xì)胞吞噬與胞內(nèi)增殖試驗(yàn)、小鼠致病性試驗(yàn)來(lái)分析脂磷壁酸合成酶ltaS基因的缺失對(duì)產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌InlA和InlB錨定中的作用以及對(duì)產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌毒力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料 產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌EGDe-prfA*(血清型為1/2a型),穿梭質(zhì)粒pKSV7由長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物病原微生物實(shí)驗(yàn)室保存。雞成纖維細(xì)胞DF-1細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞由長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物病原微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。BALB/c小鼠購(gòu)自長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑 腦心營(yíng)養(yǎng)肉湯(BHI,HB8297-5)從青島高新技術(shù)園區(qū)海博生物科技有限公司購(gòu)入;HRP標(biāo)記山羊抗兔 IgG及 ECL顯影液從上海生工生物科技有限公司購(gòu)入;核酸染料 Goldview從北京索萊寶科技有限公司購(gòu)入;Onestep無(wú)縫克隆試劑盒從北京康普匯維科技有限公司購(gòu)入;瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒及 DNA Marker購(gòu)自武漢擎科生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 缺失株的構(gòu)建 缺失株構(gòu)建方法按參照文獻(xiàn)進(jìn)行[10-11],基于產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌EGDe基因組(登錄號(hào)NC003210)利用Vector NTI軟件設(shè)計(jì)目的基因ltaS(lmo0927)缺失株所需的引物(表1);首先用引物pFL018-A/B和pFL018-C/D擴(kuò)增出ltaS上游及下游的同源臂。將第一輪PCR產(chǎn)物共同回收純化作為 PCR模板,用pFL018-A/D引物進(jìn)行融合同源臂。純化融合的同源臂,連接經(jīng)過(guò)BamHⅠ線性化載體pKSV7構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pFL018。使用電轉(zhuǎn)法將重組穿梭質(zhì)粒pFL018轉(zhuǎn)入親本株感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)41 ℃的連續(xù)氯霉素抗性傳代進(jìn)行同源性重組,再28 ℃連續(xù)無(wú)抗傳代消除質(zhì)粒,使用旁側(cè)引物pFL018-A/E PCR鑒定缺失株ΔltaS構(gòu)建成功。

表1 本研究所用的引物

1.2.2 生物學(xué)特性的測(cè)定 生長(zhǎng)曲線試驗(yàn)測(cè)定方法按參照文獻(xiàn)進(jìn)行[12],將EGDe-prfA*和ΔltaS挑單菌落于3 mL BHI培養(yǎng)基中,37 ℃搖床220 r·min-1過(guò)夜培養(yǎng)。次日取1 mL菌液,12 000 r·min-1離心后用1 mL BHI重懸菌體,使用BHI稀釋至10-2,渦旋混勻后取200 μL菌液接于96孔板,每個(gè)組設(shè)3個(gè)平行,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每間隔1 h使用酶標(biāo)儀測(cè)定OD600 nm值直至細(xì)菌生長(zhǎng)平臺(tái)期。

使用革蘭染色法觀察細(xì)菌的形態(tài)特征,分別挑取EGDe-prfA*和ΔltaS的單菌落于3 mL BHI液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。次日取1 mL菌液,12 000 r·min-1離心后用1 mL 1×PBS重懸菌體后取10 μL菌液涂布于載玻片中間,干燥、固定后進(jìn)行染色,初染滴加草酸鉸結(jié)晶紫水洗后滴加碘液媒染,媒染后使用95%乙醇脫色,最后用番紅復(fù)染再水洗,自然干燥后使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)的觀察。

1.2.3 Western blot檢測(cè) 蛋白樣品制備參照文獻(xiàn)進(jìn)行[13],將菌液劃線于無(wú)抗BHI平板,置于37 ℃ 培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng);次日挑取單菌落于無(wú)抗BHI培養(yǎng)基中37 ℃ 搖床220 r·min-1過(guò)夜培養(yǎng);將培養(yǎng)菌液按1∶50轉(zhuǎn)接于50 mL BHI培養(yǎng)基,置于37 ℃搖床220 r·min-1培養(yǎng)10 h后12 000 r·min-1離心收集上清和菌體沉淀。菌體沉淀用PBS洗滌后加入含2% SDS的PBS重懸,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置2 h,間隔10 min渦旋一次,最后12 000 r·min-1離心并收集上清,則為表面蛋白樣品。取40 μL蛋白樣品加入10 μL的 SDS-PAGE上樣緩沖液混勻,煮沸10 min后離心。按相應(yīng)配方配制12% SDS-PAGE蛋白膠,將預(yù)染蛋白 Marker及10 μL樣品一次加入膠孔,進(jìn)行SDS-PAGE分離濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜(80 min 230 mA)將PAGE膠上蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上封閉采用1×TBST配制5%脫脂乳浸泡膜,置于25 ℃的搖床60 r·min-1封閉2 h;用 1×TBST清洗2～3次,然后將膜放入一抗溶液中,一抗為5%脫脂乳(TBST 配制),對(duì)應(yīng)于1∶500的自制InlA、InlB、GAPDH多克隆抗體血清,在4 ℃靜置孵育過(guò)夜;次日使用 1×TBST清洗膜5次,每次10 min;二抗在5%的脫脂乳與1∶5 000羊抗兔IgG二抗中,置于25 ℃ 60 r·min-1的搖床中培養(yǎng)1 h;二抗孵育完成后,使用 1×TBST清洗5次,每次10 min,將 ECL顯影液均勻鋪于薄膜表面,并使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影。使用軟件Image J分析軟件對(duì)Western blot圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行灰度分析,用內(nèi)參GAPDH灰度值校正各組分中對(duì)應(yīng)的目的條帶灰度值,相對(duì)灰度值為校正后缺失株的灰度值與親本株比值。

1.2.4 細(xì)胞黏附與侵襲試驗(yàn) 試驗(yàn)方法按參照文獻(xiàn)進(jìn)行[12],將DF-1細(xì)胞以2×105細(xì)胞·孔-1接種于24孔板,在5% CO2培養(yǎng)皿中靜置過(guò)夜,24 h后,用950 μL的無(wú)抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)液替代;添加50 μL的稀釋度適宜的菌液,使感染的復(fù)數(shù)(MOI)大約為10∶1,將其混勻后置于37 ℃ 的5% CO2培養(yǎng)皿內(nèi),用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)實(shí)際感染劑量N0。黏附試驗(yàn),感染后30 min,棄掉培養(yǎng)液,PBS清洗3次,將1 mL ddH2O加入各個(gè)孔,充分吹打使細(xì)胞裂解,稀釋后用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)黏附的菌數(shù)目N1。黏附率計(jì)算方法為N1/N0×100%。侵襲試驗(yàn),感染后30 min,棄掉培養(yǎng)液,PBS清洗3次后添加含有50 μg·mL-1慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后用PBS洗3次,使用相同的方式進(jìn)行細(xì)胞裂解,用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)入侵細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)量N2,侵襲率計(jì)算方法為N2/N0×100%。

1.2.5 細(xì)胞吞噬與巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖試驗(yàn) 細(xì)菌吞噬與巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖試驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)方法與黏附侵襲試驗(yàn)相同。細(xì)菌抗吞噬試驗(yàn),細(xì)菌與細(xì)胞混勻感染30 min后,棄掉培養(yǎng)液,PBS清洗3次后添加含有50 μg·mL-1慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫養(yǎng)1 h,根據(jù)細(xì)胞黏附侵襲試驗(yàn)棄培養(yǎng)液,清洗,裂解細(xì)胞,稀釋,用平板計(jì)數(shù)測(cè)定吞噬細(xì)胞的數(shù)量N3。巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖試驗(yàn),細(xì)菌與細(xì)胞混勻感染30 min后,棄掉培養(yǎng)液,PBS清洗3次后添加含有50 μg·mL-1慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫養(yǎng)4 h,棄培養(yǎng)液、清洗、細(xì)胞裂解、稀釋,用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)細(xì)胞的數(shù)量N4。吞噬率計(jì)算方法為N3/N0×100%;增殖倍數(shù)計(jì)算方法為N4/N3,試驗(yàn)3次重復(fù)。

1.2.6 小鼠致病性試驗(yàn) 將BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組,親本株組和缺失株組各12只,未感染組5只,飼養(yǎng)一周,使小鼠適應(yīng)環(huán)境。菌液劃線于無(wú)抗BHI平板,置于37 ℃ 培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。第二天離心收菌,用PBS緩沖液(磷酸鹽緩沖液)洗滌3次,調(diào)節(jié)OD600 nm至0.6,然后將菌液用PBS稀釋100倍。將稀釋的菌液經(jīng)腹腔注射感染小鼠,每只注射0.2 mL(約為4.0×106CFU)用點(diǎn)板計(jì)數(shù)來(lái)測(cè)定真實(shí)的感染劑量,未感染組的5只小鼠注射0.2 mL PBS,作為對(duì)照。在注射后48 h隨機(jī)選擇親本株組和缺失株組小鼠各7只,在超凈臺(tái)中無(wú)菌操作取出小鼠肝和脾,磨碎后在研缽中加入1 mL的PBS緩沖液轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi),再將組織原液進(jìn)行梯度稀釋點(diǎn)板計(jì)算肝和脾細(xì)菌數(shù)量。各組剩余的5只小鼠,繼續(xù)觀察,記錄存活情況,繪制存活曲線。對(duì)于LD50試驗(yàn),將原始菌液(約為2.0×109CFU)梯度稀釋至10-2、10-3、10-4三個(gè)梯度,每個(gè)梯度腹腔接種0.2 mL至BALB/c小鼠,每組8只。使用改良寇氏法計(jì)算7 d內(nèi)親本株EGDe-prfA*與缺失株ΔltaS對(duì)BALB/c小鼠半數(shù)致死量LD50。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 用3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表達(dá)結(jié)果,用 GraphPad Prism 5作圖,采用非配對(duì)t檢驗(yàn)(unpairedttest)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P<0.05表明有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,差異顯著,使用“*”標(biāo)注;P<0.01表明有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,差異極顯著,使用“**”標(biāo)注;P>0.05表明差異不顯著,使用“ns”標(biāo)注。

2 結(jié) 果

2.1 缺失株的構(gòu)建

親本株EGDe-prfA*基因組作為模板,用引物pFL018-A/B和pFL018-C/D,分別獲得上游同源臂610 bp、下游同源臂697 bp片段。(圖1A);將PCR產(chǎn)物回收純化后作為模板,用引物pFL018-A/D進(jìn)行擴(kuò)增,獲得1 307 bp的融合同源臂片段(圖1A)。將融合同源臂片段純化后與線性化的pKSV7重組連接轉(zhuǎn)化后成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pFL018(圖1 B)。使用電轉(zhuǎn)法將重組質(zhì)粒pFL018轉(zhuǎn)入親本株感受態(tài)細(xì)胞中(圖1B),經(jīng)41 ℃的持續(xù)性有抗傳代來(lái)篩選重組后的菌株,并在28 ℃連續(xù)無(wú)抗傳代,以不間斷傳代的方式消除質(zhì)粒,使用旁側(cè)引物采用PCR方法鑒定篩選缺失株ΔltaS(圖1C)。

M.DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. 上游同源臂;2. 下游同源臂;3. 融合的同源臂;4. DH5α-pFL018;5.EGDe-prfA*-pFL018;6. 親本株EGDe-prfA*;7. 缺失株ΔltaSM.DNA marker;1. Upstream homology arm; 2. Downstream homology arm; 3. Fusion homologous arm; 4. DH5α-pFL018; 5. EGDe-prfA*-pFL018; 6. Parent strain EGDe-prfA*; 7. Mutant strain ΔltaS

2.2 ltaS缺失不影響產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌的生長(zhǎng)和菌體形態(tài)

體外培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明,缺失株ΔltaS與親本株EGDe-prfA*在細(xì)菌遲緩期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期以及平臺(tái)期基本一致(圖2A)。將缺失株ΔltaS與親本株EGDe-prfA*進(jìn)行革蘭染色后鏡檢發(fā)現(xiàn)菌體形態(tài)無(wú)變化(圖2B)。

圖2 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定(A)以及細(xì)菌形態(tài)觀察(B)Fig.2 Determination of bacterial growth curve (A) and observation of bacterial morphology (B)

2.3 ltaS缺失減少產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌表面錨定的InlB

Western blot試驗(yàn)分析InlA和InlB在產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌表面的錨定情況,灰度分析結(jié)果顯示,與親本株相比,在缺失株ΔltaS表面,InlA和InlB錨定量極顯著降低(P<0.01)(圖3)。結(jié)果說(shuō)明ltaS基因缺失后顯著減少InlA和InlB在產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌表面的錨定。

*.差異顯著(P<0.05);**.差異極顯著(P<0.01);ns.無(wú)顯著差異(P>0.05)。下同*.Significant difference(P<0.05);**.Extremely significant difference(P<0.01);ns.No significant difference(P>0.05).The same as below

2.4 ltaS缺失顯著降低產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌對(duì)細(xì)胞的黏附侵襲能力

細(xì)胞黏附試驗(yàn)結(jié)果表明,缺失株ΔltaS對(duì) DF-1細(xì)胞的黏附率極顯著低于親本株EGDe-prfA*的黏附率(P<0.01)(圖4A);細(xì)胞侵襲試驗(yàn)結(jié)果表明,缺失株ΔltaS對(duì) DF-1 細(xì)胞的侵襲率極顯著低于親本株EGDe-prfA*的侵襲率(P<0.01)(圖4B)。

細(xì)菌對(duì)DF-1細(xì)胞的黏附率(A)和侵襲率(B)Bacterial adhesion rate (A) and invasion rate (B) to DF-1 cells

2.5 ltaS缺失顯著降低產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖能力

試驗(yàn)結(jié)果表明,小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7對(duì)ΔltaS的吞噬率與親本株EGDe-prfA*無(wú)顯著性差異(P>0.05)(圖5A);產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖試驗(yàn)結(jié)果表明,在RAW 264.7中,ΔltaS與親本菌株EGDe-prfA*的增殖倍數(shù)存在明顯差異(P<0.05)(圖5B)。這說(shuō)明ltaS基因缺失顯著降低產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖能力。

RAW264.7對(duì)細(xì)菌吞噬率(A)和細(xì)菌在RAW264.7細(xì)胞中增殖倍數(shù)(B)Bacterial phagocytosis rate (A) and bacterial proliferation factor in RAW264.7 cells (B)

2.6 ltaS缺失顯著減弱產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌對(duì)小鼠的致病性

以BALB/c小鼠為動(dòng)物模型去評(píng)估產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌的致病性。小鼠臟器載菌量試驗(yàn)結(jié)果表明,感染后48 h內(nèi)缺失株ΔltaS感染的小鼠肝中的細(xì)菌載量與親本株EGDe-prfA*相比細(xì)菌載量極顯著降低(P<0.01);與親本菌株相比,在小鼠脾中的細(xì)菌載量也極顯著降低(P<0.01)(圖6A)。在存活試驗(yàn)中通過(guò)改良寇氏法計(jì)算得出EGDe-prfA*與ΔltaS對(duì)BALB/c小鼠半數(shù)致死量LD50分別為1.7×104CFU 和7.49×106CFU。EGDe-prfA*感染后4 d時(shí)小鼠全部死亡,ΔltaS感染后4 d還有80%存活率(圖6B)。結(jié)果表明ltaS基因缺失能降低產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌致病力。

圖6 ltaS基因缺失對(duì)產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌感染小鼠肝和脾中細(xì)菌載量(A)以及存活率(B)的影響Fig.6 Effects of ltaS gene deletion on bacterial load in liver and spleen (A) and survival rate (B) of Listeria monocytogenes infected mice

3 討 論

產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌是革蘭陽(yáng)性食源性致病菌,通過(guò)消化道感染人體,并且可以突破宿主三大屏障,胎盤屏障、腸道屏障以及血腦屏障,可引發(fā)孕婦流產(chǎn),宿主腦膜炎、敗血癥,嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致死亡[14]。LTA是由多個(gè)核糖醇連接而成的大分子聚合物,是革蘭陽(yáng)性菌(G+)細(xì)胞壁上的一種具有高度免疫能力的特殊多聚體,它是由磷酸氫核糖醇和/或磷酸甘油酯與細(xì)胞膜的脂質(zhì)共價(jià)鍵合而成,為兩性分子,一端與細(xì)胞膜上的脂質(zhì)共價(jià)鍵合,而另一端則通過(guò)細(xì)胞壁向外伸展[15-17]。LTA是革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞壁所特有的,研究表明LTA對(duì)革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞壁的修飾很重要而細(xì)胞壁的功能修飾往往會(huì)對(duì)毒力因子錨定產(chǎn)生影響[18]。在產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌中脂磷壁酸是由脂磷壁酸合成酶ltaS和脂磷壁酸引物酶ltaP兩個(gè)基因編碼產(chǎn)物合成。

本研究利用同源重組技術(shù)成功構(gòu)建脂磷壁酸合成酶ltaS基因缺失株,評(píng)估親本株EGDe-prfA*與缺失株ΔltaS生長(zhǎng)能力與細(xì)菌形態(tài),對(duì)毒力因子錨定、細(xì)胞黏附侵襲率、細(xì)胞吞噬能力和巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖能力以及對(duì)小鼠致病性等生物學(xué)特性。生長(zhǎng)曲線試驗(yàn)表明ltaS基因缺失并不影響產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌在BHI中的正常生長(zhǎng),并且光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)大小無(wú)差別。Western blot試驗(yàn)結(jié)果表明ltaS基因缺失會(huì)極顯著降低產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌細(xì)胞壁表面InlA與InlB蛋白含量。InlA與InlB是在產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌感染過(guò)程中重要的毒力因子,有幫助其穿越宿主胃腸屏障的功能。InlA介導(dǎo)細(xì)菌通過(guò)E-鈣黏蛋白入侵細(xì)胞,而InlB則是一種特異性更低的入侵蛋白[19-20]。研究表明,InlB與LTA結(jié)合主要是與該蛋白質(zhì)和該聚合物的聚甘油磷酸骨架的特異性相互作用[21-22],并且兩者以非共價(jià)錨定方式在細(xì)菌表面[23-24]。當(dāng)ltaS基因缺失時(shí)會(huì)導(dǎo)致LTA骨架合成失敗,進(jìn)而導(dǎo)致InlB在細(xì)胞表面錨定量降低。然而InlA和InlB是由同一操縱子編碼的蛋白質(zhì),InlB是InlA依賴性侵襲途徑中的促進(jìn)者,InlB錨定量的降低會(huì)影響InlA對(duì)細(xì)胞侵襲量[25-27]。這也可能是InlA與InlB在缺失株ΔltaS中錨定量降低的主要原因。

體外細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果表明,ltaS基因缺失會(huì)極顯著影響產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌對(duì)DF-1細(xì)胞的黏附侵襲能力,這與前面Western blot結(jié)果相符的。由于ltaS基因缺失導(dǎo)致胞外InlA與InlB含量減少,產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌黏附侵襲能力減弱。ltaS基因缺失不影響巨噬細(xì)胞RAW264.7對(duì)產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌的吞噬能力,但是在巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖能力極顯著減弱。體外動(dòng)物致病性試驗(yàn)通過(guò)小鼠臟器載菌量以及小鼠存活試驗(yàn)表明,ΔltaS感染的小鼠肝與脾中的細(xì)菌載量與親本株EGDe-prfA*相比細(xì)菌載量極顯著降低。Webb等[7]提出雙酶系統(tǒng)進(jìn)行 LTA 合成,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌內(nèi)兩個(gè) LtaS 旁系物的不同酶促功能。在沒(méi)有LtaP的情況下,LtaS可以使用糖脂作為錨點(diǎn)。但是ltaS缺失影響細(xì)菌表面LTA合成,在Δlmo0927中完全不存在LTA[7]。DltABCD基因家族主要功能是對(duì)LTA進(jìn)行D-丙氨?；揎?通過(guò)催化D-丙氨酸殘基與細(xì)胞壁脂磷壁酸結(jié)合。當(dāng)LTA合成減弱時(shí),Dlt家族基因無(wú)法進(jìn)行修飾導(dǎo)致無(wú)法正常發(fā)揮功能。Abachin等[28]發(fā)現(xiàn)DltABCD失活會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌在小鼠肝與脾載量降低,并且在巨噬細(xì)胞(BMM)內(nèi)增殖能力減弱,推測(cè)可能是由于ltaS基因缺失影響Dlt家族基因功能導(dǎo)致產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌致病性減弱。

4 結(jié) 論

ltaS基因缺失會(huì)減少產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌表面毒力因子InlA和InlB的錨定量并且會(huì)減弱對(duì)DF-1細(xì)胞的黏附侵襲能力。ltaS基因缺失會(huì)減弱產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌在小鼠臟器載量并且降低致死率。本研究將為脂磷壁酸合成酶ltaS基因后續(xù)的機(jī)制探索奠定基礎(chǔ)。