王晉宇,張凱川,王芮杰,高 鐸,蔣祺豐,賈 坤

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣州 510642)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)是一種革蘭陰性專性需氧菌,也稱綠膿桿菌,廣泛存在于土壤、空氣、海河以及人類和動(dòng)植物生活的環(huán)境中,能夠引起動(dòng)物機(jī)體的各種感染,例如皮膚感染、子宮內(nèi)膜炎、乳腺炎和腸道感染等。銅綠假單胞菌也是醫(yī)院內(nèi)一種常見的機(jī)會性致病菌,當(dāng)宿主防御系統(tǒng)受到損傷,導(dǎo)致機(jī)體免疫功能下降時(shí),易發(fā)生銅綠假單胞菌感染[1]。由于該致病菌引發(fā)的感染病癥反復(fù),治療時(shí)間長,所以難以徹底治愈[2]。同時(shí),銅綠假單胞菌引起的呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎(VAP)占能夠造成VAP的細(xì)菌的10%～20%[3],也是導(dǎo)致尿路感染的主要病因之一[4]。銅綠假單胞菌在潮濕環(huán)境中更易感染燒傷患者,引發(fā)各種并發(fā)癥[5],由于其引起的菌血癥死亡率高達(dá)43.2%～58.8%,應(yīng)得到廣泛關(guān)注[6]。

噬菌體是一種能夠感染細(xì)菌、真菌以及放線菌等微生物的病毒,在地球上儲量豐富,可達(dá)到1031[7],能夠從土壤、海洋、污水以及廢品中分離得到。而且噬菌體對細(xì)菌的殺滅作用是獨(dú)特的,具有高宿主特異性和低毒性,幾乎不影響正常菌群[8]。此外,噬菌體在各種環(huán)境下有較強(qiáng)的適應(yīng)性和對多重耐藥(MDR)病原體的有效活性,也被視為抗生素的潛在替代品[9-10]。近年來,應(yīng)用噬菌體治療MDR細(xì)菌感染的案例屢見不鮮,一項(xiàng)動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示,與陰性對照組相比(無感染組愈合率為97.43%),被MDR肺炎克雷伯菌感染的傷口經(jīng)噬菌體處理過表現(xiàn)出最高為99%的愈合效率,證明了應(yīng)用噬菌體治療的可能性[11]。與此同時(shí),銅綠假單胞菌噬菌體全基因組的測序工作也得到快速發(fā)展,2019年3月,NCBI數(shù)據(jù)庫中登錄的假單胞菌噬菌體全基因組序列有357株,其中93%的噬菌體具有雙鏈DNA結(jié)構(gòu)[12],截至2023年5月,上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫中的全基因組序列已經(jīng)達(dá)到773株,在此期間還發(fā)現(xiàn)一株新型巨型銅綠假單胞菌噬菌體vB_PaeM_MIJ3[13]。因此,對噬菌體的研究還需要更加深入,探索其治療耐藥菌的潛力。本研究分離鑒定出醫(yī)院源銅綠假單胞菌噬菌體,研究其生物學(xué)特性、基因組信息以及與不同抗生素體外聯(lián)合應(yīng)用,以期為噬菌體應(yīng)用于實(shí)際奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

29株不同種銅綠假單胞菌菌株(28株臨床分離銅綠假單胞菌和1株標(biāo)準(zhǔn)銅綠假單胞菌CMCC 10104),來自于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院外科教研室保存菌株。噬菌體樣本分離自南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院污水。LB營養(yǎng)瓊脂、瓊脂粉、PEG8000、NaCl購自廣州生工科技有限公司,頭孢曲松購自北京悅康藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,恩諾沙星購自河南白云牧港生物科技有限公司,慶大霉素購自山西芮城科龍獸藥有限公司,脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、綠豆核酸酶均購自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司,病毒基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司,透射電鏡(型號FEI/Talos L 120C,廠家捷克/FEI)。

1.2 噬菌體的分離鑒定

1.2.1 噬菌體分離純化 采集100 mL醫(yī)院污水,使用0.22 μm濾膜過濾除菌,將濾液12 000 r·min-1離心15 min,收集上清液。將29株銅綠假單胞菌菌株分別培養(yǎng)至對數(shù)生長期備用。將30 mL LB液體培養(yǎng)基、500 μL銅綠假單胞菌菌液和1 mL樣品上清液加入到50 mL離心管內(nèi),置于37 ℃,200 r·min-1的搖床中培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)結(jié)束后將混合液過濾離心,收集上清液即為待測的噬菌體樣品。

采用雙層瓊脂平板法分離噬菌體,選擇菌株P(guān)A18作為宿主菌,之后進(jìn)行噬菌體純化:用鑷子選取平板上單噬菌體斑塊,放入裝有1 mL生理鹽水的EP管中,攪碎斑塊后置于42 ℃水浴鍋浸出,再以12 000 r·min-1離心10 min,取上清液通過雙層瓊脂平板法分離噬菌體。重復(fù)操作直至瓊脂板上的噬菌斑大小形態(tài)一致,即為純化后的單一噬菌體。

1.2.2 噬菌體增殖、濃縮 分別將純化后的噬菌體和宿主菌按照最佳MOI加入到LB液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃,200 r·min-1的搖床中富集培養(yǎng),然后離心過濾得到噬菌體富集液。參照郭楊毅君文中的PEG沉淀噬菌體顆粒的方法[12],對噬菌體進(jìn)行濃縮。濃縮后的噬菌體效價(jià)達(dá)到1011PFU·mL-1以上,就可以用作噬菌體核酸類型鑒定、透射電鏡觀察和全基因組測序。

1.3 噬菌體生物學(xué)特性研究

1.3.1 噬菌體裂解譜測定 使用點(diǎn)樣法測定噬菌體裂解譜。將29株銅綠假單胞菌分別在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h,然后將100 μL菌液均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基表面,同時(shí)取10 μL經(jīng)過純化的噬菌體滴在LB固體培養(yǎng)基上,另外滴10 μL生理鹽水做對照。待噬菌體液滴干燥之后將平板倒置,培養(yǎng)10 h后觀察液滴所在處是否透明,確定噬菌體對菌株的裂解性。

1.3.2 噬菌體透射電鏡觀察 將純化濃縮后效價(jià)為1011PFU·mL-1的噬菌體顆粒加載到銅網(wǎng)上1 min,然后用等量2%醋酸鈾進(jìn)行負(fù)染1 min并吸掉多余液體。待其干燥后使用TEM Talos L 120C觀察噬菌體形態(tài)并采集圖像。

1.3.3 最佳感染復(fù)數(shù)測定 將銅綠假單胞菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期(菌液濃度為108CFU·mL-1),按照感染復(fù)數(shù)(MOI)為100、10、1、0.1、0.01、0.001以及0.000 1的比例在離心管中分別加入500 μL噬菌體和500 μL菌液,震蕩混勻后在37 ℃溫箱中孵育,4 h后將混合物以12 000 r·min-1離心10 min,取上清液通過雙層瓊脂平板法測定噬菌體效價(jià)。

1.3.4 一步生長曲線測定 取1 mL對數(shù)生長期的銅綠假單胞菌菌液到離心管中,再以最佳MOI為0.001的比例加入1 mL噬菌體,置于37 ℃溫箱中孵育20 min,然后8 000 r·min-1離心10 min,棄掉上清后,使用37 ℃預(yù)熱的LB肉湯重懸沉淀,重復(fù)離心操作一次,將沉淀轉(zhuǎn)移到預(yù)熱的10 mL LB肉湯中,重懸沉淀后置于37 ℃,200 r·min-1的搖床中培養(yǎng)。在前30 min以10 min的時(shí)間間隔取樣,之后每隔15 min進(jìn)行取樣,每次取樣量為500 μL,試驗(yàn)時(shí)間持續(xù)2 h,同時(shí)通過雙層瓊脂平板法測定噬菌體效價(jià),試驗(yàn)重復(fù)三次,使用GraphPad Prism 軟件繪制一步生長曲線。噬菌體爆發(fā)量等于裂解結(jié)束時(shí)的噬菌體數(shù)量除以感染初期細(xì)菌的初始濃度。

1.3.5 吸附曲線測定 取2 mL對數(shù)生長期的銅綠假單胞菌菌液到離心管中,再按照最佳MOI加入2 mL噬菌體,置于搖床當(dāng)中,設(shè)置條件為37 ℃,200 r·min-1,孵育10 min,期間每隔2 min進(jìn)行取樣,每次取樣量為500 μL。同時(shí)使用雙層瓊脂平板法測定噬菌體效價(jià),試驗(yàn)重復(fù)3次,以時(shí)間為橫坐標(biāo),噬菌體吸附率為縱坐標(biāo)使用GraphPad Prism 軟件繪制噬菌體吸附曲線。

噬菌體吸附率=[(0 min噬菌體總量-未吸附噬菌體數(shù)量)/0 min噬菌體總量] ×100%。

1.3.6 噬菌體熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性測定 測定噬菌體在不同溫度下的穩(wěn)定性。分別取1 mL確定效價(jià)的噬菌體加入到1.5 mL EP管中,分別置于-20、4、25、37、40、50、60、70和80 ℃下孵育1 h,每個(gè)溫度下放置3個(gè)樣品。孵育完成后再將所有樣品置于4 ℃冰箱1 h,然后12 000 r·min-1離心10 min收集所得上清液,通過雙層瓊脂平板法測定噬菌體效價(jià)。以溫度為橫坐標(biāo),噬菌體存活率為縱坐標(biāo)使用GraphPad Prism9軟件繪圖。

測定噬菌體在不同pH條件下的穩(wěn)定性。將SM緩沖液分別調(diào)節(jié)至pH值為1到14共14個(gè)梯度,每個(gè)梯度取900 μL加入到EP管,再加入100 μL確定效價(jià)的噬菌體原液,在37 ℃水浴鍋中孵育,1 h后12 000 r·min-1離心10 min收集所得上清液,通過雙層瓊脂平板法測定噬菌體效價(jià)。重復(fù)試驗(yàn)3次,以pH為橫坐標(biāo),噬菌體存活率為縱坐標(biāo)使用GraphPad Prism9軟件繪圖。

噬菌體存活率=[2/1 h后噬菌體效價(jià)/噬菌體原液效價(jià)] ×100%。

1.4 噬菌體全基因組分析

1.4.1 噬菌體核酸類型鑒定 使用Viral DNA Kit試劑盒提取噬菌體基因組,然后使用DNase I、RNase A和MungBean(20 U·μg-1)進(jìn)行基因組酶溶鑒定,對照組使用ddH2O處理,所有組別在37 ℃水浴鍋中處理1 h,產(chǎn)物與Loading Buffer混合,通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離,使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察。

1.4.2 全基因組測序及生物學(xué)信息分析 通過酶標(biāo)儀檢測噬菌體基因組DNA濃度,要求達(dá)到5 ng·μL-1以上,總量要求40 μL,符合要求后送至華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院預(yù)防教研室進(jìn)行基因組測序。首先用Nextera XT DNA文庫制備試劑盒并進(jìn)行質(zhì)量鑒定,符合要求后使用lllumina Hiseq測序平臺全基因組測序,測序完成后用FASTQC工具分析數(shù)據(jù)質(zhì)量,通過后用SPAdes v3.11.0[14]對序列進(jìn)行拼接和組裝。獲取到完整的基因組數(shù)據(jù)后,使用GCserver軟件繪制全基因組圖。

利用在線網(wǎng)站VFDB(VFDB: Virulence Factors of Bacterial Pathogens)查找噬菌體全基因組中是否存在細(xì)菌毒力因子;通過在線工具CARD(Comprehensive Antibiotic Resistance Database)和CGE(Center for Genomic Epidemiology)檢測抗生素抗性基因;通過在線網(wǎng)站tRNAscan-SE 2.0預(yù)測是否存在tRNA基因[15]。利用MEGA11軟件對PaVOB全基因組序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,選取覆蓋率≥95%,一致性>94%的基因組進(jìn)行進(jìn)化分析。應(yīng)用在線網(wǎng)站NCBI中的ORF finder工具預(yù)測PaVOB的DNA以查找潛在的蛋白質(zhì)編碼片段,使用blastp驗(yàn)證預(yù)測得到的蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫選擇非冗余蛋白質(zhì)序列(nr),開始密碼子為′ATG′,分析預(yù)測得到的開放閱讀框(ORF)的功能。

1.5 噬菌體與抗生素體外聯(lián)合應(yīng)用

1.5.1 抗生素MIC測定 選擇3種不同殺菌機(jī)制的抗生素,包括頭孢菌素類頭孢曲松(100 mg·mL-1)、氟奎諾酮類恩諾沙星(100 mg·mL-1)和氨基糖苷類慶大霉素(40 mg·mL-1),測試宿主菌的最小抑菌濃度(MIC)。將藥物在EP管中進(jìn)行倍比稀釋,頭孢曲松和恩諾沙星最低稀釋到1.5 μg·mL-1,慶大霉素最低稀釋到0.3 μg·mL-1,將菌液濃度都調(diào)整到108CFU·mL-1備用。參照微量肉湯稀釋法(酶標(biāo)板)的步驟進(jìn)行加樣,然后將96孔板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,使用酶標(biāo)儀在OD600 nm波長下檢測。

1.5.2 測定噬菌體與抗生素聯(lián)合應(yīng)用效果 選擇上述三種抗生素,測定與噬菌體聯(lián)合應(yīng)用的作用效果。首先準(zhǔn)備效價(jià)為10～107PFU·mL-1的噬菌體稀釋液,藥物濃度選擇范圍根據(jù)MIC結(jié)果確定,共11個(gè)濃度梯度,從高到低使用LB肉湯進(jìn)行2倍稀釋,準(zhǔn)備108CFU·mL-1的PA18菌液備用。在無菌96孔圓底微量滴定板中進(jìn)行試驗(yàn),先在96孔板每個(gè)孔中加入100 μL菌液,然后以藥物高濃度到低濃度的順序分別從第1孔到第11孔橫向加入100 μL藥物稀釋液,第2～8排重復(fù)操作,最后縱向加入不同效價(jià)的噬菌體100 μL,以第一縱列為例,第1孔加入噬菌體效價(jià)為107PFU·mL-1,依次類推第1列第7排孔內(nèi)噬菌體效價(jià)為10 PFU·mL-1,剩余縱列重復(fù)操作。最后每個(gè)孔內(nèi)應(yīng)有混合液體300 μL,不夠量的用LB肉湯補(bǔ)齊,加樣結(jié)束后將96孔板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,應(yīng)用酶標(biāo)儀在600 nm波長下檢測OD值,試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值,應(yīng)用TBtools軟件繪制熱圖。

2 結(jié) 果

2.1 噬菌體的分離鑒定及生物學(xué)特性

2.1.1 噬菌體分離純化鑒定結(jié)果 從醫(yī)院污水中分離到一株銅綠假單胞菌噬菌體并命名為PaVOB,如圖1a所示,噬菌體在雙層瓊脂板上形態(tài)表現(xiàn)為圓形、空斑透亮、邊緣清晰,直徑為2～3 cm。透射電鏡(TEM)顯示PaVOB病毒顆粒具有一個(gè)平均直徑為73.02 nm的二十面體頭部和一個(gè)平均長度為155.57 nm的長尾部(圖1b),屬于有尾噬菌體目(Caudovirales),長尾噬菌體科(Siphoviridae)。

圖1 噬菌體PaVOB的噬斑(a)及顯微形態(tài)(b)Fig.1 Phage plaques (a) and microscopic morphology (b) of phage PaVOB

2.1.2 噬菌體裂解譜 通過點(diǎn)樣法對PaVOB的宿主范圍進(jìn)行測定,PaVOB能夠裂解29株銅綠假單胞菌中的5株,其中不包括標(biāo)準(zhǔn)銅綠假單胞菌CMCC 10104,裂解率為17.2%,其裂解譜較窄,屬于窄裂解譜噬菌體。

2.1.3 噬菌體一步生長曲線 根據(jù)最佳MOI建立的一步生長曲線,結(jié)果如圖2A所示:PaVOB滴度在10 min后快速上升,在120 min趨于平穩(wěn)。因此,PaVOB的潛伏期為10 min,裂解期為120 min,爆發(fā)量為50 PFU·cell-1。

2.1.4 噬菌體吸附曲線 如圖2B所示,測定PaVOB對宿主菌PA18的吸附能力。結(jié)果表明,PaVOB在2 min內(nèi)吸附速度最快,吸附率達(dá)到69.4%,在6和8 min內(nèi)吸附率分別為91.4%、95.2%,10 min時(shí)吸附率最高,為99.1%,噬菌體吸附基本達(dá)到飽和。

2.1.5 噬菌體熱穩(wěn)定性 溫度對PaVOB的影響結(jié)果如圖2C所示,PaVOB耐受低溫環(huán)境,在-20～40 ℃期間存活率都大于80%,之后隨溫度升高而下降,但是在60 ℃時(shí)還具有61%的存活率,在70 ℃條件下完全滅活。這一結(jié)果表明PaVOB耐低溫能力較強(qiáng)。

2.1.6 噬菌體pH穩(wěn)定性 pH對PaVOB的影響結(jié)果如圖2D所示,PaVOB在pH為4～11之間存活率超過60%,pH為6時(shí)存活率接近100%,在pH為3和12時(shí),分別具有25.2%、32.5%的存活率,在pH>12和pH<3時(shí),PaVOB完全失活。這一結(jié)果表明PaVOB在pH為4～11的環(huán)境中穩(wěn)定性較好,最適pH為6。

2.1.7 最佳感染復(fù)數(shù) 如表 1所示,當(dāng)MOI為0.001時(shí),PaVOB效價(jià)最高,為1.84×109PFU·mL-1。因此,PaVOB的最佳MOI為0.001。

表1 PaVOB最佳感染復(fù)數(shù)

2.2 噬菌體生物信息學(xué)分析

2.2.1 噬菌體核酸類型鑒定結(jié)果 對PaVOB使用不同核酸酶處理,結(jié)果如圖3所示,PaVOB基因組DNA對DNase I敏感,處理之后沒有條帶,而經(jīng)RNaseA和Mung Bean Nuclease處理之后,條帶大小與陰性對照組基本一致,表明PaVOB基因組為雙鏈DNA。

M. DL15000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. PaVOB核酸陰性對照;2. PaVOB核酸DNase I處理;3. PaVOB核酸RNaseA處理;4. PaVOB核酸Mung Bean Nuclease處理 M. DL15000 DNA marker; 1. PaVOB nucleic acid negative control; 2. PaVOB nucleic acid DNase I treatment; 3. PaVOB nucleic acid RNaseA treatment; 4. PaVOB nucleic acid Mung Bean Nuclease treatment

2.2.2 基因組一般特性分析結(jié)果 PaVOB(NCBI登錄號OQ743452)的全基因組測序結(jié)果如圖4所示,PaVOB基因組全長為72 179 bp,C+G含量為54.81%,另外在線軟件預(yù)測結(jié)果顯示,未在PaVOB中發(fā)現(xiàn)毒力基因、耐藥基因和tRNA編碼基因的存在。

2.2.3 噬菌體進(jìn)化分析結(jié)果 基于噬菌體全基因組的進(jìn)化分析結(jié)果如圖5所示,PaVOB與一個(gè)未分類的噬菌體vB PaeP FBPa1親緣關(guān)系小于0.1,且vB PaeP FBPa1屬于有尾噬菌體目,結(jié)合TEM形態(tài)可以確定PaVOB屬于長尾噬菌體科的新成員。

圖5 PaVOB進(jìn)化分析Fig.5 Evolution analysis of PaVOB

2.2.4 預(yù)測的噬菌體基因組ORF及其功能注釋結(jié)果 PaVOB預(yù)測共得到74個(gè)ORF,其中37個(gè)分布在正鏈上,37個(gè)分布在負(fù)鏈上,23個(gè)未在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中找到相似蛋白,13個(gè)ORF與數(shù)據(jù)庫中的功能蛋白有較高的相似性(見表2),包括病毒相關(guān)RNA聚合酶(ORF41)、推定門戶蛋白(ORF47)、終止酶大亞基(ORF66)、推定裂解尾纖維蛋白(ORF40)、假定的DNA聚合酶I(ORF20)、推定結(jié)構(gòu)蛋白(ORF51)、推定的單鏈DNA結(jié)合蛋白(ORF4)、N4 gp67樣蛋白(ORF45)、N4 gp55樣蛋白(ORF50)、主要衣殼蛋白(ORF62)、假定的dUTPase(ORF61)、N4 gp48樣蛋白(ORF27)和dUTP核苷酸水解酶(ORF34),剩余ORF均為假想蛋白。

表2 PaVOB功能蛋白注釋信息

2.3 噬菌體與抗生素體外聯(lián)合應(yīng)用

如圖6a所示,結(jié)果呈現(xiàn)了噬菌體與頭孢曲松聯(lián)合應(yīng)用的效果,數(shù)值代表細(xì)菌清除率,數(shù)值越大,顏色越深,清除效果越好。PaVOB與頭孢曲松聯(lián)合應(yīng)用有增強(qiáng)作用,在頭孢曲松濃度≥24.40 μg·mL-1時(shí),細(xì)菌清除率達(dá)到55%以上,PaVOB濃度在106～107PFU·mL-1時(shí),與頭孢曲松聯(lián)合殺菌效果最好,細(xì)菌清除率達(dá)到90%～100%。

a. 頭孢曲松與PaVOB聯(lián)合應(yīng)用;b.恩諾沙星與和PaVOB聯(lián)合應(yīng)用;c.慶大霉素與和PaVOB聯(lián)合應(yīng)用a. Combination application of ceftriaxone and PaVOB; b. Combination application of enrofloxacin and PaVOB; c. Combination application of gentamicin and PaVOB

如圖6b所示,PaVOB只有在效價(jià)為107PFU·mL-1時(shí),對恩諾沙星的殺菌效果起到增強(qiáng)作用,低效價(jià)產(chǎn)生抑制作用,細(xì)菌清除率下降20%～90%。慶大霉素與PaVOB聯(lián)合使用見圖6c,PaVOB對慶大霉素未表現(xiàn)出明顯的增強(qiáng)或者抑制作用,慶大霉素的MIC無明顯變化。

3 討 論

本研究從廣州南方醫(yī)院污水中分離鑒定出長尾噬菌體PaVOB,能夠100%裂解臨床分離銅綠假單胞菌菌株,獲得直徑為2～3 mm的噬菌斑。但PaVOB表現(xiàn)出一個(gè)較窄的宿主譜,相比于噬菌體BrSP1對37株銅綠假單胞菌菌株有51.4%的裂解率[16],PaVOB僅僅裂解了17.2%的測試菌株,甚至有些噬菌體PPaMa1/18對銅綠假單胞菌臨床分離株的裂解率達(dá)到85.7%[17]。

3.1 銅綠假單胞菌噬菌體生物學(xué)特性分析

研究噬菌體的生物學(xué)特性有助于更好的在臨床中應(yīng)用噬菌體。本研究中的PaVOB的最佳MOI為0.001,表明噬菌體可以在小的數(shù)量級感染多達(dá)10倍甚至1 000倍的細(xì)菌,在實(shí)際抗菌方面能發(fā)揮出強(qiáng)大作用。PaVOB的潛伏期為10 min,裂解期為120 min,與Kumar等[18]分離的噬菌體2019SD1以及Ma和Lu[19]分離的噬菌體SMP相比,PaVOB的潛伏期更短,表明噬菌體可以更快地感染細(xì)菌,體現(xiàn)出PaVOB的高效性。PaVOB在10 min內(nèi)的吸附率更高,為99.1%,更快地吸附速度有利于及時(shí)消滅病原菌,同時(shí)也體現(xiàn)了噬菌體對宿主菌獨(dú)特的吸附機(jī)制,這可能與特異性受體有關(guān)。

噬菌體對環(huán)境的適應(yīng)性對于臨床應(yīng)用至關(guān)重要。本研究顯示,在-20～60 ℃溫度范圍內(nèi),PaVOB活性相對穩(wěn)定,PaVOB在60 ℃時(shí)還具有61%的存活率,噬菌體耐低溫能力較強(qiáng),有利于在實(shí)際環(huán)境中生存。PaVOB在pH3～pH12的范圍內(nèi)都具有活性,表明其能夠在多數(shù)酸堿環(huán)境中存活。

3.2 銅綠假單胞菌噬菌體全基因組測序分析

研究噬菌體全基因組,能夠進(jìn)一步鑒定和了解物種信息,本研究經(jīng)過高通量測序,鑒定出新的噬菌體PaVOB,通過NCBI進(jìn)行全基因組序列比對,與其親緣關(guān)系最近的是銅綠假單胞菌噬菌體(相似性大于95%),符合研究目標(biāo),說明測序結(jié)果準(zhǔn)確。

PaVOB的基因組全長為72 179 bp,基因組與銅綠假單胞菌噬菌體PA26大小相似,為72 321 bp[20],C+G含量為54.81%,與其他噬菌體都不相同,這是由于GC含量代表物種的特征。此外,未在PaVOB中發(fā)現(xiàn)毒力基因和耐藥基因的存在,表明PaVOB用于臨床治療中的可能性,安全性能得到一定程度的保證。tRNA基因是一種噬菌體可以選擇性整合到其基因組中的轉(zhuǎn)運(yùn)基因,可能有助于提高噬菌體的毒力,以達(dá)到更好的適應(yīng)性,本文中PaVOB沒有tRNA編碼基因,表明噬菌體作為一種寄生病毒自身不能合成蛋白質(zhì)的特點(diǎn)。從進(jìn)化關(guān)系分析,PaVOB與一個(gè)未分類的噬菌體vB PaeP FBPa1親緣關(guān)系小于0.1,也可以推測出vB PaeP FBPa1可能是長尾噬菌體,進(jìn)化結(jié)果也說明了PaVOB為長尾噬菌體科新發(fā)現(xiàn)的成員,再一次展示出噬菌體在自然界中的多樣性和豐富性,是寶貴的研究材料。

PaVOB 的ORF功能主要分為DNA復(fù)制與調(diào)控、裂解蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白。RNA聚合酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白、DNA聚合酶I、dUTPase和dUTP核苷酸水解酶都參與DNA復(fù)制以及轉(zhuǎn)錄過程,對子代的復(fù)制有著不可忽視的作用;噬菌體終止酶能夠包裝基因組,終止酶大亞基和小亞基構(gòu)建成終止酶,然而不同的噬菌體大亞基功能不同,例如噬菌體P22的終止酶大亞基(gp2)采用頭部機(jī)制將DNA包裝成預(yù)先形成的前衣殼結(jié)構(gòu)[21];門戶蛋白的功能類似于DNA傳感器,將基因組包裝與二十面體衣殼成熟偶聯(lián)[22];裂解尾纖維蛋白與感染和裂解宿主菌有關(guān),可能也是導(dǎo)致宿主特異性的一種原因,與主要衣殼蛋白都可以作為受體,通過噬菌體展示技術(shù)對其進(jìn)行基因改造是擴(kuò)大宿主譜的一種方法;噬菌體發(fā)揮獨(dú)特功能主要依靠結(jié)構(gòu)蛋白,在噬菌體的組成、運(yùn)動(dòng)以及感染各個(gè)過程中都有結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)揮基礎(chǔ)功能,研究噬菌體的基因特性,可以通過蛋白質(zhì)組技術(shù)對結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行鑒定和分析,獲取詳細(xì)信息。

此外,PaVOB含有多的N4樣蛋白,包括N4 gp48樣蛋白、N4 gp67樣蛋白、N4 gp48樣蛋白和N4 gp55樣蛋白。N4是一種裂解性短尾噬菌體,對其基因組研究非常深入和透徹,被認(rèn)為是N4噬菌體屬[23],目前很多新發(fā)現(xiàn)的噬菌體也被歸類到N4屬,例如LUZ7[24]和PEV2[25],這些蛋白在N4中都有特定的功能,而在PaVOB中出現(xiàn),可能預(yù)示著它們之間親密的關(guān)系,也說明該屬的分布廣泛,是最早被分離研究的噬菌體之一,之后可以參照N4對其基因組進(jìn)行詳細(xì)分析。

3.3 噬菌體與抗生素聯(lián)合應(yīng)用分析

本研究選用三種不同抑菌機(jī)制的抗生素與PaVOB體外聯(lián)合應(yīng)用,旨在探索兩者的聯(lián)合效果,發(fā)揮出更強(qiáng)大的抗菌作用,而且噬菌體與抗生素聯(lián)合應(yīng)用還能大大降低細(xì)菌耐受的概率,也是一種對抗超級細(xì)菌的手段。頭孢曲松是頭孢菌素類抗菌藥,主要通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成而發(fā)揮抗菌作用。在此研究中,PaVOB與頭孢曲松聯(lián)合應(yīng)用有增強(qiáng)作用,且與噬菌體濃度有關(guān),噬菌體濃度在106～107PFU·mL-1時(shí),與頭孢曲松聯(lián)合殺菌效果最好。根據(jù)之前的研究,亞抑菌濃度的頭孢曲松與噬菌體協(xié)同作用會導(dǎo)致銅綠假單胞菌細(xì)胞顯著伸長和絲狀化,并提供一種排除干擾噬菌體增殖的作用方式[26],盡管具體機(jī)制還未明確,但是這種結(jié)果令人信服,Xu等[27]也證實(shí)噬菌體vB_1086與頭孢曲松具有協(xié)同作用。

恩諾沙星是喹諾酮類抗生素,又稱乙基環(huán)丙沙星,其抗菌機(jī)制主要是阻斷細(xì)菌DNA的復(fù)制。本研究中,PaVOB只有在效價(jià)為107PFU·mL-1時(shí),對恩諾沙星的殺菌效果起到了增強(qiáng)作用,低效價(jià)甚至產(chǎn)生抑制作用。由于恩諾沙星與噬菌體聯(lián)合應(yīng)用的報(bào)道并不多見,因此參考同一類的環(huán)丙沙星,根據(jù)Knezevic等[26]的研究,環(huán)丙沙星與噬菌體協(xié)同作用也會導(dǎo)致銅綠假單胞菌細(xì)胞顯著伸長和絲狀化,還有種可能是噬菌體清除掉細(xì)菌生物膜之后,使恩諾沙星的穿透性更強(qiáng),直接作用在細(xì)菌體內(nèi),從而起到協(xié)同作用,這與Akturk等[28]的研究結(jié)果相似,同時(shí)需要考慮聯(lián)合治療中抗生素濃度和抗生素作用時(shí)間對協(xié)同應(yīng)用的影響,例如一項(xiàng)研究顯示,在加入噬菌體6 h后添加最低抑菌濃度的抗生素,聯(lián)合處理可防止細(xì)菌再生[29]。

慶大霉素屬于氨基糖苷類抗生素,抗菌機(jī)制為抑制蛋白質(zhì)合成與30 S核糖體亞基結(jié)合并破壞細(xì)胞包膜。本研究中慶大霉素與PaVOB聯(lián)合使用,未表現(xiàn)出任何作用。這可能與噬菌體類型有關(guān),先前報(bào)道指出,絲狀噬菌體可以增加銅綠假單胞菌對慶大霉素的敏感性[30],不僅如此,氨基糖苷類抗生素還會通過阻斷感染周期的早期步驟來抑制噬菌體感染[31],因此,在測試噬菌體與抗生素的聯(lián)合效果時(shí),需要考慮到噬菌體的類型和抗生素的種類,減少不必要的工作。

4 結(jié) 論

分離鑒定出一株具有雙鏈DNA基因組的長尾噬菌體PaVOB,進(jìn)化關(guān)系顯示其為新發(fā)現(xiàn)的噬菌體,未攜帶毒力基因等有害基因。生物學(xué)特性表明其對環(huán)境適應(yīng)性良好。體外聯(lián)合用藥結(jié)果表明,PaVOB與頭孢曲松聯(lián)合應(yīng)用有協(xié)同作用,PaVOB在效價(jià)為107PFU·mL-1時(shí),與恩諾沙星產(chǎn)生協(xié)同作用。該噬菌體具有用于臨床治療中的可能性,為進(jìn)一步研究銅綠假單胞菌噬菌體制劑奠定了基礎(chǔ)。