邱文粵,蘇依曼,葉嘉莉,章心婷,龐曉玥,王榮梅,謝子茂,張 輝,唐兆新,蘇榮勝*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣州 510642;2.韶關(guān)學(xué)院英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院,韶關(guān) 512005;3.黃埔區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所,廣州 510799)

急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)是由細菌、病毒和其他有毒物質(zhì)引起的一種腎疾病[1]。細菌感染引起的急性腎損傷是家禽養(yǎng)殖業(yè)常見的疾病之一,以腎腫大和腎功能障礙為主要特征,嚴重威脅著家禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[2]。禽病原性大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)是引起細菌性感染性疾病的重要病原菌,各日齡段的雞都可能被大腸桿菌感染,其中以1個月內(nèi)的雛雞更易感[3]?？股厥悄壳爸委熂毦约膊〉闹饕幬?然而,抗生素的濫用易使細菌產(chǎn)生耐藥性,加之我國養(yǎng)殖行業(yè)減抗、限抗、替抗政策的實施,尋找新的天然產(chǎn)物來替代抗生素的工作顯得更加迫切。

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是大腸桿菌細胞壁的重要組成成分,當細菌死亡時釋放大量LPS并可引起腎急性損傷[4]。研究表明,LPS可以激活小鼠心肌細胞凋亡和抑制自噬,從而引起心功能障礙[5]。細胞凋亡是機體組織進行自我更新的一種程序性死亡方式,但過度的細胞凋亡是疾病發(fā)生的基礎(chǔ),LPS引起AKI和細胞凋亡有密切關(guān)系[6-7]。自噬是細胞維持穩(wěn)態(tài)的一種方式,細胞通過自噬溶酶體途徑降解受損細胞器[8-9]。自噬和凋亡往往相伴出現(xiàn),相互影響并參與調(diào)控疾病的發(fā)生發(fā)展[10]。

積雪草酸(Asiatic acid,AA)具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等生物活性功能[11-13],在許多疾病的預(yù)防和治療中受到廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn),AA能夠通過減少視網(wǎng)膜細胞凋亡預(yù)防青光眼[14];AA還可通過減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和觸發(fā)自噬改善急性肝損傷[15]。然而,AA對LPS引起肉雞AKI中細胞凋亡和自噬的影響尚未見報道。因此,本研究擬通過肉雞腹腔注射LPS構(gòu)建AKI模型,旨在探討AA對LPS誘導(dǎo)肉雞AKI的預(yù)防效果并從細胞凋亡和自噬角度來闡明其具體作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

從新興大華農(nóng)公司購買40只1日齡健康雄性黃羽肉仔雞(SCXK 2018-0019),經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)至7日齡時,隨機分為4組,即空白對照組(Con)、LPS誘導(dǎo)的腎損傷模型組(LPS)、AA低劑量組(LPS+AA 15 mg·kg-1)和AA高劑量組(LPS+AA 30 mg·kg-1)?；谇捌诘难芯砍晒鸞16],本研究選擇了15和30 mg·kg-1劑量的AA進行動物試驗。AA懸浮于羧甲基纖維素鈉懸浮液中,AA處理組的肉雞從7日齡開始,每日用相應(yīng)劑量的AA灌胃14 d,LPS組和AA處理組的肉雞在第16、18和20日齡時腹腔注射0.5 mg·kg-1LPS構(gòu)建急性腎損傷模型,Con組注射相應(yīng)劑量的生理鹽水,在第20日齡腹腔注射LPS 12 h后處死肉雞并采集腎組織樣品,Con組和LPS組肉雞灌胃相等劑量的羧甲基纖維素鈉懸浮液。本次動物試驗經(jīng)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物使用倫理委員會批準(2021b112)。

1.2 試驗試劑與儀器

脂多糖(E.coli055:B5 L2880)、多聚甲醛固定液購自美國Sigma公司;積雪草酸(98%)購自上海阿拉丁有限公司;羧甲基纖維素鈉購自北京索萊寶;組織包埋塊、電泳液粉末和轉(zhuǎn)膜液粉末購自武漢塞維爾有限公司;RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(R312-01)、qPCR熒光染料Master Mix (Q711-02)購自南京諾唯贊有限公司;TRIzol裂解液購自日本TaKaRa;MDA、GSH-Px、SOD、CAT檢測試劑盒,RIPA裂解液和PMSF抑制劑購自上海碧云天;辣根過氧化物酶標記二抗購自康為世紀生物公司;Beclin1、ATG5、LC3、P62抗體購自武漢三鷹生物有限公司;BAX、Bak1、BCl2抗體由上海Abmart提供;P53、Cleaved-Caspase3/Caspase3抗體購自沈陽萬類生物公司;GAPDH抗體購自南京巴傲得生物公司。

酶標儀(Elx808)購自美國Bioteck公司;微量紫外分光光度計(Nanodrop-2000)購自美國Thermo Fisher;基因擴增儀(MyCycler Thermal)購自美國Bio-Rad公司;熒光定量PCR儀(LightCycler480)購自美國Roche公司;光學(xué)顯微鏡(DM1000)、正置熒光顯微鏡(DMi8)、組織切片機(RM2235)購自德國Leica;低溫高速離心機(D3024R)購自美國SCILOGEX公司;SDS-PAGE 蛋白電泳儀(BG-power 600)購自上海天能公司。

1.3 組織病理學(xué)染色

腎組織包埋由武漢塞維爾提供服務(wù),使用切片機將組織包埋塊切成4 μm的薄片并黏附在病理級載玻片上,37 ℃烘烤過夜。隨后55 ℃融蠟1 h,經(jīng)透明、梯度酒精脫水后進行蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin, HE)染色,隨后在光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織的病理變化。

1.4 腎組織中氧化-抗氧化指標的測定

腎組織在勻漿液中勻漿,12 500×g條件下離心10 min后取上清液,經(jīng)BCA試劑盒測定蛋白濃度;檢測步驟根據(jù)碧云天氧化應(yīng)激試劑盒說明書嚴格進行操作,采集數(shù)據(jù)后進行統(tǒng)計分析。

1.5 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

稱取20 mg腎組織放入含有500 μL TRIzol裂解液的EP管中,手動勻漿后12 500×g離心10 min,并按照TRIzol試劑盒的步驟提取腎組織總RNA;將提取后的RNA在微量紫外分光光度計測定濃度和純度,并稀釋至500 ng·μL-1;按照RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,稀釋10倍后用于后續(xù)試驗。從NCBI獲取引物序列,引物序列由廣州擎科生物公司合成;引物序列見表1,以GAPDH作為管家基因。按照cDNA 2 μL,上、下游引物各0.8 μL,DEPC水6.4 μL和熒光染料Master Mix 10 μL的體系混合后經(jīng)過實時熒光定量PCR儀檢測其基因表達水平;qRT-PCR的反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 30 s;95 ℃反應(yīng)10 s,60 ℃反應(yīng)30 s,反應(yīng)循環(huán)40次,得到熔解曲線并計算其Ct值,隨后分析腎中細胞凋亡和自噬相關(guān)基因的表達水平。

表1 qRT-PCR檢測中使用的引物序列

1.6 蛋白免疫印跡

稱取20 mg腎組織至2 mL EP管中,并加入250 μL RIPA蛋白裂解液,手動勻漿后靜置10 min以充分裂解組織蛋白,隨后12 500×g條件下離心10 min;取上清并用BCA試劑盒將蛋白定量至1.25 μg·μL-1,稀釋后的樣品、Lodding buffer體積比按照4∶1進行混合后在100 ℃下沸騰10 min,結(jié)束后分裝儲存。將制備好的總蛋白樣品通過12.5%的SDS-PAGE凝膠分離后,經(jīng)過轉(zhuǎn)膜步驟轉(zhuǎn)移至PVDF膜上;5%脫脂奶粉封閉1 h,經(jīng)PBS清洗3次后與Bak1、BAX、BCl2、Cleaved-Caspase3/Caspase3、P62、Beclin1、ATG5和LC3抗體在4 ℃條件下孵育16 h;PBS清洗3遍后使用HRP標記的羊抗兔或羊抗鼠二抗孵育1 h,在全自動化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測蛋白條帶的表達。

1.7 免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測Cytc蛋白的表達與分布

腎組織包埋塊經(jīng)切片機制成4 μm的薄片,黏附在防脫病理級切片,37 ℃烤片過夜后備用。55 ℃烤片1 h,經(jīng)二甲苯透明和梯度酒精脫水等步驟后,在加熱至即將沸騰的10 mmol·L-1的檸檬酸鈉溶液(pH=6.0)反應(yīng)10 min進行抗原修復(fù)操作。隨后使用85%的甲醇配制3%的H2O2溶液阻斷腎組織中的內(nèi)源性過氧化物酶;經(jīng)過3次PBS清洗后,使用10%的馬血清在37 ℃條件下封閉1 h,封閉結(jié)束后使用Cytc抗體在4 ℃條件下孵育組織切片18 h;使用辣根過氧化物酶標記二抗在室溫條件下孵育1 h,并在DAB顯示液作用下顯色。在光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織中Cytc蛋白的表達與分布并采集相片,ImageJ分析上述結(jié)果的光密度值。

1.8 免疫熒光技術(shù)檢測LC3-II蛋白的表達與分布

腎組織切片的制備同“1.7”,腎組織切片在55 ℃條件下烤片1 h,經(jīng)二甲苯透明和梯度酒精脫水后,使用1%的Triton溶液進行細胞膜穿孔15 min,隨后使用馬血清在37 ℃條件下封閉腎組織1 h以去除非特異性蛋白的影響,經(jīng)PBS清洗3遍后使用LC3-II抗體在4 ℃條件下孵育腎組織18 h;PBS清洗3次后使用Cy3標記二抗在室溫下孵育腎組織切片1 h后DAPI染細胞核進行定位?？篃晒獯銣鐒┑渭釉诮M織上后即可封片,并在正置熒光顯微鏡下觀察并采集照片以用于后續(xù)分析。

1.9 TUNEL染色檢測細胞凋亡率

腎組織切片在55 ℃條件下烤片1 h,新鮮二甲苯透明和梯度酒精脫水后使用蛋白酶K孵育30 min,經(jīng)PBS清洗3遍后,使用PBS配制3%的H2O2溶液,組織切片在室溫條件下浸泡20 min以滅活組織內(nèi)源性過氧化物酶,隨后按照說明書步驟配制Streptavidin-HRP工作液,每個組織滴加50 μL工作液并孵育30 min,再次用PBS清洗3遍后使用DAB顯色液顯色,顯色結(jié)束后用蘇木精染細胞核以進行定位,梯度酒精脫水和新鮮二甲苯透明后使用中性樹脂封片,光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖像,ImageJ進行分析。

1.10 數(shù)據(jù)處理

最終數(shù)據(jù)以“平均值±標準差(mean±SD)”表示,本研究所有試驗數(shù)據(jù)均來源于至少3個獨立試驗,數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016簡單后處理使用GraphPad Prism 9進行作圖,組間采用單因素方差分析(one-way ANOVA)并進行Turkey檢驗;*表示與對照組相比較以及兩組之間的比較,#表示與LPS組相比較;P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AA減輕LPS誘導(dǎo)的肉雞AKI

如圖1所示,Con組腎細胞結(jié)構(gòu)完整,無任何病理變化。LPS組腎小球擴張、剝落,還可見細胞腫脹,腎小球空泡變性和萎縮。AA預(yù)處理低劑量組和高劑量組都減輕了LPS引起的肉雞腎的病變,且AA在30 mg·kg-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴性。相比起對照組肉雞腎臟系數(shù),LPS引起肉雞腎臟系數(shù)極顯著增加(P<0.001),這是腎腫脹的表現(xiàn);而AA低劑量和高劑量預(yù)處理肉雞都能夠顯著地降低LPS誘導(dǎo)的肉雞AKI中的腎臟系數(shù)(P<0.05)。

A. 腎組織病理學(xué)檢查(400×);藍色箭頭:腎小管擴張和腎小管上皮細胞脫落;黑色箭頭:腎小球空泡變性;紅色箭頭:腎小球萎縮;B. 腎臟系數(shù):*表示與對照組相比較以及兩組之間的比較,****P<0.001,#表示與LPS組相比較,##P<0.01,下同;C. 積雪草酸分子結(jié)構(gòu)圖A. Histopathology of kidney (400×); Blue arrow: Dilation of renal tubules and detachment of renal tubular epithelial cells; Black arrow: Glomerular vacuolar degeneration; Red arrow: Glomerular atrophy; B. Kidney coefficient: * is expressed comparison with the control group and between the two groups,****P<0.001, # is expressed comparison with the LPS group, ##P<0.01, the same as below; C. Molecular structure of Asiatic acid

2.2 AA對LPS誘導(dǎo)肉雞AKI中氧化-抗氧化指標的影響

與Con組相比,LPS顯著增加了肉雞腎中的MDA水平(P<0.05),AA低劑量和高劑量都顯著降低了LPS誘導(dǎo)肉雞AKI的MDA水平且呈劑量依賴性(P<0.05)。與Con組相比,LPS均顯著降低了肉雞腎中的GSH-Px、CAT和SOD酶活性(P<0.05),而AA低劑量和高劑量預(yù)處理組肉雞腎中CAT和SOD酶活性均顯著升高(P<0.05),AA低劑量雖增加了GSH-Px的活性,但差異不顯著(P>0.05),AA高劑量則顯著增加了肉雞腎中GSH-Px的活性(P<0.05),AA預(yù)處理效果呈劑量依賴性(表2)。

表2 AA對LPS誘導(dǎo)肉雞AKI氧化-抗氧化指標的影響

2.3 AA對LPS誘導(dǎo)肉雞AKI中細胞凋亡相關(guān)基因和蛋白表達的影響

如圖2所示,與對照組相比,LPS顯著增加了P53、BAX、Caspse3的mRNA水平(P<0.05),增加了Bak1和Cytc的mRNA水平(P>0.05),抑制了BCl2的mRNA水平(P>0.05)。AA預(yù)處理顯著降低了LPS肉雞腎中P53、BAX、Caspse3的mRNA水平,且呈劑量依賴性(P<0.05);AA降低了Bak1和Cytc的mRNA水平,但差異不顯著(P>0.05)。AA劑量依賴性地增加了LPS肉雞腎中BCl2的mRNA水平(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示,LPS處理顯著增加了P53、Bak1、BAX和Cleaved-Caspase3的蛋白表達(P<0.05),而抑制了BCl2蛋白的表達(P<0.05)。AA預(yù)處理呈劑量依賴性地降低了LPS肉雞腎中P53、Bak1、BAX和Cleaved-Caspase3的蛋白表達(P<0.05),而升高了BCl2蛋白表達,但差異不顯著(P>0.05)。

A～F. 細胞凋亡相關(guān)mRNA表達水平;G. Western bolt檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白表達;H～L. 細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達;*表示與對照組相比較以及兩組之間的比較(*P<0.05,**P<0.01和***P<0.001),#表示與LPS組相比較(#P<0.05, ##P<0.01和###、####P<0.001);P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。下同A-F. Apoptosis-related mRNA expression levels; G. Western blot detects relative protein expressions of apoptosis; H-L. Relative protein expressions of apoptosis;* is expressed comparison with the control group and between the two groups (*P<0.05,**P<0.01 and ***P<0.001); # is expressed comparison with the LPS group (#P<0.05, ##P<0.01 and ###, ####P<0.001); P<0.05 indicates a statistically significant difference. The same as below.

2.4 AA對LPS誘導(dǎo)肉雞AKI中Cytc蛋白表達與分布和腎細胞凋亡率的影響

如圖3A、3B所示,與Con組相比,LPS極顯著地增加了肉雞腎組織中Cytc蛋白的表達與分布(P<0.001),而AA預(yù)處理在30 mg·kg-1劑量內(nèi)呈劑量依賴性的降低了LPS肉雞腎組織中Cytc蛋白的表達與分布,且差異極顯著(P<0.001)。為進一步證明AA對LPS誘導(dǎo)肉雞腎細胞凋亡的保護作用,使用TUNEL染色檢測腎細胞凋亡率。TUNEL染色結(jié)果如圖3C、3D所示,與Con組肉雞腎凋亡率相比,LPS極顯著增加了腎細胞凋亡率(P<0.001),AA低劑量和AA高劑量預(yù)處理組都極顯著地降低了LPS肉雞腎細胞凋亡率(P<0.001),且呈劑量依賴性。

A、B. 免疫組化檢測Cytc蛋白的表達與分布;黑色箭頭:Cytc蛋白表達;C. TUNEL染色;黑色箭頭:凋亡細胞D. 細胞凋亡率A, B. Immunohistochemistry detects the protein expression and distribution of Cytc; Black arrow: the protein expression of Cytc; C. TUNEL staining; Black arrow: apoptotic cell; D. Apoptosis rate

2.5 AA對LPS誘導(dǎo)肉雞AKI中細胞自噬相關(guān)基因和蛋白表達的影響

如圖4所示,與Con組相比,LPS處理升高了肉雞腎組織中P62的mRNA水平(P>0.05),同時降低了ATG5(P>0.05)、Beclin1(P<0.05)、LC3-I(P>0.05)和LC3-II(P<0.05)的mRNA水平。AA預(yù)處理組肉雞和LPS模型組肉雞腎中P62的mRNA水平差異不顯著,但呈下降趨勢(P>0.05)。AA預(yù)處理還呈劑量依賴性地升高了ATG5、Beclin1、LC3-I和LC3-II的mRNA水平(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示,LPS處理升高了肉雞腎中P62的蛋白表達(P>0.05),而AA預(yù)處理降低了LPS誘導(dǎo)肉雞AKI中P62的蛋白表達,差異不顯著(P>0.05)。LPS顯著降低了肉雞腎中ATG5、Beclin1和LC3-II/LC3-I的蛋白表達(P<0.05),而AA預(yù)處理顯著地升高了LPS誘導(dǎo)肉雞AKI中ATG5、Beclin1和LC3-II/LC3-I的蛋白表達(P<0.05),且呈劑量依賴性。

A～E. 細胞自噬相關(guān)mRNA表達水平;F. Western blot檢測細胞自噬相關(guān)蛋白;G～J. 細胞自噬相關(guān)蛋白表達A-E. Autophagy-related mRNA expression levels; F. Western blot detects relative protein expressions of autophagy; G-J. Relative protein expressions of autophagy

2.6 AA對LPS誘導(dǎo)肉雞AKI中LC3-Ⅱ蛋白表達與分布的影響

如圖5A、5B所示,與Con相比,LPS極顯著降低了肉雞腎組織中LC3-II的表達與分布(P<0.001)。而AA高劑量和低劑量都極顯著地增加了LPS組肉雞腎組織中LC3-II蛋白的表達與分布(P<0.001)。

A、B. 免疫熒光檢測LC3-II蛋白的表達與分布A, B. Immunofluorescence detects the protein expression and distribution of LC3-II

3 討 論

細菌感染引起的肉雞AKI是家禽集約化養(yǎng)殖中較常見的疾病之一,它能導(dǎo)致肉雞生長緩慢甚至死亡,給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的損失?？股厥羌毦腥拘约膊〉闹饕委熕幬?但長期使用抗生素會使細菌產(chǎn)生耐藥性,還可引起家禽發(fā)生內(nèi)毒素血癥并導(dǎo)致家禽死亡。目前我國已實施減抗、限抗、替抗政策,加之中國中草藥資源豐富,天然產(chǎn)物在家禽養(yǎng)殖中的作用受到越來越多的關(guān)注[17-18]。AA是從積雪草中提取的五環(huán)三萜皂苷,已被證明具有抗炎、抗凋亡和抗腫瘤等生物活性[19]。本團隊之前的研究表明,60 mg·kg-1劑量的AA處理肉雞未見明顯毒性,且30 mg·kg-1劑量的AA能更有效地減輕LPS誘導(dǎo)的肝損傷和腎損傷[9,16]。因此,本試驗選擇了15和30 mg·kg-1劑量的AA進行研究。結(jié)果表明,AA通過抑制氧化應(yīng)激和細胞凋亡以及促進細胞自噬減輕LPS誘導(dǎo)的肉雞AKI, 這一結(jié)論進一步證明了AA在LPS誘導(dǎo)肉雞AKI中的保護作用。

LPS是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分,伴隨著細菌的死亡釋放至血液中并作用于腎等器官。LPS常用于誘導(dǎo)炎性因子釋放和建立AKI模型。LPS誘導(dǎo)AKI的機理是其與Toll樣受體4(TLR4)結(jié)合并激活炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激[20]。盡管LPS誘導(dǎo)AKI的致病機理已初步闡明,但其具體發(fā)病機制和治療策略仍有待進一步研究。研究表明,LPS可引起腎嚴重的病理損傷,包括腎小管擴張、腎小管上皮細胞脫落和腎小球萎縮等病理變化[21]。本研究通過給肉仔雞腹腔注射0.5 mg·kg-1劑量的LPS成功建立AKI模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS會引起肉雞腎小管擴增、腎小管上皮細胞脫落,腎小球萎縮和腎小球空泡樣病變,前期試驗結(jié)果也支持了這一點[16]。AA預(yù)處理減輕了LPS誘導(dǎo)肉雞腎的病理損傷,這和前人的研究結(jié)果是一致的[22]。此外,LPS處理顯著增加了肉雞的腎臟系數(shù),表明LPS會引起肉雞腎腫脹,這和之前的研究發(fā)現(xiàn)是一致的[23];而AA預(yù)處理14 d后可以顯著降低LPS誘導(dǎo)肉雞AKI的腎臟系數(shù),這表明AA可以緩解LPS引起的肉雞腎腫脹。LPS不僅可以刺激炎癥因子的釋放同時會誘導(dǎo)過量ROS的產(chǎn)生并激活氧化應(yīng)激,引起細胞抗氧化酶活性下降和脂質(zhì)過氧化物MDA水平增加[24-25];研究結(jié)果顯示,LPS處理顯著增加肉雞腎組織中MDA水平以及顯著降低GSH-Px、SOD和CAT酶的活性,這和前人的研究結(jié)果是相符合的[26]。有趣的是,AA預(yù)處理可以顯著降低LPS肉雞腎組織的MDA水平,同時升高GSH-Px、SOD和CAT的酶活性?？傊?上述結(jié)果表明,AA能夠抑制LPS引起肉雞腎組織的氧化應(yīng)激,從而減輕LPS誘導(dǎo)肉雞AKI。

凋亡是細胞自我更新的程序性死亡方式,而過度的細胞凋亡是組織損傷的表現(xiàn);氧化應(yīng)激會引起線粒體通透性增加并導(dǎo)致Cytc從線粒體轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中,隨后激活Caspase3并觸發(fā)線粒體途徑的細胞凋亡[27]。細胞凋亡的特征還包括促凋亡蛋白P53、BAX和Bak1的表達增加,抗凋亡蛋白的表達減少[28]。先前的研究表明,LPS誘導(dǎo)的器官損傷和細胞凋亡有著密切聯(lián)系,LPS可激活過度的炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激,進而介導(dǎo)細胞凋亡[29]。本研究發(fā)現(xiàn),LPS處理增加肉雞腎中P53、BAX、Bak1、Cytc和Caspase3的mRNA表達水平,降低BCl2的mRNA水平;同時,LPS處理增加了肉雞腎中P53、BAX、Bak1和Cleaved-Caspase3的蛋白表達以及降低BCl2蛋白的表達;此外,免疫組織化學(xué)的結(jié)果顯示,LPS處理顯著增加Cytc在腎組織中的表達;TUNEL結(jié)果發(fā)現(xiàn),LPS極顯著地增加腎組織中的細胞凋亡率,這和前人的研究結(jié)果是一致的[30]。有意思的是,AA預(yù)處理可顯著降低P53、BAX、Bak1、Cytc和Caspase3的基因和蛋白表達,上調(diào)BCl2基因和蛋白的表達;AA還能降低Cytc蛋白在LPS誘導(dǎo)肉雞AKI中的表達,且極顯著抑制LPS誘導(dǎo)肉雞腎組織的細胞凋亡率。上述結(jié)果首次表明,AA預(yù)處理通過調(diào)控細胞凋亡相關(guān)基因和蛋白表達水平減輕了LPS誘導(dǎo)的肉雞AKI。

自噬是溶酶體降解受損的細胞器并進行自我更新的過程,在維持細胞穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用[31]。P62 是具有多結(jié)構(gòu)的蛋白,在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖和炎癥中起著關(guān)鍵作用[32];Beclin1是調(diào)節(jié)自噬活性的關(guān)鍵因子,當Beclin1表達減弱時表明自噬被抑制[33-34]。ATG5和LC3是自噬的重要標志物,抑制自噬會導(dǎo)致ATG5和LC3蛋白的表達降低[35-36]。研究表明,LPS可引起過度自噬誘導(dǎo)細胞損傷[37];然而,也有研究證明LPS處理可以抑制細胞自噬,導(dǎo)致細胞功能障礙并誘導(dǎo)器官損傷[38]。本研究發(fā)現(xiàn),LPS處理降低了肉雞腎組織自噬相關(guān)基因和蛋白的表達水平,而AA預(yù)處理顯著增加LPS誘導(dǎo)的肉雞AKI中自噬相關(guān)基因和蛋白的表達水平;此外,免疫熒光結(jié)果顯示,AA預(yù)處理極顯著地增加了LPS誘導(dǎo)的肉雞AKI中LC3-II蛋白的表達。本研究首次表明AA預(yù)處理能通過促進自噬減輕LPS誘導(dǎo)肉雞的AKI。

4 結(jié) 論

總之,積雪草酸(AA)通過降低腎氧化應(yīng)激水平、減少細胞凋亡和促進細胞自噬減輕LPS誘導(dǎo)的肉雞急性腎損傷(AKI),這為AA成為潛在的家禽飼料添加劑提供了有力的理論依據(jù)。