構(gòu)樹與茅臺(tái)酒糟不同混合比例對其青貯品質(zhì)及微生物組成的影響

何湘江 樊雪瑩 陳玉連* 成啟明 李茂雅 雷 耀 王佳楚函 趙圓圓 陳 超 王偉東 王志軍

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴陽 550025;2.興安盟農(nóng)牧技術(shù)推廣中心,烏蘭浩特 137400;3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院,草地資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼草栽培、加工與高效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,呼和浩特 010021)

貴州省位于我國西南地區(qū),擁有典型的喀斯特地貌,其主要特征是高海拔、多山及水土流失嚴(yán)重[1],不適合大量種植如苜蓿、玉米和黑麥草等傳統(tǒng)牧草。而隨著貴州畜牧業(yè)的快速發(fā)展,常規(guī)飼草飼料已經(jīng)不能滿足畜牧業(yè)的需求[2]。因此,開發(fā)利用非常規(guī)飼料資源以解決飼料短缺問題勢在必行。

構(gòu)樹(BroussonetiapapyriferaL.)是一種?？?、構(gòu)樹屬的木本植物,適應(yīng)性強(qiáng),生長迅速,生產(chǎn)成本低且分布廣泛[3]。構(gòu)樹的收獲季節(jié)正值雨季,十分潮濕,難以制成干草長期保存,使用青貯調(diào)制的方式貯存構(gòu)樹已被證明是保存構(gòu)樹營養(yǎng)的最佳方式[4]。在青貯過程中,附生乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)將飼草中的可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate,WSC)發(fā)酵成有機(jī)酸[主要是乳酸(lactic acid,LA)],從而降低pH,抑制有害微生物[5]。已有研究表明,構(gòu)樹可以作為蛋白質(zhì)飼料[6]。在牛和山羊的飼糧中添加適量的構(gòu)樹青貯飼料可以提高其生長性能、肉品質(zhì)以及免疫和抗氧化功能[7-8]。由于構(gòu)樹富含蛋白質(zhì)、維生素和氨基酸,我國已經(jīng)種植了大約30萬hm2的構(gòu)樹作為非常規(guī)動(dòng)物飼料[9]。然而,新鮮構(gòu)樹由于緩沖能值高,且WSC含量和LAB數(shù)量較低(<105CFU/g FM),導(dǎo)致構(gòu)樹單獨(dú)青貯難以成功。

茅臺(tái)酒糟是釀酒過程中由各種糧食谷物加工后所產(chǎn)生的固體廢棄物[10],其中絕大部分的營養(yǎng)物質(zhì)未被完全利用,如WSC、維生素和氨基酸等[11]。隨著我國釀酒業(yè)的蓬勃發(fā)展,酒糟產(chǎn)量也逐漸增加。楊玉能等[12]研究表明,飼喂茅臺(tái)酒糟生物料可以提高雜交牛的背部肌肉厚度,且通過改善肌內(nèi)蛋白質(zhì)和脂肪含量以及脂肪中各種脂質(zhì)代謝分子表達(dá)量,使肉質(zhì)得到改善。不過,酒糟由于含水量高,不易長期保存。張磊等[13]研究表明,將酒糟與其他優(yōu)質(zhì)原料采用適當(dāng)比例進(jìn)行混合青貯,可以提高酒糟及相應(yīng)原料的營養(yǎng)物質(zhì)利用率,這既能解決酒糟的保存問題,又可以提高青貯飼料營養(yǎng)價(jià)值,增強(qiáng)青貯飼料品質(zhì)及適口性。因此,筆者猜想構(gòu)樹與茅臺(tái)酒糟混合青貯可以制得優(yōu)質(zhì)青貯飼料。

目前,關(guān)于構(gòu)樹與茅臺(tái)酒糟混合青貯的研究未見報(bào)道。本研究擬開展構(gòu)樹與茅臺(tái)酒糟不同混合比例對其青貯品質(zhì)的影響研究,通過綜合分析其養(yǎng)分含量、發(fā)酵品質(zhì)和微生物組成等指標(biāo),篩選出構(gòu)樹與茅臺(tái)酒糟混合青貯的最適比例,為開發(fā)利用非常規(guī)飼料提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用材料為取自貴州省安順市長順縣的構(gòu)樹,以及取自貴州省仁懷市茅臺(tái)鎮(zhèn)茅臺(tái)集團(tuán)酒廠的茅臺(tái)酒糟。2種原料通過自然風(fēng)干晾曬6 h左右進(jìn)行青貯。原料營養(yǎng)水平見表1。

表1 原料營養(yǎng)水平

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)共設(shè)置6個(gè)不同的構(gòu)樹與茅臺(tái)酒糟混合比例,分別為:100%構(gòu)樹(GCK組)、80%構(gòu)樹和20%茅臺(tái)酒糟(Ⅰ組)、60%構(gòu)樹和40%茅臺(tái)酒糟(Ⅱ組)、40%構(gòu)樹和60%茅臺(tái)酒糟(Ⅲ組)、20%構(gòu)樹和80%茅臺(tái)酒糟(Ⅳ組)以及100%茅臺(tái)酒糟(JCK組)。以鮮重為基礎(chǔ),青貯60 d后,測定青貯樣品的養(yǎng)分含量、發(fā)酵品質(zhì)及微生物組成,每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3 青貯制備

將構(gòu)樹頂端50 cm左右的枝葉,切成2～3 cm的小段,按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)比例將構(gòu)樹與茅臺(tái)酒糟充分混勻后,稱取330 g,裝入聚乙烯袋中,用真空機(jī)抽真空密封青貯。青貯袋封口后置于室溫下避光保存60 d。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 樣品處理

將10 g青貯樣品與90 mL蒸餾水混合均勻,在4 ℃下浸提24 h后,通過4層紗布和定性濾紙過濾得到樣品浸提液,置于-20 ℃條件下保存,用于氨態(tài)氮(ammonia nitrogen,NH3-N)和有機(jī)酸含量的測定。其余樣品置于烘箱,65 ℃烘干至恒重,用于測定干物質(zhì)(dry matter,DM)、粗蛋白質(zhì)(crude protein,CP)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber,NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber,ADF)和WSC含量。

1.4.2 養(yǎng)分含量的測定

CP含量采用凱氏定氮法利用定氮儀(KN680,ALVA)[14]測定;WSC含量采用蒽酮-硫酸法[15]測定;NDF和ADF含量采用濾袋分析法[16]利用全自動(dòng)纖維測定儀(ANKOM A-200I)測定;DM含量參考張麗英[17]的方法測定。

1.4.3 發(fā)酵品質(zhì)的測定

pH采用精密pH計(jì)進(jìn)行測定。NH3-N、LA、乙酸(acetic acid,AA)、丙酸(propionic acid,PA)和丁酸(butyric acid,BA)含量參照DB15/T 1458—2018[18]方法使用DIONEX-2500型離子色譜分析儀測定。采用ASⅡ離子色譜柱,流動(dòng)相由EG50淋洗液在線發(fā)生器產(chǎn)生(1%氫氧化鉀溶液),流速0.8 mL/min;采用AS50自動(dòng)進(jìn)樣器,進(jìn)樣量10 μL,在室溫下進(jìn)行測試。進(jìn)樣前樣品稀釋10～25倍,45 μm濾膜過濾。

1.4.4 微生物組成分析

將每個(gè)青貯處理的3個(gè)重復(fù)樣品均勻地混合在一起,使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit試劑盒提取青貯飼料中的微生物總DNA,使用細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)引物(F:CCTAYGGGRBGCASCAG;R:GGACTACNNGGGTATCTAAT),對以上獲得的DNA模板進(jìn)行序列擴(kuò)增。真菌ITS擴(kuò)增子測序引物為F:CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA;R:GCTGCGTTCTTCATCGATGC。使用2%凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,根據(jù)NovaSeq 6000的PE250模式pooling上機(jī)測序。微生物數(shù)據(jù)使用北京諾禾致源科技股份有限公司提供的云平臺(tái)進(jìn)行分析[19]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行方差分析,并利用GraphPad軟件制作圖表;結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)樹與茅臺(tái)酒糟不同混合比例對其青貯飼料養(yǎng)分含量的影響

構(gòu)樹與茅臺(tái)酒糟不同混合比例對其青貯飼料養(yǎng)分含量的影響見表2。在混合青貯組(Ⅰ組～Ⅳ組)中,Ⅱ組青貯飼料CP含量顯著高于GCK組和Ⅰ組(P<0.05),NDF含量顯著低于GCK組(P<0.05),ADF含量顯著低于GCK組和Ⅰ組(P<0.05)。所有混合青貯組青貯飼料WSC和DM含量均顯著低于JCK組(P<0.05),NDF和ADF含量均顯著低于GCK組(P<0.05)。

表2 構(gòu)樹與茅臺(tái)酒糟不同混合比例對其青貯飼料養(yǎng)分含量的影響

2.2 構(gòu)樹與茅臺(tái)酒糟不同混合比例對其青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響

構(gòu)樹與茅臺(tái)酒糟不同混合比例對其青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響見表3。所有混合青貯組青貯飼料pH顯著低于GCK組(P<0.05),PA含量顯著高于GCK組(P<0.05)。在混合青貯組中,Ⅱ組青貯飼料pH最低,顯著低于Ⅰ組(P<0.05);LA含量最高,顯著高于Ⅲ組(P<0.05),同時(shí)也顯著高于JCK組(P<0.05)。Ⅳ組青貯飼料AA含量最低,顯著低于其他混合青貯組(P<0.05)。Ⅲ組青貯飼料PA含量最低,顯著低于其他混合青貯組(P<0.05);其他混合青貯組之間PA含量無顯著差異(P<0.05),但均顯著高于JCK組和GCK組(P<0.05)。各組青貯飼料均未檢測出BA存在。Ⅲ組青貯飼料NH3-N含量顯著低于GCK組和Ⅰ組(P<0.05)。

表3 構(gòu)樹與茅臺(tái)酒糟不同混合比例對其青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響

2.3 構(gòu)樹與茅臺(tái)酒糟不同混合比例對其青貯飼料微生物組成的影響

2.3.1 青貯飼料細(xì)菌在門水平上的組成

基于門水平的構(gòu)樹與茅臺(tái)酒糟混合青貯飼料細(xì)菌組成如圖1所示。GCK組、Ⅳ組和JCK組青貯飼料的優(yōu)勢菌門為變形菌門(Proteobacteria),其余組的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門(Firmicutes)。除此之外,各組還含有少量的擬桿菌門(Bacteroidota)和放線菌門(Actinobacteria),JCK組存在部分疣微菌門(Verrucomicrobiota)。Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組青貯飼料的厚壁菌門相對豐度相較于Ⅳ組均有所提高,同時(shí)變形菌門的相對豐度均有所降低。

圖1 青貯飼料細(xì)菌在門水平上的組成

2.3.2 青貯飼料細(xì)菌在屬水平上的組成

基于屬水平的構(gòu)樹與茅臺(tái)酒糟混合青貯飼料細(xì)菌組成如圖2所示。與混合青貯組相比,GCK組或JCK組青貯飼料的乳桿菌屬(Lactobacillus)相對豐度較低,其他(others)和假單胞菌屬(Pseudomonas)相對豐度較高,因此單獨(dú)青貯不易成功。Ⅱ組青貯飼料的優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬,相對豐度為41.75%。隨著茅臺(tái)酒糟混合比例的提高,乳桿菌屬的相對豐度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,當(dāng)茅臺(tái)酒糟混合比例達(dá)到40%時(shí)乳桿菌屬相對豐度最高,說明Ⅱ組的青貯效果較好。

圖2 青貯飼料細(xì)菌在屬水平上的組成

2.3.3 青貯飼料真菌在門水平上的組成

基于門水平的構(gòu)樹與茅臺(tái)酒糟混合青貯飼料真菌組成如圖3所示。各組青貯飼料真菌的優(yōu)勢菌門為子囊菌門(Ascomycota),其中JCK組青貯飼料的子囊菌門相對豐度最高。隨著茅臺(tái)酒糟混合比例的提高,混合青貯組青貯飼料中子囊菌門相對豐度逐漸提高。

圖3 青貯飼料真菌在門水平上的組成

2.3.4 青貯飼料真菌在屬水平上的組成

基于屬水平的構(gòu)樹與茅臺(tái)酒糟混合青貯飼料真菌組成如圖4所示。JCK組青貯飼料的哈薩克斯坦酵母屬-假絲酵母屬分支(Kazachstania-Candida_clade)相對豐度達(dá)20.00%,而Ⅱ組青貯飼料未檢測到哈薩克斯坦酵母屬-假絲酵母屬分支。隨著茅臺(tái)酒糟混合比例的提高,青貯飼料的畢赤酵母屬(Pichia)相對豐度呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢,Ⅱ組青貯飼料的畢赤酵母屬相對豐度低于JCK組和GCK組,Ⅰ組青貯飼料的畢赤酵母屬相對豐度高于JCK組和GCK組。

圖4 青貯飼料真菌在屬水平上的組成

3 討 論

3.1 構(gòu)樹與茅臺(tái)酒糟不同混合比例對其青貯飼料養(yǎng)分含量的影響

研究發(fā)現(xiàn),新鮮原料中足夠的WSC含量(6%～8% DM)對于保證青貯發(fā)酵質(zhì)量至關(guān)重要[20]。新鮮構(gòu)樹中NDF和ADF含量較高,WSC含量低于6%,難以很好的青貯;而酒糟中WSC含量較高(7.49% DM),故而本研究中添加茅臺(tái)酒糟與構(gòu)樹混合青貯彌補(bǔ)了新鮮構(gòu)樹原料WSC含量的不足,以促進(jìn)LAB發(fā)酵。

本研究中,所有混合青貯組青貯飼料的WSC含量均顯著低于JCK組,這是因?yàn)樾迈r酒糟本身WSC含量較高。隨著茅臺(tái)酒糟混合比例的提高,各混合青貯組青貯飼料CP含量呈上升趨勢,這與陳冬梅等[21]的研究中,隨著白酒糟混合比例的提高,青貯飼料CP含量呈上升趨勢的研究結(jié)果一致。本研究中,所有混合青貯組青貯飼料NDF和ADF含量顯著低于GCK組;任海偉等[22]研究報(bào)道,白酒糟與菊芋渣混合青貯,青貯飼料的NDF和ADF含量變化與本研究類似,這說明構(gòu)樹與茅臺(tái)酒糟混合青貯有利于青貯原料中纖維的降解,從而提高青貯飼料的飼用價(jià)值[23]。

3.2 構(gòu)樹與茅臺(tái)酒糟不同混合比例對其青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響

本研究中,構(gòu)樹與茅臺(tái)酒糟混合青貯處理對其青貯飼料pH以及LA、AA、PA和NH3-N含量有顯著影響。其中,所有混合青貯組青貯飼料pH都顯著低于GCK組,這與張遠(yuǎn)凌[24]的研究結(jié)果相似,表明混合青貯能夠降低構(gòu)樹青貯pH,提高構(gòu)樹青貯成功率。除Ⅲ組外,所有混合青貯組青貯飼料LA含量均顯著高于JCK組,其中Ⅱ組青貯飼料LA含量最高,且顯著高于Ⅲ組,證明該組青貯發(fā)酵效果較好。尉小強(qiáng)等[25]研究表明,青貯中PA含量越高,有氧穩(wěn)定性越好。本試驗(yàn)中,所有混合青貯組青貯飼料PA含量均較高,且顯著高于GCK組和JCK組,這說明混合青貯組有氧穩(wěn)定性可能更好。而PA含量較高的原因可能是混合調(diào)制的青貯飼料在60 d之前就已經(jīng)發(fā)酵完全[26],酒糟比例越高可能發(fā)酵完全的越快,故而PA含量隨酒糟比例的提高而提高。NH3-N含量可以反映青貯過程中蛋白質(zhì)和氨基酸的降解程度[27]。本研究中,Ⅱ組青貯飼料NH3-N含量低于GCK組,說明Ⅱ組的蛋白質(zhì)水解程度小于構(gòu)樹單獨(dú)青貯。如果青貯飼料中檢測到BA,則說明青貯飼料中有梭菌存在,這會(huì)加劇青貯中DM的損失,本研究中所有混合青貯組均未檢測到BA,說明構(gòu)樹與茅臺(tái)酒糟混合青貯有利于青貯飼料養(yǎng)分含量的保存[28]。從發(fā)酵指標(biāo)綜合來看,構(gòu)樹與茅臺(tái)酒糟混合比例為6∶4時(shí)的青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)較好。

3.3 構(gòu)樹與茅臺(tái)酒糟不同混合比例對其青貯飼料微生物組成的影響

微生物作為青貯發(fā)酵過程中的關(guān)鍵因素,將直接影響青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的好壞。本研究基于門水平的青貯飼料細(xì)菌組成中,混合青貯組(Ⅳ組除外)的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門,而JCK組和GCK組的優(yōu)勢菌門為變形菌門,這與陶蓮等[29]的研究結(jié)果類似。由此說明構(gòu)樹與茅臺(tái)酒糟混合青貯后有益菌相對豐度提高,且抑制了有害菌的生長,從而降低了青貯飼料養(yǎng)分的消耗。從屬水平上來看,單獨(dú)青貯組的優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬和其他,而乳桿菌屬和腸球菌屬(Enterococcus)等有益菌相對豐度較低,這說明這2種原材料單獨(dú)青貯時(shí)都不易成功[30]。構(gòu)樹與茅臺(tái)酒糟混合青貯后優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬,且隨著茅臺(tái)酒糟混合比例的提高,乳桿菌屬相對豐度呈現(xiàn)先提高后降低的變化趨勢,當(dāng)茅臺(tái)酒糟混合比例達(dá)到40%時(shí)乳桿菌屬相對豐度最高,這說明Ⅱ組青貯效果較好;而茅臺(tái)酒糟混合比例過高時(shí),乳桿菌屬相對豐度出現(xiàn)下降,這說明茅臺(tái)酒糟混合比例不宜過高。

基于門水平的青貯飼料真菌組成中,青貯飼料的優(yōu)勢菌門為子囊菌門,其中JCK組子囊菌門相對豐度最高。隨著茅臺(tái)酒糟混合比例的提高,混合青貯組青貯飼料的子囊菌門相對豐度逐漸提高。從屬水平上來看,JCK組青貯飼料的哈薩克斯坦酵母屬-假絲酵母屬分支相對豐度達(dá)20.00%,這可能是因?yàn)槊┡_(tái)酒糟原料中酵母菌屬相對豐度較高所致;而混合青貯組和GCK組未檢測到哈薩克斯坦酵母屬-假絲酵母屬分支,這說明混合青貯有利于減少哈薩克斯坦酵母屬-假絲酵母屬分支的存在。隨著茅臺(tái)酒糟混合比例的提高,青貯飼料的畢赤酵母屬相對豐度呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢,Ⅱ組青貯飼料的畢赤酵母屬相對豐度低于JCK組和GCK組,這說明混合青貯可以減少畢赤酵母屬的存在;而Ⅰ組青貯飼料的畢赤酵母屬相對豐度高于單獨(dú)青貯組,這說明構(gòu)樹混合比例不宜過高。

從微生物組成來看,當(dāng)構(gòu)樹與茅臺(tái)酒糟混合比例為6∶4時(shí),混合青貯飼料中乳桿菌屬等有益菌相對豐度較高,假單胞菌屬等有害菌相對豐度較低,哈薩克斯坦酵母屬-假絲酵母屬分支相對豐度較低,更適宜青貯。

4 結(jié) 論

構(gòu)樹與茅臺(tái)酒糟混合青貯不僅提高了構(gòu)樹的利用率,豐富了飼料來源,而且提升了青貯飼料的營養(yǎng)價(jià)值和發(fā)酵品質(zhì),同時(shí)提高了青貯飼料中乳桿菌屬等有益菌的相對豐度,降低了假單胞菌屬等有害菌的相對豐度。從營養(yǎng)價(jià)值、發(fā)酵品質(zhì)和微生物組成等因素綜合考慮,60%構(gòu)樹與40%茅臺(tái)酒糟混合青貯發(fā)酵品質(zhì)較好。