八角柱頭可授性、花粉活力和座果率分析

黃開順，李開祥，梁文匯，曾祥艷，楊卓穎

（廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院 廣西特色經(jīng)濟(jì)林培育與利用重點實驗室 國家林業(yè)和草原局八角肉桂工程技術(shù)研究中心 廣西木本香料工程技術(shù)研究中心，廣西南寧 530002）

八角（Illiciumverum）是適生于我國南亞熱帶丘陵山地的經(jīng)濟(jì)樹種，主要產(chǎn)品為八角果及從果和枝葉提取的茴香油，被廣泛用作食品香料及日化香精和醫(yī)藥原料[1]。廣西是世界上最大的八角產(chǎn)地，八角種植面積達(dá)36.56 萬公頃，在毗鄰廣西的云南省文山壯族苗族自治州也有大量栽培，其中富寧縣八角種植面積達(dá)4.4萬公頃[2]。

八角開花主要集中在8—10 月，這段時間也是上1 年開花座果的成熟期，八角具有花果同期的生物學(xué)特性[3]。在長達(dá)3 個月的花期跨度中，8、9 月屬高溫、高濕的夏季；10 月，天氣轉(zhuǎn)涼，空氣明顯干燥，氣候條件發(fā)生變化；不同月份間花粉活力和座果率是否有差異，目前未有研究對其進(jìn)行探討。八角花器官的發(fā)育過程從形態(tài)上可分為花蕾期、初開期、盛開期和凋謝期4 個發(fā)育階段，花蕾期可進(jìn)一步細(xì)分為小蕾期和含苞欲放大蕾期，整個過程歷時約31.20 天，其中花蕾期約27.69 天，初開期、盛開期和凋謝期共約3.51 天[3]。在不同發(fā)育階段，八角花器官柱頭的可授性是否有差異，也尚未明確。本研究針對以上兩個問題，分析八角花器官在不同發(fā)育階段柱頭可授性的差異及不同月份開花花粉活力和座果率的差異，探討八角柱頭的最佳可授時期，為八角雜交育種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院八角種質(zhì)資源收集圃（108°21′E，22°55′N）內(nèi)選擇15 年生、同一品系、樹冠自然開張且無病蟲害的3 株八角為試驗材料，于2017 年8—10 月開展柱頭可授性、花粉活力和座果率調(diào)查。

1.2 試驗方法

1.2.1 柱頭可授性檢測

9 月中旬，每株采集含苞欲放、初開、盛開和凋謝的花器官各3朵。野外現(xiàn)場觀察并記錄開放花器官的花藥是否開裂，將所有花器官立即帶回實驗室檢測柱頭可授性。采用聯(lián)苯胺-過氧化氫法檢測柱頭可授性[4]。將柱頭浸入聯(lián)苯胺-過氧化氫溶液，30 min 后采用放大鏡觀察柱頭染色部位；柱頭呈藍(lán)色并伴有氣泡出現(xiàn)，表明柱頭具有可授性，否則柱頭無可授性。

1.2.2 花粉活力測定

8—10 月每月中旬，每株采集6 朵花藥剛開裂、散粉不久的花器官，立即帶回實驗室進(jìn)行花粉活力測定。采用TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）染色法分析花粉活力[5]。每朵花制作1 個花粉染色玻片。在載玻片上滴2 滴TTC 液，將八角花雄蕊在載玻片上的TTC 液中反復(fù)蘸動，使花粉散落至TTC 液中并攤勻，蓋上蓋玻片。將玻片置于室外日光下直曬5～20 min，肉眼看見玻片內(nèi)呈現(xiàn)淡紅色時立即搬回室內(nèi)，在顯微鏡下觀察花粉染色情況并記錄。采用生物顯微鏡Nikon ECLIPSE 80i 及其圖像分析軟件NIS-Elements D，放大觀察花粉染色效果。每個玻片在10×0.25 倍鏡下觀察5 個視野，采用40×0.75 倍鏡放大輔助觀察。根據(jù)花粉染色程度判定其活力強(qiáng)弱，紅色代表活力強(qiáng)，淡紅色代表活力弱，未染紅色代表無活力。花粉活力百分率計算公式為：

1.2.3 座果率調(diào)查

8—10 月每月中旬，每株選擇含苞欲放花蕾60個。其中，套袋處理30 個；以單個花蕾進(jìn)行套袋隔離處理，用白色硫酸紙袋套住花蕾和小枝，密封袋口。不套袋處理30 個，為對照。30 天后，每株分別調(diào)查和統(tǒng)計套袋處理和不套袋處理的座果率，計算公式為：

1.3 數(shù)據(jù)處理

花粉活力百分率和座果率均取單株平均值，采用Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行方差分析，采用LSD法進(jìn)行多重比較[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 八角花器官不同發(fā)育階段柱頭可授性

八角花的柱頭數(shù)量多為8 個，雄蕊10～26 枚；雄蕊圍繞柱頭排列，上端有2個花藥室，花藥室開裂后散出花粉（圖1 a～c）。將柱頭浸泡至聯(lián)苯胺-過氧化氫溶液中，柱頭表面呈藍(lán)色并伴有氣泡出現(xiàn)（圖1d），說明柱頭已具有可授性，可接受花粉并實現(xiàn)傳粉和受精。

圖1 八角花器官及其柱頭可授性檢測Fig.1 Floral organ and determination of stigma receptivity of I.verum

八角花器官在含苞欲放大蕾期和初開期，所有柱頭已具有可授性（表1）。發(fā)育至盛開期，多數(shù)柱頭仍具有可授性，但部分柱頭可授性開始下降，甚至已失去可授性。發(fā)育至凋謝期，絕大多數(shù)柱頭已沒有可授性，接受花粉能力衰退甚至喪失。花藥發(fā)育進(jìn)程與柱頭可授性變化趨勢相反；含苞欲放大蕾期和初開期，花藥基本未開裂；盛開期至凋謝期，花藥開裂并大量散出花粉。

表1 八角柱頭可授性及花藥發(fā)育Tab.1 Stigma receptivity and anther development of I.verum

2.2 八角不同月份開花花粉活力

通過TTC 液處理后，八角花粉顯色反應(yīng)靈敏，在顯微鏡下觀察，可發(fā)現(xiàn)強(qiáng)活力花粉呈紅色，弱活力花粉呈淡紅色，發(fā)育不良、無活力花粉基本無明顯著色（圖2）。

圖2 TTC染色法檢測八角花粉活力Fig.2 Pollen vitality of I.verum detected by TTC staining method

8—10 月，有活力花粉百分率分別為90.27%、96.62%和69.81%；8、9 月有活力花粉百分率均較高，10 月有活力花粉百分率顯著下降（P<0.05）（圖3）。8—10 月，強(qiáng)活力花粉百分率逐漸下降，分別為66.73%、63.52%和35.63%；弱活力花粉百分率逐漸上升，分別為23.53%、33.10%和34.18%。八角8、9月開花，有活力和強(qiáng)活力花粉百分率均較高，較有利于傳粉。

圖3 八角不同月份開花花粉活力百分率Fig.3 Percentages of pollen vitality of I.verum flowering in different months

2.3 八角不同月份開花座果率

八角不同月份開花，座果率差異顯著（P<0.05）（圖4）。8 月套袋座果率為10.00%，不套袋自然座果率為62.41%；9 月套袋座果率為22.22%，不套袋自然座果率為76.88%；10 月套袋座果率為4.44%，不套袋自然座果率為61.48%。不論套袋與否，9 月開花的座果率均顯著高于8 和10 月；各月份的套袋座果率均明顯低于未套袋座果率。

圖4 八角不同月份開花的座果率Fig.4 Fruit setting rates of I.verum flowering in different months

3 討論與結(jié)論

許多研究表明，植物柱頭的可授性在花器官發(fā)育和開放過程中會發(fā)生變化。余道平等[7]研究發(fā)現(xiàn)，峨眉擬單性木蘭（Parakmeriaomeiensis）在花被片初展期間，柱頭可授性最強(qiáng)，此時柱頭有大量粘性分泌物便于接受花粉，但盛開時僅部分柱頭具有可授性。本研究結(jié)果顯示，八角花器官在含苞欲放大蕾期，所有柱頭已具備可授性；至盛開期，部分柱頭已喪失可授性；至凋謝期，絕大多數(shù)柱頭已沒有可授性。在雜交授粉工作中，應(yīng)選擇八角花器官處在含苞欲放大蕾期至花瓣初開期柱頭具有可授性時進(jìn)行人工授粉，能獲得更高的成功率。觀察中發(fā)現(xiàn)，八角雄蕊花藥發(fā)育進(jìn)程與柱頭可授性變化趨勢相反，在盛開期至凋謝期才大量開裂散粉；說明八角柱頭可授期與雄蕊花藥散粉期不同步，具有雌蕊先熟的生殖特性。這可能是八角為了提高生存能力，避免近交衰退，發(fā)展了一種雌雄蕊異熟的時間隔離繁殖策略，降低花粉落在自身柱頭上的概率，減少自交，促進(jìn)異交，增加遺傳多樣性。與八角親緣關(guān)系較近的古老孑遺植物群體木蘭科（Magnoliaceae）樹種也通過雌雄蕊異熟機(jī)制提升物種的繁殖能力；香港木蘭（Magnoliachampionii）雌蕊可授期和雄蕊可授期完全沒有重疊[8]；玉蘭（Magnoliadenudata）雌蕊可授期和雄蕊可授期間隔36 h[9]；廣玉蘭（Magnoliagrandiflora）僅存在1 個短暫的雌雄重疊期[10]；灰木蓮（Manglietiaglauca）雌蕊比雄蕊早2～3天成熟[11]。

花粉活力受自身遺傳特性和外界因素的影響，溫度和濕度是影響花粉壽命的重要因素[12]?；ǚ塾谢盍κ请s交育種成功的前提條件，花粉采集時間是影響花粉活力的重要因素[13-14]。了解花粉的可育性變化規(guī)律，并選擇在花粉普遍具有活力的時期進(jìn)行授粉，可提高授粉成功率。本研究結(jié)果顯示，8—10月，八角有活力花粉百分率差異顯著；8、9 月的有活力和強(qiáng)活力花粉百分率均較高，10 月較低?？赡芘c10 中旬入秋后氣溫下降有關(guān)，氣候條件發(fā)生明顯變化，大部分花粉活力下降甚至喪失，說明八角繁殖喜歡暖熱氣候條件。Hedhly 等[15]認(rèn)為，植物花粉萌發(fā)的最佳溫度反映該植物自然花期的溫度適應(yīng)性。陳新偉[16]研究發(fā)現(xiàn)，部分番茄（Solanumlycopersicum）品種花粉對氣溫的敏感性較強(qiáng)，氣溫下降會導(dǎo)致花粉活力百分率下降。陳燕等[17]研究發(fā)現(xiàn)貫月忍冬（Lonicerasempervirens）和金銀花（Lonicerajaponica）的花粉在高溫環(huán)境中更容易萌發(fā)。

八角不同月份開花的座果率差異顯著，9 月開花的自然座果率顯著較高，8 和10 月開花的自然座果率均較低；對花蕾進(jìn)行套袋隔離處理后，也是9月開花的座果率顯著較高；各月份套袋座果率均明顯低于未套袋座果率。套袋阻隔了風(fēng)、昆蟲等傳粉媒介的作用，無法發(fā)生異花傳粉，但存在自花授粉現(xiàn)象，座果率較低，也說明八角座果主要來自于異花傳粉，雌雄蕊異熟特性也印證了這一結(jié)論。許多木蘭科植物的自交座果率低甚至不座果；景寧木蘭（Magnoliasinostellata）自交座果率僅2%[18]；小花木蘭（Magnoliasieboldii）套袋后不座果[19-20]。

9 月是八角有活力花粉百分率最高的時期，此時開花的座果率也最高，最適合采集花粉進(jìn)行雜交授粉。八角柱頭的最佳可授期為花蕾含苞欲放大蕾期，授粉時宜選擇準(zhǔn)備開放的花蕾作為母本。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：黃開順負(fù)責(zé)試驗實施和論文撰寫；李開祥負(fù)責(zé)試驗構(gòu)思指導(dǎo)；梁文匯負(fù)責(zé)試驗設(shè)計；曾祥艷負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)分析和圖表繪制；楊卓穎負(fù)責(zé)野外調(diào)查和試驗實施。