芩蓮正積方水提物中總黃酮提取工藝的優(yōu)化*

孫 瑤，蘇 適，陳洪玉，張曉萌，閻力君

（哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076）

芩蓮正積方由黃芩、半枝蓮、清半夏、莪術(shù)、重樓、浙貝母、薏苡仁、厚樸、陳皮和甘草10 味中藥組成，具有扶正祛邪的功效，能抑制肺癌轉(zhuǎn)移，在臨床上對非小細(xì)胞肺癌患者有良好的治療作用[1-4]。研究表明，芩蓮正積方中的有效成分黃酮類化合物能發(fā)揮重要的抗腫瘤作用，能阻滯NSCLC 細(xì)胞增殖，抑制EMT 和血管生成，抑制NSCLC 的生長和轉(zhuǎn)移，促進NSCLC 細(xì)胞凋亡等[5-7]。中藥材的溶劑提取法在多種提取方法中應(yīng)用廣泛，根據(jù)相似相溶原理，溶劑進入藥材內(nèi)部，通過解除組織吸附作用而提高有效成分的濃度，增加滲透壓，形成細(xì)胞內(nèi)外滲透壓差，破壞植物細(xì)胞壁而加快內(nèi)容物流出，能夠有效提取化合物[8]。黃酮類化合物的提取方法廣泛，包括水提法、回流-酶法和超聲-酶法、超聲波提取和微波提取等[9-11]。水提法是傳統(tǒng)的中藥提取方法，具有操作簡單、提取方便和成本低等優(yōu)點，能夠有效地提取黃酮類化合物[12]。因此，本實驗采用水提法提取芩蓮正積方，以方中總黃酮提取率為指標(biāo)，經(jīng)由單因素實驗和正交實驗優(yōu)化提取工藝，為芩蓮正積方更好的發(fā)揮療效奠定基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑與儀器

黃芩、半枝蓮、清半夏、莪術(shù)、重樓、浙貝母、厚樸、薏苡仁、陳皮和甘草，均購自黑龍江省哈爾濱市三棵樹藥材市場。

NaNO2（AR 純度99% 天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；Al（NO3）3（AR 純度99% 天津市福晨化學(xué)試劑廠）；NaOH（AR 純度96% 天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；無水乙醇（純度100% 中國科學(xué)院成都生物研究所）；蒸餾水（哈爾濱市南崗區(qū)實林蒸餾水經(jīng)銷處）。

精密電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；XMTD-4000 型電熱恒溫水浴鍋（海申盛生物技術(shù)有限公司）；SE-750 型高速多功能粉碎機（永康市圣象電器有限公司）；Re-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多功能真空泵（鞏義市瑞德儀器設(shè)備有限公司）；L550 型臺式低速大容量離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；T6 新世紀(jì)型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 取適量黃芩、半枝蓮、清半夏、莪術(shù)、重樓、浙貝母、厚樸、薏苡仁、陳皮、甘草于高速多功能粉碎機進行粉碎，過篩后收集到自封袋中備用。

1.2.2 溶液的制備

5%NaNO2溶液 稱取NaNO210.00g，用蒸餾水溶解后定容至200mL。

10%Al（NO3）3溶液 稱取Al（NO3）320.00g，用蒸餾水溶解后定容至200mL。

4%NaOH 溶液 稱取NaOH 8.00g，用蒸餾水溶解后定容至200mL。

60%乙醇溶液 量取無水乙醇600mL，用蒸餾水定容至1000mL。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.1mg·mL-1）稱取蘆丁10.00mg，加無水乙醇溶解，然后用60%的乙醇溶液定容至100mL，搖勻。

供試品溶液（1mg·mL-1）稱取芩蓮正積方水提物粉末5.00mg，用蒸餾水定容至5mL，搖勻。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.1mg·mL-1）5 份，體積分別為0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL，轉(zhuǎn)移至10mL 容量瓶中，分別加入蒸餾水5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5mL，混合均勻后加入0.3mL的5%NaNO2溶液，靜置5min，然后加入0.3mL 的10%Al（NO3）3溶液，靜置6min，再加入2mL 的4%NaOH 溶液，蒸餾水定容至刻度線，混勻后靜置10min，以第一組為空白，于510nm 處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以蘆丁的濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為：Y=11.189X-0.0012，R2=0.9993，方程的線性良好。

1.2.4 芩蓮正積方總黃酮提取率測定 精密稱取芩蓮正積方提取物粉末，按“1.2.2”項下步驟配制成0.2mg·mL-1的供試品溶液，按“1.2.3”項下步驟測定芩蓮正積方提取物供試品溶液的吸光度，得到芩蓮正積方提取物的總黃酮提取率。

表1 單因素實驗表Tab.1 Single factor experiment

1.2.5 單因素實驗

（1）浸泡時間的影響 將13.5g 芩蓮正積方總藥物粉末按照料液比1∶15 加入蒸餾水202.5mL，混合均勻，室溫下分別不浸泡、浸泡0.5、1、1.5、2h 后，置于80℃的水浴鍋中提取60min（提取1 次）。將提取的濾液在4000r·min-1條件下離心10min，上清液經(jīng)布氏漏斗抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮藥液后，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿烘干，收集粉末備用。

（2）提取溫度的影響 將13.5g 芩蓮正積方總藥物粉末按照料液比1∶15 加入蒸餾水202.5mL，混合均勻，室溫下浸泡0.5h 后，分別置于60、70、80、90、100℃的水浴鍋中提取60min（提取1 次）。將提取的濾液在4000r·min-1下離心10min，上清液經(jīng)布氏漏斗抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮藥液后，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿烘干，收集粉末備用。

（3）提取次數(shù)的影響 將13.5g 芩蓮正積方總藥物粉末按照料液比1∶15 加入蒸餾水202.5mL，混合均勻，室溫下浸泡0.5h 后，置于80℃的水浴鍋中提取60min，分別提取1、2、3、4、5 次。將提取的濾液在4000r·min-1下離心10min，上清液經(jīng)布氏漏斗抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮藥液后，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿烘干，收集粉末備用。

（4）提取時間的影響 將13.5g 芩蓮正積方總藥物粉末按照料液比1∶15 加入蒸餾水202.5mL，混合均勻，室溫下浸泡0.5h 后，置于80℃的水浴鍋中分別提取30、60、90、120、150min（提取1 次）。將提取的濾液在4000r·min-1下離心10min，上清液經(jīng)布氏漏斗抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮藥液后，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿烘干，收集粉末備用。

（5）料液比的影響 將13.5g 芩蓮正積方總藥物粉末分別按照料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入蒸餾水，混合均勻，室溫下浸泡0.5h 后，置于80℃的水浴鍋中提取60min（提取1 次）。將提取的濾液在4000r·min-1下離心10min，上清液經(jīng)布氏漏斗抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮藥液后，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿烘干，收集粉末備用。

1.2.6 正交實驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以芩蓮正積方中總黃酮提取率為指標(biāo)，篩選出3 個對總黃酮提取率影響較大的因素，設(shè)計三因素三水平的L9（33）正交實驗，正交實驗因素水平表見表2，正交實驗設(shè)計表見表3。

表2 正交實驗因素水平表Tab.2 Orthogonal experiment level factor table

表3 正交實驗設(shè)計表Tab.3 Orthogonal experiment design table

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 使用Graphpad Prism8.0軟件進行圖表制作，使用SPSS 25.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以X±S 表示，兩組均數(shù)比較用T 檢驗，多組均數(shù)比較用單因素方差分析，P＜0.05 顯示有差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 浸泡時間的影響（圖1）

圖1 不同浸泡時間對黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of different soaking time on the extraction rate of flavonoids

由圖1 可見，延長藥材浸泡時間，并不能使芩蓮正積方中總黃酮提取率增加，反而呈現(xiàn)降低的趨勢，浸泡時間為0h 時，黃酮提取率最高，考慮到節(jié)約時間和成本的因素，為簡化提取工藝，故選擇無需浸泡進行后續(xù)實驗。

2.1.2 提取溫度的影響（圖2）

圖2 不同提取溫度對黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of different extraction temperatures on the extraction rate of flavonoids

由圖2 可見，隨著溫度的升高，能夠加快分子間的熱運動，有利于藥材細(xì)胞壁的破裂和溶劑滲入藥材而提高總黃酮的得率，在70～90℃范圍內(nèi)黃酮提取率較高，提取溫度為80℃時，提取率最高，故選擇70、80、90℃進行正交實驗。

2.1.3 提取次數(shù)的影響（圖3）

圖3 不同提取次數(shù)對黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of different extraction times on the extraction rate of flavonoids

由圖3 可見，增加提取次數(shù)，并不能顯著改善芩蓮正積方提取物中總黃酮提取率，由于此方中的藥材較多，提取出的有效成分也較多，方中半枝蓮、清半夏、浙貝母、厚樸、陳皮都含有生物堿成分，而黃酮類化合物多具酚羥基，顯酸性，可與堿類成分發(fā)生反應(yīng)；有研究表明[13]，提取2 次時，生物堿提取率最高，故推測提取次數(shù)為2 次時，大部分黃酮與生物堿發(fā)生了反應(yīng)；提取3～5 次時，黃酮提取率根據(jù)藥液中生物堿的量的減少有所回升。提取1 次得到的黃酮提取率最高，故選擇提取次數(shù)為1 次進行后續(xù)實驗。

2.1.4 提取時間的影響（圖4）

由圖4 可見，提取時間在30～60min 和90～120min兩個范圍內(nèi)，芩蓮正積方提取物中總黃酮提取率和提取時間成正比。提取時間在60～90min 和120～150min 兩個范圍，芩蓮正積方提取物中總黃酮提取率和提取時間成反比。說明改變提取時間可以影響芩蓮正積方提取物中總黃酮提取率，30～90min 比90～150min 黃酮提取率高，所以將提取時間作為正交實驗的一個考察因素，設(shè)置3 個水平為30、60、90min。

2.1.5 料液比的影響（圖5）

圖5 不同料液比對黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of different ratio of material-liquid on extraction rate of flavonoids

由圖5 可見，當(dāng)料液比為1∶15 時，黃酮提取率最高，料液比在1∶15～1∶30 范圍內(nèi)，芩蓮正積方提取物中總黃酮提取率和料液比成反比?？梢娏弦罕扔绊戃松徴e方提取物中總黃酮提取率，因此，將料液比作為正交實驗的一個考察因素，設(shè)置3 個水平為1∶10、1∶15、1∶20。

2.2 正交實驗結(jié)果

為了優(yōu)化芩蓮正積方水提取黃酮的提取工藝，根據(jù)單因素實驗結(jié)果，按照L9（34）正交設(shè)計表進行實驗，考察提取溫度（A）、提取時間（B）和料液比（C）3 個因素的正交設(shè)計對芩蓮正積方中總黃酮提取率的影響，得到9 組正交實驗結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。

表4 正交實驗結(jié)果Tab.4 Orthogonal experiment results

表5 方差分析Tab.5 Variance analysis

由表4 可知，R 值越大說明該因素對實驗結(jié)果的影響越大，比較3 個因素的R 值，對芩蓮正積方提取物中總黃酮提取率影響大的因素依次為提取時間（B）＞料液比（C）＞提取溫度（A）。K 值越大說明該水平對實驗結(jié)果的影響越大；對于A 因素：K3＞K1＞K2；對于B 因素：K2＞K1＞K3；對于C 因素：K2＞K1＞K3。以上結(jié)果說明芩蓮正積方總黃酮的最佳提取工藝為A3B2C2，即浸泡時間0h、提取次數(shù)1 次、提取溫度90℃、提取時間60min、料液比1∶15，在該提取工藝下得到的芩蓮正積方提取物中總黃酮提取率最高。

由表5 可見，提取時間（B）能夠顯著影響芩蓮正積方水提物中總黃酮提取率（P＜0.05），而提取溫度（A）和料液比（C）對芩蓮正積方水提物中總黃酮提取率沒有顯著影響。

2.3 最佳水提取工藝驗證實驗

在上述所得的最佳提取工藝條件下平行提取3次進行驗證，結(jié)果見表6。

表6 最佳工藝驗證（%）Tab.6 Optimum process verification

由表6 可見，芩蓮正積方總黃酮提取率為6.76%，RSD 為0.55%。說明此最佳工藝穩(wěn)定且合理。

3 結(jié)論

芩蓮正積方臨床上通常采用水煎煮提取法，但由于提取溫度、提取時間、溶劑量、浸泡時間和提取次數(shù)等條件的變化均能導(dǎo)致中藥復(fù)方的黃酮提取率不同，因而使療效的發(fā)揮程度有異。本文通過單因素實驗和正交實驗，得到在浸泡時間0h、提取次數(shù)1次、提取溫度90℃、提取時間60min、料液比1∶15 的提取工藝條件下，芩蓮正積方水提物中總黃酮提取率最高，為6.76%。該結(jié)果為提高方中有效成分總黃酮的溶出提供了借鑒方法。