慢性牙周炎患者血清RORA的表達(dá)水平及其與Th17/Treg細(xì)胞平衡的相關(guān)性*

趙雅靜 劉淑英 陳曉川 孫天語

(南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院牙周病科,廣東 廣州 510200)

慢性牙周炎(Chronic periodontitis,CP)是由失調(diào)的口腔微生物群引起的,是常見的牙齒支持組織炎癥性疾病,具有較高的發(fā)病率[1]。研究發(fā)現(xiàn),革蘭氏陰性菌感染是發(fā)生CP的主要原因,T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞和促炎細(xì)胞因子等與免疫反應(yīng)有關(guān),其共同作用是牙周炎病原菌的免疫屏障[2]。其中,輔助性T細(xì)胞17(T Helper cells 17,Th17)與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells,Treg)的比例在正常機(jī)體內(nèi)處于動態(tài)平衡,二者失去平衡由一方主導(dǎo)時可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。在CP發(fā)生發(fā)展過程中,Th17細(xì)胞及其關(guān)鍵細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-17(IL-17)和白細(xì)胞介素-23(IL-23)起著關(guān)鍵作用[3],也有學(xué)者指出,隨著CP病情的加重,Th17/Treg細(xì)胞比例依次升高,其可能是CP患者病情評估重要指標(biāo)[4-5]。維甲酸受體相關(guān)孤兒受體A(RAR-related orphan receptor A,RORA)是一種核受體,在調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫方面發(fā)揮重要作用,并且RORA水平與Treg細(xì)胞有關(guān)[6]。研究發(fā)現(xiàn),長鏈非編碼RNA TUG1通過調(diào)節(jié)miR-498/RORA通路參與LPS誘導(dǎo)的牙周炎[7]。研究發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比,牙周炎組織中的RORA mRNA和蛋白水平顯著下調(diào)[8],這提示RORA可能參與牙周炎的發(fā)生發(fā)展。然而,RORA在CP中發(fā)揮何種作用目前仍未可知。免疫系統(tǒng)失衡是CP發(fā)生的重要影響因素,因此,本研究通過檢測CP患者血清RORA水平,分析RORA與Th17/Treg細(xì)胞平衡的關(guān)系,以期為CP的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月—2021年12月于本院進(jìn)行檢查并接受治療的90例CP患者作為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn):①符合CP診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。②患者及親屬了解本研究并簽署知情同意書。③首次確診并在我院接受治療。④至少具有10顆天然牙。排除標(biāo)準(zhǔn):①精神狀態(tài)異常,無法正常交流。②在6個月內(nèi)曾服用抗菌藥物。③有吸煙史。④患有免疫相關(guān)的疾病。⑤臨床信息不完整。另選擇同期在本院檢查的牙周健康志愿者100例作為對照組。本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批(批號:201812-0126)。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集 收集兩組患者一般資料,包括年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)(BMI)及并發(fā)高血壓、冠心病、糖尿病情況。

1.2.2 血清RORA表達(dá)水平的檢測 采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測CP患者及健康體檢者血清中RORA的相對表達(dá)水平。采用Trizol試劑(美國Ambion公司)從血清樣本中提取總RNA,測定其濃度和純度,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)操作步驟逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,采用SLAN-96S型qRT-PCR儀(致善生物科技有限公司)進(jìn)行檢測。其中qRT-PCR反應(yīng)體系共20 μL:cDNA(50 ng/μL)2 μL,2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)10 μL,PCR上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,加ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃,30 s;95 ℃,5 s;60 ℃,30 s,共40個循環(huán)。使用2-ΔΔCt方法(Ct為循環(huán)閾值)計算目的基因RORA的相對表達(dá)量。RORA正向引物:5′‐CTGACGCCCACCTACAACAT-3′,反向引物:5′-GCCTGATGCTGGTGTGTAGT-3′;內(nèi)參GAPDH正向引物:5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,反向引物:5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。引物均由上海生物工程有限公司合成。

1.2.3 Th17、Treg細(xì)胞水平的檢測 采集CP患者治療前及健康體檢者的晨起空腹靜脈血2 mL,加入抗凝劑,3 000 r/min,離心20 min,分離外周血單個核細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。取兩管加入FITC-鼠抗人CD4抗體,然后分別在兩試管中加入抗人IL-17A抗體、抗人Foxp3抗體以區(qū)分Th17、Treg細(xì)胞,按照說明書進(jìn)行操作,使用流式細(xì)胞儀(美國BD FACSCantoII)檢測Th17、Treg細(xì)胞水平。FITC-鼠抗人CD4抗體(貨號:9522-02)購自廈門慧嘉生物科技有限公司,抗人IL-17A抗體(貨號:102-P46)購自北京阿斯雷爾生物技術(shù)有限公司,抗人Foxp3抗體[貨號:Rab(P)13266]購自上海圻明生物科技有限公司。

1.2.4 細(xì)胞因子IL-10、IL-17、IL-23及轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)水平的檢測 采集CP患者治療前及健康體檢者的晨起空腹靜脈血2 mL,室溫靜置10～20 min后,3 000 r/min,離心20 min,將上清置于無菌EP管中,用于細(xì)胞因子IL-10、IL-17、IL-23及TGF-β水平的檢測。按照酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒說明書進(jìn)行操作,利用多功能酶標(biāo)儀(Thermo公司)測定各樣本在450 nm處的吸光度值,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線計算各組細(xì)胞因子的水平。人IL-10(貨號:ml064299)、人IL-17(貨號:ml058051)、人IL-23(貨號:ml058067)、TGF-β(貨號:ml064258)試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 觀察組:男50例,女40例;年齡22～78歲,平均(46.29±5.47)歲;BMI 20～25 kg/m2,平均(22.53±2.41)kg/m2。對照組:男46例,女54例;年齡20～70歲,平均(47.15±5.85)歲;BMI 19～25 kg/m2,平均(22.06±2.32)kg/m2。兩組年齡、性別、BMI及合并高血壓、冠心病、糖尿病等一般資料比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組血清RORA、Th17、Treg及Th17/Treg水平的比較 觀察組患者血清中Th17水平明顯高于對照組,RORA、Treg水平低于對照組(P<0.05),且Th17/Treg細(xì)胞比例高于對照組(P<0.05)。見表2、圖1。

圖1 兩組血清RORA、Th17、Treg及Th17/Treg水平的比較

表2 兩組血清RORA、Th17、Treg及Th17/Treg水平的比較

2.3 兩組相關(guān)細(xì)胞因子水平的比較 觀察組TGF-β、IL-10水平低于對照組(P<0.05),而IL-17、IL-23水平高于對照組(P<0.05)。見表3、圖2。

圖2 兩組相關(guān)細(xì)胞因子水平的比較

表3 兩組相關(guān)細(xì)胞因子水平的比較

2.4 CP患者血清RORA與TGF-β、IL-10、IL-17、IL-23、Th17/Treg的相關(guān)性分析 Pearson法分析結(jié)果顯示,CP患者血清中RORA與TGF-β、IL-10呈正相關(guān)(P<0.05),與IL-17、IL-23及Th17/Treg細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表4、圖3。

圖3 CP患者血清RORA與TGF-β、IL-10、IL-17、IL-23、Th17/Treg的相關(guān)性

表4 CP患者血清RORA與TGF-β、IL-10、IL-17、IL-23、Th17/Treg的相關(guān)性

2.5 多因素分析CP發(fā)生的影響因素 以是否發(fā)生CP為因變量(賦值1=發(fā)生,0=未發(fā)生),以RORA、TGF-β、IL-10、IL-17、IL-23、Th17/Treg為自變量,進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。結(jié)果顯示,RORA、TGF-β、IL-10、IL-17、IL-23及Th17/Treg是CP發(fā)生的影響因素(P<0.05)。見表5。

表5 Logistic回歸分析CP發(fā)生的影響因素

3 討論

CP口腔感染是由牙齒表面微生物群的失調(diào)和宿主失調(diào)的炎癥反應(yīng)共同介導(dǎo),可導(dǎo)致牙周膜和牙槽骨的進(jìn)行性破壞,并伴有囊袋形成、退縮或兩者兼而有之[10-11]。CP還可能增加患惡性腫瘤的風(fēng)險,嚴(yán)重影響到患者的生命安全[12]?？谇唤】悼梢杂绊懙絺€人的生活質(zhì)量。因此,闡明影響CP進(jìn)展的分子機(jī)制尤為重要。免疫細(xì)胞在CP疾病中的功能是近年來研究的熱點。兩個CD4+輔助性T細(xì)胞亞群Th17和Treg之間的不平衡被證明在CP的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[13]。并且,研究發(fā)現(xiàn)RORA參與CP的發(fā)生發(fā)展[14]?；诖?本研究重點關(guān)注CP患者血清中RORA的表達(dá)水平與Th17/Treg細(xì)胞平衡的相關(guān)性,探尋CP在早期篩查中的潛在標(biāo)志物。

RORA屬于核激素受體超家族,作為一種廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子可參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)和類固醇代謝、免疫反應(yīng)和晝夜節(jié)律等[15]。鄭雪晴等[16]研究發(fā)現(xiàn),RORA在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中低表達(dá),過表達(dá)RORA可抑制裸鼠移植瘤的生長速度及腫瘤體積。RORA在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中低表達(dá),RORA高表達(dá)患者生存率高[17]。由此可見,RORA作為腫瘤抑制基因在癌癥中發(fā)揮作用。本研究首先對CP患者與健康體檢者的一般臨床資料進(jìn)行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩組研究對象的年齡、性別、BMI及并發(fā)高血壓、冠心病、糖尿病等指標(biāo)均無統(tǒng)計學(xué)差異,證明臨床數(shù)據(jù)具有可比性。Wang等[18]研究發(fā)現(xiàn),與正常人群相比,牙周炎患者RORA表達(dá)明顯下調(diào),本研究結(jié)果與其一致,這提示RORA可能參與CP的病理過程,RORA可能是CP患者潛在的血清學(xué)標(biāo)志物。

CD4+輔助性T細(xì)胞在激活后分化為調(diào)節(jié)性和效應(yīng)性T細(xì)胞亞群,即Th1、Th2、Th17、濾泡輔助性T細(xì)胞和Tregs細(xì)胞。其中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞因在機(jī)體內(nèi)履行不同的功能而被廣泛關(guān)注。Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-17、IL-22和IL-23等促炎因子,募集中性粒細(xì)胞,并促進(jìn)感染部位的炎癥,Treg細(xì)胞產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子IL-10和TGF-β,抑制多種免疫細(xì)胞的活性,從而抑制免疫反應(yīng)[19-20]。Liu等[21]研究發(fā)現(xiàn),腸道黏膜中Th17/Treg比例失衡可增加結(jié)腸炎癥發(fā)生的風(fēng)險。司秀影等[22]研究發(fā)現(xiàn),Th17/Treg細(xì)胞失衡可影響哮喘的發(fā)生發(fā)展。Th17/Treg細(xì)胞在多種疾病中發(fā)揮重要的免疫作用。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn),牙周炎患者血清和牙齦組織中Th17細(xì)胞的數(shù)量比Treg細(xì)胞增加的更顯著,Th17/Treg細(xì)胞比例發(fā)生失衡[23]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,觀察組Th17水平升高,Treg水平降低,Th17/Treg細(xì)胞比例增加(P<0.05)。這提示CP患者體內(nèi)存在Th17/Treg細(xì)胞比例失衡的現(xiàn)象,Th17/Treg失衡是向Th17轉(zhuǎn)化,使Th17表達(dá)更有優(yōu)勢。于淑琪等[24]研究發(fā)現(xiàn),CP患者Th17/Treg細(xì)胞比例高于健康對照組,這提示Th17/Treg失衡可能影響CP發(fā)生發(fā)展,本研究結(jié)果與其相符,值得進(jìn)一步探索。

IL-10和IL-17是調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡的關(guān)鍵細(xì)胞因子,正常情況下,Th17、Treg細(xì)胞比例在機(jī)體內(nèi)處于動態(tài)平衡,若Th17/Treg細(xì)胞的平衡狀態(tài)被打破,偏向于其中一方時,將導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)及免疫功能發(fā)生異常[25]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,觀察組TGF-β、IL-10水平明顯降低,而IL-17、IL-23水平明顯升高,這進(jìn)一步證明CP病理過程與Th17/Treg細(xì)胞比例有關(guān),提示CP的發(fā)生發(fā)展與炎癥反應(yīng)及免疫功能異常有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),IL-35可以通過RORα和RORγ t可直接抑制IL-23的表達(dá),從而抑制牙周炎等炎癥性疾病中的過度免疫反應(yīng)[11]。上述實驗結(jié)果表明RORA、Th17/Treg細(xì)胞均可參與CP的發(fā)生發(fā)展,那么RORA能否通過調(diào)控Th17/Treg細(xì)胞的水平從而影響CP的進(jìn)程呢?本研究結(jié)果顯示,CP患者血清中RORA與TGF-β、IL-10呈正相關(guān),與IL-17、IL-23及Th17/Treg細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān),這提示RORA可能通過影響Th17/Treg細(xì)胞失衡、TGF-β、IL-10水平下調(diào)及IL-17、IL-23水平上調(diào),來促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生,進(jìn)而促進(jìn)CP的發(fā)生。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),RORA、TGF-β、IL-10、IL-17、IL-23及Th17/Treg是CP發(fā)生的影響因素。這提示RORA水平降低和Th17/Treg細(xì)胞比例的失衡可加大CP發(fā)生的風(fēng)險,RORA可能通過調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞比例影響CP的進(jìn)程。并且,該結(jié)果提示RORA、IL-10、IL-17、IL-23及TGF-β可能是CP早期篩查的潛在指標(biāo)。

4 結(jié)論

CP患者血清中RORA低表達(dá),Th17/Treg細(xì)胞比例失衡,RORA的表達(dá)與Th17/Treg細(xì)胞比例之間呈負(fù)相關(guān),RORA可能通過影響Th17/Treg細(xì)胞平衡,促進(jìn)炎癥反應(yīng)和CP疾病的發(fā)生。但二者具體影響機(jī)制還需進(jìn)行大量實驗予以驗證。