金諭青

探尋炫彩世界的神秘鑰匙

骨骼是身體的支撐系統(tǒng)，不僅為動物提供結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和運(yùn)動功能，還保護(hù)著內(nèi)部脆弱的臟器，如心臟、肺臟和大腦。通過胚胎骨骼透明染色實(shí)驗(yàn)，我們可以賦予軟骨鮮艷的藍(lán)色，而讓硬骨呈現(xiàn)深邃的紅色。這種技術(shù)可以在不損毀肌肉組織的情況下清晰地呈現(xiàn)軟骨和硬骨的胚胎發(fā)育過程。那么，動物肌肉到底是如何變得透明的？骨骼又是如何“穿上”光鮮的衣裳公之于眾的？

動物肌肉的透明程度與折射率的匹配度息息相關(guān)。當(dāng)肌肉組織的折射率與介質(zhì)（如甘油）相近時(shí)，光線通過組織時(shí)的散射和折射程度會降低，更容易透過組織，使組織變得透明。氫氧化鉀作為一種堿性溶液，可以降解一些不利于光線穿透的生物成分，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和血紅素，從而減少組織內(nèi)的散射源，提高透明度。此外，氫氧化鉀還能與細(xì)胞膜中的磷脂發(fā)生反應(yīng)，引發(fā)皂化作用。這個(gè)過程會破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)溶解到溶液中，進(jìn)一步增加透明度。

軟骨和硬骨能夠呈現(xiàn)不同的顏色，歸根結(jié)底是與異性相吸有關(guān)。阿利新藍(lán)是一種陽離子染料，軟骨細(xì)胞內(nèi)富含的糖胺聚糖，如硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸等這些帶負(fù)電的酸性物質(zhì)成分正好與帶正電的阿利新藍(lán)染料結(jié)合，將軟骨染成藍(lán)色；而屬于陰離子染料的茜素紅在溶液pH值為12左右時(shí)，又可以與硬骨中大量存在的鈣離子“碰撞出”深紅色化合物，使得硬骨呈紅色。

用鑰匙開啟新世界的大門

為了運(yùn)用染色技術(shù)觀察雞胚的骨骼發(fā)育，我們于2023年7月購買了紅瑤雞的種蛋，并進(jìn)行了孵化。在實(shí)驗(yàn)前，我們可以提前配制相關(guān)試劑，例如預(yù)透明液、脫色劑等。

實(shí)驗(yàn)過程大致分為10個(gè)步驟：固定、去皮、軟骨染色、脫水、復(fù)水、預(yù)透明、硬骨染色、脫色、再透明、保存。首先將胚胎從蛋殼中剝離，清洗干凈后放入75%酒精溶液密封浸泡2～5天，保持組織完整，并脫去部分水分。在固定期間，我們需擇日對長有表皮和毛發(fā)的胚胎做去皮處理，以免影響染料的滲透。這里將一個(gè)去皮小技巧分享給大家：在腹部稍下的位置輕輕地提起表皮，用手術(shù)刀劃開一處小口，分別向前、向后撕去表皮，雙翼部分及爪部應(yīng)小心處理。

固定期結(jié)束后，將標(biāo)本放入阿利新藍(lán)染劑中浸泡。具體浸泡時(shí)間應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的體形大小適當(dāng)調(diào)整，當(dāng)觀察到軟骨表層呈藍(lán)色就代表染色成功了。染色完畢后，脫水和復(fù)水處理緊隨其后。可能有人在此會產(chǎn)生疑惑，為什么剛在無水酒精中脫完水的標(biāo)本又要降梯度復(fù)水呢，豈不是多此一舉？其實(shí)，復(fù)水處理是為了讓標(biāo)本處于一個(gè)中性的環(huán)境，并脫去標(biāo)本表面殘余的酒精溶液，為后續(xù)進(jìn)入堿性的預(yù)透明環(huán)節(jié)作鋪墊。千萬注意，不能為了省事就將標(biāo)本直接從無水酒精轉(zhuǎn)入蒸餾水中，這樣會使原本緊致的肌肉遇水突然膨大而暴裂。

接下來的預(yù)透明環(huán)節(jié)極為重要，踏入透明世界的第一步就在這一環(huán)節(jié)，然而這也是極易“翻車”的步驟。只有利用預(yù)透明液將胚胎的肌肉組織透明化，骨骼才能嶄露頭角。在此環(huán)節(jié)中，我們需要對雞胚保持時(shí)刻關(guān)注，透明時(shí)間太長會出現(xiàn)標(biāo)本“散架”的情況。我們應(yīng)該至少每隔2小時(shí)觀察一下胚胎的透明情況，直至肌肉透明呈果膠狀。在移動標(biāo)本的時(shí)候需格外小心，因?yàn)榇藭r(shí)的標(biāo)本已經(jīng)變得非常柔軟脆弱。

預(yù)透明后的硬骨染色也是至關(guān)重要的一步，染色時(shí)間太短會導(dǎo)致染色不均的后果，而時(shí)間太長，又會造成不可逆的過度染色的情況。所以，染色過程也要隨時(shí)觀察，避免時(shí)間過長，影響肌肉脫色和整體透明效果。在染色時(shí)，肌肉等軟組織也會被染上顏色，這時(shí)候我們需略施小計(jì)，使用脫色劑將軟組織上的顏色脫掉，讓骨骼大放異彩。但是，在肌肉脫色的過程中，染色的骨骼也可能會被脫去顏色，所以我們?nèi)孕桦S時(shí)觀察脫色情況，在骨骼未褪色之前結(jié)束此步驟。

實(shí)驗(yàn)的最后就是使用甘油與低濃度氫氧化鉀的混合液進(jìn)行升梯度再透明，待骨骼完全顯現(xiàn)，即可裝瓶欣賞和研究。

揭開炫彩世界的神秘面紗

通過觀察不同發(fā)育時(shí)期的胚胎染色標(biāo)本，硬骨和軟骨能夠快速地被肉眼識別，其大小、形狀、發(fā)育規(guī)模和趨向統(tǒng)統(tǒng)一覽無余。如果有幸捕捉到骨骼發(fā)育的起點(diǎn)，我們還可以依據(jù)骨骼早期著染的顏色來判斷其骨骼的發(fā)育方式。

本實(shí)驗(yàn)有幸“邀請”到了一位幸運(yùn)觀眾——雞的趾骨。趾骨的發(fā)育方式是軟骨成骨。什么是軟骨成骨？顧名思義，就是在骨骼發(fā)育過程中，先形成軟骨，然后軟骨組織被硬骨取代，完成骨骼的發(fā)育。這些骨骼首先會被染成藍(lán)色，隨著胚胎發(fā)育的進(jìn)展，可以清晰地看到紅色逐漸取代了藍(lán)色，這也就是軟骨骨化的過程。

在第六天的胚胎中，雞胚2～4趾露出雛形，而1趾還“躲”在皮膚里，尚未出現(xiàn)。在第八天的標(biāo)本中，所有腳趾以通體藍(lán)色的形態(tài)出現(xiàn)并開始分節(jié)，這就印證了趾骨發(fā)育的軟骨成骨方式。在第十四天的標(biāo)本中，我們可以觀察到近端的趾節(jié)開始率先變紅，這讓我們意外地發(fā)現(xiàn)趾骨的第一骨化中心在趾的近端（接近腳掌的一端），而非遠(yuǎn)端。在第十八天的標(biāo)本中，四趾基本骨化完全，只有骨節(jié)連接處保留藍(lán)色的軟骨。因?yàn)樾‰u還在逐漸長大，所以軟骨會一直在骨骼的兩端不斷生長。

與軟骨成骨相對的還有一種成骨方式——膜內(nèi)成骨。通過這種方式發(fā)育的骨骼通常不經(jīng)過軟骨階段，直接由結(jié)締組織發(fā)育成硬骨。雞的顱蓋骨、面顱骨和叉骨多以膜內(nèi)成骨方式發(fā)育。

在觀察第十四天和第二十一天的雞胚時(shí)，我們的目光被牢牢地“吸附”于四片紅彤彤的區(qū)域，這是雞顱蓋骨中的額骨和頂骨部分。遺憾的是，我們未能捕捉到額骨和頂骨的發(fā)育起點(diǎn)，使得兩骨的發(fā)生方式無法被討論。幸運(yùn)的是，我們能夠依據(jù)額骨、頂骨的長勢推斷其愈合方向。在出殼期之后的一段時(shí)間，四塊骨骼會逐漸向中間靠攏，形成一個(gè)完整的“紅帽子”扣在雞的頭頂。

大多數(shù)的骨塊在胚胎出殼前基本骨化完全，而額骨卻硬是拉長了發(fā)育這條“戰(zhàn)線”，這或與它的雙重發(fā)育起源及尺寸較大有關(guān)。

雞顱骨的各塊骨骼通常是由神經(jīng)嵴和中胚層分別主導(dǎo)發(fā)育形成的，這兩者之間通常會發(fā)育一層界面，防止干擾彼此工作，而恰巧有一界面存在于眶上骨和額骨的交界處，這使得額骨下界的發(fā)育受到神經(jīng)嵴細(xì)胞和中胚層細(xì)胞的雙重影響，變得遲緩。這也就能解釋為什么發(fā)育到孵化期三分之二的額骨仍然表現(xiàn)為一條細(xì)縫狀紅線。

繼續(xù)探索遼闊的透明世界

值得一提的是，在實(shí)驗(yàn)過程中總會遇到復(fù)雜多變的狀況。其一，預(yù)透明的時(shí)間非常難掌握，唯一的解決辦法就是勤觀察、多試錯(cuò)。其二，硬骨和軟骨染色不均勻是實(shí)驗(yàn)中遇到的一個(gè)大問題。硬骨染色不均尚可以通過直接復(fù)染進(jìn)行解決，而軟骨染色不均就沒有那么輕松了。

令人遺憾的是，因本次實(shí)驗(yàn)取樣不全，未能記錄到胚胎中各個(gè)骨骼的確切骨化過程，但“不滿是向上的車輪，能夠載著不自滿的人前進(jìn)”，這些遺憾是我們在這光彩奪目的透明世界繼續(xù)探索下去的動力。

作者單位|沈陽師范大學(xué)古生物學(xué)院