基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討扶正化纖方治療特發(fā)性肺纖維化的機(jī)制

魏祎，葉海燕，趙國靜，宋歡，孫英，周佩夏，王坤，胡海波，陸學(xué)超

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種慢性、進(jìn)行性和不可逆的呼吸系統(tǒng)疾病，其特征是以肺泡上皮細(xì)胞損傷、成纖維細(xì)胞活化和膠原纖維大量沉積為特征的進(jìn)行性肺部疾?。?-2］。IPF 死亡率較高，臨床研究發(fā)現(xiàn)，其平均生存率為3～5 年［3］。吡非尼酮和尼達(dá)尼布是目前市場上僅有的2 種被批準(zhǔn)用于治療IPF 的藥物［4-5］。然而吡非尼酮和尼達(dá)尼布不能延長患者的生存期，并且存在耐受性、不良反應(yīng)等問題，因此迫切需要開發(fā)安全、有效的治療藥物。中醫(yī)由于其獨(dú)特的理論和悠久的實(shí)踐歷史，在世界范圍內(nèi)逐漸受到廣泛關(guān)注。與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)不同，中醫(yī)理論更注重的是辨證論治和整體論治。扶正化纖方由補(bǔ)骨脂、冬瓜子、茯苓、甘草、紅景天、黃芪、款冬花、麥冬、三七、山茱萸、太子參、五味子、杏仁、薏苡仁及地龍組成，是全國名老中醫(yī)周兆山教授提出的用于治療IPF 的驗(yàn)方。根據(jù)本課題組前期隨機(jī)、雙盲實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，該方劑治療IPF 有較好的臨床療效［6］。本課題組前期的動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，扶正化纖方可以減輕博來霉素誘導(dǎo)的IPF 小鼠模型肺組織炎癥和膠原沉積［7］。

隨著系統(tǒng)生物學(xué)研究領(lǐng)域的發(fā)展，“一個靶點(diǎn)、一種藥物”的傳統(tǒng)模式逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)椤熬W(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)、多組分療法”模式。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)和網(wǎng)絡(luò)信息學(xué)相結(jié)合的綜合性學(xué)科，可用于在系統(tǒng)層面上分析多組分藥物對人體的影響，這有助于研究者找到藥物有效活性成分的治療靶點(diǎn)，提高藥物的療效，減少不良反應(yīng)［8］。同時，中醫(yī)整體觀的指導(dǎo)思想、方劑配伍的整體協(xié)同機(jī)制與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)倡導(dǎo)的藥物研發(fā)模式相契合。分子對接是一種廣泛應(yīng)用于藥物發(fā)現(xiàn)的基于計(jì)算機(jī)結(jié)構(gòu)的方法，重點(diǎn)是對分子間相互作用開展研究分析，并對其中存在的親和力及結(jié)合模式加以預(yù)測［9］。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，探索扶正化纖方抗IPF 的分子機(jī)制，進(jìn)行分子對接以驗(yàn)證活性化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的親和力，探索扶正化纖方治療IPF 的潛力。

1 方法

1.1 藥物有效成分與靶點(diǎn)的篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）、HERB 數(shù)據(jù)庫（herb.ac.cn）檢索補(bǔ)骨脂、冬瓜子、茯苓、甘草、紅景天、黃芪、款冬花、麥冬、三七、山茱萸、太子參、五味子、杏仁、薏苡仁及地龍的成分。根據(jù)參考文獻(xiàn)，將篩選條件設(shè)定為口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%，類藥性（drug-likeness， DL）≥0.18［10］。并通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫尋找藥物活性成分的對應(yīng)靶點(diǎn)，TCMSP 數(shù)據(jù)庫中未收錄的藥物通過HERB 數(shù)據(jù)庫，查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料［11］補(bǔ)充檢索，獲取活性成分。通過PubChem 數(shù)據(jù)庫、Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫補(bǔ)充藥物靶點(diǎn)。Uniport 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）用于靶點(diǎn)的校正，去掉非人類靶點(diǎn)，一共獲得333 個靶點(diǎn)。

1.2 “特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化”疾病靶點(diǎn)的搜集 以“idiopathic pulmonary fibrosis”為關(guān)鍵詞，在Gene-Cards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）中進(jìn)行人類基因檢索，并刪除Score 值為0 的靶點(diǎn)。

1.3 交集靶點(diǎn)韋恩圖及蛋白相互作用（protein-protein interaction， PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用R 語言4.1.3 軟件Venn 包篩選出藥物活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)與疾病的共有靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖。二者的交集靶點(diǎn)輸入String 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/cgi/input.pl）構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果文件輸入Cytoscape軟件進(jìn)行可視化分析，根據(jù)Degree 值尋找核心靶點(diǎn)。同時利用Cytoscape 軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 基因本體（gene ontology， GO）富集分析與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）富集分析 通過R 語言4.1.3軟件將藥物疾病共有靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，安裝并引用gglpot2包，分別進(jìn)行圖形繪制。

1.5 分子對接實(shí)驗(yàn) 根據(jù)藥物活性成分的CAS 號從數(shù)據(jù)庫中下載活性成分的3D 結(jié)構(gòu)。從PDB（http：//www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫下載關(guān)鍵蛋白。采用AutoDock Vina 1.1.2 進(jìn)行對接。

2 結(jié)果

2.1 扶正化纖方中藥物的有效活性成分與作用靶點(diǎn) 經(jīng)匯總刪重后，本研究篩選得到扶正化纖方中具有潛在作用的有效化學(xué)成分共174 個，根據(jù)Degree 值排名，排名前20 的活性成分見表1。扶正化纖方中藥物的作用靶點(diǎn)有333 個。

表1 關(guān)鍵成分信息表

2.2 扶正化纖方作用靶點(diǎn)與IPF 的交集靶點(diǎn)篩選 篩選得到的扶正化纖方333 個靶點(diǎn)與IPF 疾病相關(guān)的3 509 個靶點(diǎn)，利用R 語言Venn 包尋找交集靶點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者共有234 個靶點(diǎn)，可作為藥物作用于疾病的預(yù)測靶點(diǎn)進(jìn)行之后的通路富集分析。見圖1。

圖1 扶正化纖方-特發(fā)性肺纖維化交集靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 扶正化纖方-IPF 交集靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過String 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)中有234 個節(jié)點(diǎn)，4 292 條邊，平均Degree 值為15.5；再將String 網(wǎng)站導(dǎo)出的PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件，繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。此外，本研究還構(gòu)建了“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，可以更加直觀地觀察藥物活性成分與疾病靶點(diǎn)之間的作用關(guān)系，見圖3。

圖2 Cytoscape 軟件繪制得到的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（節(jié)點(diǎn)顏色和大小根據(jù)Degree 值調(diào)整）

圖3 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 扶正化纖方治療IPF 的GO 功能富集分析以及KEGG 通路分析

2.4 扶正化纖方-IPF 交集靶點(diǎn)的拓?fù)浞治?通過CytoNCA 工具進(jìn)行拓?fù)浞治?，共篩選得到84 個關(guān)鍵靶點(diǎn)，排名前20 位的靶點(diǎn)見表2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（serine/threonine kinase 1，AKT1）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor， TNF）、腫瘤蛋白P53（tumor protein 53， TP53）、血管內(nèi)皮生長因子A （vascular endothelial growth factor A， VEGFA）等可能是扶正化纖方治療IPF 的潛在核心靶點(diǎn)。

表2 排名前20 位扶正化纖方-IPF 交集核心靶點(diǎn)的拓?fù)浞治?/p>

2.5 GO 功能與KEGG 通路富集分析 進(jìn)一步分析扶正化纖方治療IPF 的信號通路，其中GO 功能總共富集到2 669 條生物過程，225 項(xiàng)分子功能相關(guān)，95 項(xiàng)細(xì)胞組成相關(guān)。KEGG 通路總共富集到178 條信號通路。KEGG 通路富集分析表明扶正化纖方治療IPF 主要涉及晚期糖基化終產(chǎn)物受體（advanced glycation end product-receptor for advanced glycation end-product， AGE-RAGE）信號通路、磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B （phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B， PI3K/AKT）信號通路、白細(xì)胞介素（interleukin， IL）-17 信號通路。見表2。

2.6 分子對接結(jié)果 將表1 中Degree 值排名前6位的活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)VEGFA、TP53、STAT3、CASP3、AKT1、TNF 進(jìn)行分子對接和結(jié)合能力預(yù)測。結(jié)合能越小，表明受體與配體蛋白之間的親和力越大，見圖5。其中槲皮素（MOL000098）和TNF 結(jié)合能最小、β-谷固醇（MOL000358）和TNF 結(jié)合能為其次，進(jìn)行可視化處理。見圖6～7。

圖5 活性成分-靶點(diǎn)結(jié)合能熱圖

圖7 β-谷固醇（MOL000358）和TNF 蛋白的結(jié)合能為-9.0 kcal/mol

3 討論

IPF 的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，炎癥、氧化應(yīng)激、自噬不足等是其重要發(fā)病機(jī)制之一。根據(jù)其病因、癥狀，可以將其歸于中醫(yī)學(xué)“肺痿”“肺痹”的范疇?；诙嗄昱R床經(jīng)驗(yàn)，周兆山教授自擬扶正化纖方，全方共15 味藥，方中黃芪補(bǔ)益肺氣，太子參、麥冬、五味子三藥合用，兼具補(bǔ)、潤、斂之效，上述四藥合用，大補(bǔ)肺之氣陰；山茱萸、補(bǔ)骨脂收澀固脫，二藥合用補(bǔ)助腎氣以治其本；薏苡仁、茯苓、冬瓜子淡滲利濕，行水消腫；三七、紅景天活血補(bǔ)血，調(diào)暢肺之氣血；地龍通達(dá)肺絡(luò)。該方已經(jīng)在臨床上用于IPF 的治療，且取得良好的臨床療效［6］。

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示，扶正化纖方作用于IPF 的主要活性成分有槲皮素、木犀草素、山柰酚、甘草查爾酮A 等。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)槲皮素可以減少肺組織膠原蛋白的沉積，降低肺纖維化模型大鼠肺泡灌洗液中促纖維化介質(zhì)的濃度，如IL-13、TNF等［12-13］。富含膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM）的異常沉積是IPF 的一個重要病理特征。據(jù)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素通過降低I 型膠原蛋白（collagen Ⅰ）、平滑肌肌動蛋白、鈣黏蛋白E（Ecadherin）的表達(dá)，從而抑制ECM 重塑［14］。此外，有研究報(bào)道，木犀草素可以通過調(diào)控NLRP3/IL-1β/TGF-β1 信號軸，從抗炎、抗膠原沉積2 個方面共同發(fā)揮緩解IPF 的作用［15］。山柰酚可通過抑制mTOR信號通路，下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMPs）家族中MMP-9 和MMP-2 的表達(dá)，發(fā)揮緩解ECM 過度沉積的作用［16］。甘草查爾酮A具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、免疫促進(jìn)等多種生物活性。動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，甘草查爾酮A 可以通過抑制TGF-β1/Smad 信號通路阻止成纖維細(xì)胞活化，下調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)如collagen I 等表達(dá)［17］，還可以調(diào)控ERK1/2/NF-κB 信號通路緩解肺組織炎癥反應(yīng)［18］。

本研究預(yù)測AKT1、TNF、TP53、VEGFA 等可能是扶正化纖方治療IPF 的潛在核心靶點(diǎn)。AKT1 既可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 的活性，減少炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，又可以調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)的下游產(chǎn)物的活性，例如環(huán)氧合酶2。此外，AKT1 與TGF-β1 的激活密切相關(guān)。TNF-α則是典型的炎癥因子。在肺纖維化患者的肺組織中可以檢測到TP53 的高表達(dá)。研究表明，TP53 可以影響肺上皮細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition， EMT）過程，促進(jìn)肺纖維化的發(fā)展［19］。VEGFA 在促進(jìn)血管生成方面起著至關(guān)重要的作用，并已經(jīng)被證明可以刺激成纖維細(xì)胞增殖、遷移和激活［20］。

KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)扶正化纖方的活性成分主要通過AGE-RAGE 信號通路、PI3K/AKT 信號通路、IL-17 信號通路等干預(yù)IPF。根據(jù)臨床研究發(fā)現(xiàn)，IPF 患者存在AGE/RAGE 失衡，AGE 水平升高，RAGE 表達(dá)降低，AGE/RAGE 過度升高可導(dǎo)致纖維化進(jìn)展加快和肺功能持續(xù)下降。AGE/RAGE 信號通路的激活也可介導(dǎo)EMT，進(jìn)一步導(dǎo)致纖維化［21］。PI3K/AKT 信號通路也在IPF 發(fā)展過程中起著重要作用。越來越多的證據(jù)表明，TGF-β1 的過度表達(dá)與PI3K/AKT 信號通路激活密切相關(guān)，二者的相互作用促進(jìn)了肺纖維化形成［22］。IL-17 由輔助T 細(xì)胞17（T helper cell 17， Th17）特異性分泌，參與多種慢性炎癥疾病和自身免疫性疾?。?3］。根據(jù)前期動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，IPF 小鼠模型中IL-17A 表達(dá)升高，IL-17A相關(guān)的信號通路被激活［7］，應(yīng)用IL-17A 拮抗劑可以抑制IPF 小鼠肺組織的慢性炎癥和纖維化進(jìn)程［24］。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對扶正化纖方治療IPF的作用機(jī)制進(jìn)行了全面、系統(tǒng)的分析，發(fā)現(xiàn)扶正化纖方具有復(fù)雜的活性成分，并可以通過多靶點(diǎn)、多系統(tǒng)、多通路發(fā)揮對IPF 的治療作用，為治療IPF 的新藥研發(fā)提供了一定的科學(xué)依據(jù)。