劉 強,牛小霞,方 敏,劉艷玲,高 輝,陳吉祥,加華才讓,張思濃*,李 勇*

(1.寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室,銀川 750021;2.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,銀川 750021;3.甘肅省甘南州合作市佐蓋曼瑪鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站,甘南 747000)

牛冠狀病毒(bovine coronavirus,BCoV)于1973年[1]首次在美國的牛場中發(fā)現(xiàn),隨后在五大洲流行,呈世界范圍內(nèi)廣泛分布。BCoV是新生犢牛腹瀉、成年牛冬季痢疾和牛呼吸道疾病的重要病原體之一。病毒的感染會導(dǎo)致牛出血性腹瀉、產(chǎn)奶量減少甚至死亡,給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。BCoV的刺突(spike,S)蛋白是誘導(dǎo)中和抗體的主要結(jié)構(gòu)蛋白,產(chǎn)生的中和抗體能夠阻斷病毒附著和入侵,在抗病毒感染中有著重要作用。而對于目前流行的SARS-CoV-2,其通過S蛋白與細胞血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)受體結(jié)合感染宿主,S蛋白突變導(dǎo)致不同的新變異接連出現(xiàn),顯著影響著病毒的感染能力和致病性,如D614G[2]、N501Y[3]、S477N[4]等突變株,威脅著人類健康和公共安全。由于大多數(shù)冠狀病毒的S蛋白承擔(dān)病毒與宿主細胞膜受體結(jié)合及膜融合功能,是宿主中和抗體的重要作用位點以及疫苗設(shè)計的關(guān)鍵靶標,因此,詳細深入地了解S蛋白的基礎(chǔ)生物學(xué)信息,對研究BCoV的感染機制、病毒與宿主之間的相互作用及研制新型基因工程疫苗具有重要借鑒意義。

1 牛冠狀病毒概述

BCoV是一種肺腸病毒,屬于尼多病毒目、冠狀病毒科、β冠狀病毒屬2a亞群成員,與馬冠狀病毒、HCoV-OC43、犬呼吸道冠狀病毒屬于同一類病毒,研究表明它們在抗原性和基因遺傳性上密切相關(guān),這可能由于同一親本病毒在遺傳過程中發(fā)生種間傳播以及多種重組事件造成的宿主范圍變異[5]。BCoV基因組全長約31 kb,包括13個開放閱讀框(ORFs),ORFs相互重疊或被基因間序列分隔,其兩側(cè)為5′和3′非翻譯區(qū)域。ORF1a和ORF1b編碼多蛋白,這些多蛋白被進一步切割為成熟RNA聚合酶和其他非結(jié)構(gòu)蛋白。基因組編碼了5種主要結(jié)構(gòu)蛋白:血凝素酯酶蛋白(HE)、刺突蛋白(S)、小膜蛋白(M)、膜蛋白(E)和核衣殼蛋白(N),是病毒的基本組成粒子,其余的ORFs編碼未知或特征較少的非結(jié)構(gòu)蛋白(圖1)。和其他包膜病毒一樣,BCoV對洗滌劑和脂質(zhì)溶劑(如乙醚、氯仿)敏感,并能夠被常規(guī)消毒劑福爾馬林和熱滅活。一些抗生素如伊維菌素[6]、氯喹及其衍生物[7]也能抑制病毒的復(fù)制。

圖1 BCoV基因組及結(jié)構(gòu)示意圖(筆者團隊制作)Fig.1 BCoV genome and structure diagram(made by the writers group)

2 S蛋白的結(jié)構(gòu)特征

2.1 S蛋白的結(jié)構(gòu)

BCoV的S蛋白是一種由1 363個氨基酸編碼的高度糖基化I型膜蛋白,包括一個含13個氨基酸的N末端疏水信號序列和18個N-糖基化修飾位點以及靠近C末端的兩個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)[8],同時有穩(wěn)定的空間拓撲結(jié)構(gòu)的8個二硫鍵(圖2和圖3)。利用ProtScale對S蛋白的預(yù)測表明,整條多肽鏈中疏水性氨基酸殘基數(shù)量明顯居多(圖4),這些疏水性氨基酸構(gòu)成卷曲螺旋的疏水核心,對形成三聚體結(jié)構(gòu)起決定性作用[9]。DeepTMHMM 預(yù)測S蛋白有1個位于1 308～1 328aa的跨膜區(qū)(圖5),這可能對BCoV刺突三聚體錨定、穩(wěn)定和調(diào)控有著顯著影響[10]。SOPMA預(yù)測分析S蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要構(gòu)成原件為無規(guī)卷曲和延伸鏈,使抗原結(jié)構(gòu)更易呈現(xiàn)在蛋白表面,有利于與受體結(jié)合(圖6)。利用SWISS-MODEL軟件對S蛋白進行同源建模,序列一致性為91.69%,全局模型質(zhì)量估計為0.75。Ramachandran圖評價所建模型96.22%的氨基酸位于允許區(qū)域,得分為0.95,表明所建模型合理可靠(圖7)。S蛋白在位于氨基酸768和769之間被蛋白酶切割成兩個100 ku左右的片段,形成2個結(jié)構(gòu)和功能不同的S1、S2亞基。S1亞基在蛋白的N端,作為信號序列,通常顯示出低水平的序列同源性,其含有N端結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain,NTD)和C端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain,CTD),兩者都可以作為病毒受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域[11]。S1亞基與宿主細胞受體結(jié)合,能刺激中和抗體產(chǎn)生并負責(zé)血凝素活性,因此,該區(qū)域的突變可能影響蛋白抗原性和病毒致病性[12]。S2亞基位于蛋白的C端,序列高度保守,負責(zé)膜融合活性和將糖蛋白錨定到病毒包膜的跨膜結(jié)構(gòu)域。膜融合活性是由S2亞基內(nèi)的內(nèi)部疏水序列賦予[13]。因此,BCoV毒株中S2亞基內(nèi)的親水性氨基酸被取代會改變病毒的融合活性和感染能力。

圖2 S蛋白示意圖(筆者團隊制作)Fig.2 Schematic diagram of the S protein(made by the writers group)

圖3 S蛋白的翻譯后修飾和加工示意圖(UniProt)Fig.3 Schematic diagram of post-translational modification and processing of S protein(UniProt)

圖4 ProtScale預(yù)測S蛋白疏水性(筆者團隊制作)Fig.4 ProtScale predicts hydrophobicity of S protein(made by the writers group)

圖5 DeepTMHMM預(yù)測S蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)(筆者團隊制作)Fig.5 DeepTMHMM predicts the transmembrane structure of S protein(made by the writers group)

圖6 SOPMA預(yù)測S蛋白的二級結(jié)構(gòu)(筆者團隊制作)Fig.6 SOPMA predicted the secondary structure of S protein(made by the writers group)

S蛋白對于病毒感染和發(fā)病機制很重要,S1亞基結(jié)合靶細胞上的受體,而S2亞基促進病毒和宿主膜的融合,從而允許病毒基因組進入宿主中復(fù)制。這種對S蛋白獨特的水解切割增強了病毒感染能力,例如SARS-CoV中S蛋白存在呋喃裂解位點,被細胞內(nèi)的弗林蛋白酶裂解為S1和S2亞基,增強細胞間融合和病毒感染能力[14]。MERS-CoV中S蛋白的有效切割使得該病毒能夠從蝙蝠感染到人類,擴大了物種傳播范圍及增強了其對宿主的適應(yīng)性[15]。最近研究發(fā)現(xiàn)該位點的缺失減弱了SARS-CoV-2的致病性,誘導(dǎo)了中和抗體的產(chǎn)生從而賦予倉鼠保護性免疫力[16]。由此推斷,裂解位點中氨基酸的變化可能對細胞向性以及致病性產(chǎn)生顯著影響,基于此特性該位點有希望被選為一種潛在的治療靶點。

2.2 S蛋白的多態(tài)性區(qū)域

冠狀病毒作為目前已知基因組最大的RNA病毒組,以其低復(fù)制保真和高遺傳變異的特點成為快速進化的病毒組[17]。其中S蛋白是冠狀病毒研究最多的一種結(jié)構(gòu)蛋白,宿主范圍和組織向性的變化主要歸因于S蛋白的突變[12]。有關(guān)系統(tǒng)發(fā)育的研究表明,S1比S2亞基對遺傳變異性更敏感,且該研究觀察到BCoV的S1基因的452至593區(qū)域之間的氨基酸比其他區(qū)域更多變,被鑒定為多態(tài)性區(qū)域,故常被選為分子分析的靶標[18]。之前研究顯示,小鼠肝炎病毒和豬傳染性腸炎病毒的細胞受體結(jié)合區(qū)位于S蛋白的多態(tài)性區(qū)域[19-20],而BCoV的S蛋白與唾液酸結(jié)合感染宿主細胞,但尚未確定細胞受體結(jié)合區(qū)[21]。多態(tài)性區(qū)域在多數(shù)冠狀病毒中表現(xiàn)出高變異性,這可能與細胞受體結(jié)合區(qū)有關(guān)[17]。同時呼吸道和腸道BCoV分離株的序列差異表明,趨向性決定因素也可能出現(xiàn)在多態(tài)性區(qū)域[22]。

S1亞基這種可塑性可以在快速變化的環(huán)境中提供進化優(yōu)勢,允許其適應(yīng)不同的組織和宿主,逃避免疫反應(yīng),對該區(qū)域的分子分析有助于研究BCoV的分子流行病學(xué)。此外,基于對不同分離株的氨基酸差異的研究清楚地揭示出:在多態(tài)性區(qū)域中存在某些致病性和臨床癥狀的遺傳標記,但多態(tài)性區(qū)域是否在牛的BCoV發(fā)病機制中起重要作用還需要更直接的證據(jù)。不過,有研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)S1亞基的確能夠誘導(dǎo)宿主體內(nèi)中和抗體產(chǎn)生[23],這已強烈表明它在病毒-宿主作用中確實發(fā)揮重要作用。合理利用反向遺傳學(xué)系統(tǒng)將定向修飾技術(shù)引入冠狀病毒基因組生產(chǎn)感染性cDNA克隆,對于進一步研究S蛋白的基礎(chǔ)生物學(xué)意義重大。

3 S蛋白的生物學(xué)功能與應(yīng)用研究

3.1 S蛋白的致病特性研究

S蛋白能夠決定病毒的傳染能力及其在宿主中的傳播范圍。在所有患病的臨床樣本中檢測到的BCoV的S序列都表現(xiàn)出高度的相似性,不同的核苷酸序列并不是隨機分布,而是聚集在多態(tài)性區(qū)域[24]。S1亞基多態(tài)性區(qū)域中氨基酸位點突變能使突變株毒力發(fā)生改變,甚至導(dǎo)致由強毒株到無毒株的變化[25],這為S1亞基多態(tài)性區(qū)域參與病毒致病性提供了有力的證據(jù),同時也表明單個關(guān)鍵氨基酸的變化能夠影響病毒的感染性,這在SARS-CoV-2中也有所體現(xiàn)[26]。但S基因中多態(tài)性區(qū)域是否存在其他決定病毒毒力強弱的單獨特異性位點仍需要深入研究。

一些報告表明,所有BCoV在基因組和抗原水平上是相似的[18],而另一些報告則表明,不同毒株在遺傳和抗原方面存在差異[27],有研究在野生反芻動物和人類腸道及呼吸道分離株的S基因中檢測到明顯的遺傳差異,但體內(nèi)和體外試驗證明,這些分離株之間具有高水平的交叉保護[28]。因此,尚不確定BCoV與不同疾病表現(xiàn)相關(guān)的遺傳標記,疾病的發(fā)生可能是病原體、宿主和環(huán)境因素之間的相互作用的結(jié)果。同時,多項針對BCoV不同臨床癥狀的遺傳決定因素的研究提出多態(tài)性區(qū)域中的多種氨基酸(113、148、501、531氨基酸位點)可能與不同疾病的發(fā)生有關(guān)[27,29-30],數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示少數(shù)氨基酸的變化與不同病癥的發(fā)生具有一定的關(guān)聯(lián)性[31],然而具有不同疾病的遺傳標記仍然很難確認,因為臨床癥狀的差異也可能取決于宿主因素,這需要使用反向遺傳學(xué)系統(tǒng)或假病毒系統(tǒng)技術(shù)進行進一步探索驗證。為了詳細闡述BCoV致病特性的遺傳決定因素,需要分析疾病發(fā)生中包括S基因在內(nèi)的其他基因的致病性以及基因與基因之間的相關(guān)性,同時收集足夠數(shù)量的不同類型BCoV基因組樣本,以檢測與這些疾病類型密切相關(guān)的遺傳標記。

3.2 S蛋白的免疫原性

S蛋白是冠狀病毒附著并感染宿主細胞的關(guān)鍵性靶標,對病毒侵染很重要,其中一個重要因素是S蛋白的抗原性[32]。為了更好地評價S蛋白的抗原性,本課題組利用 IEBD 服務(wù)器分析預(yù)測其潛在的抗原表位(圖8和表 1)。S蛋白是BCoV的主要中和抗原,其兩個亞基都有負責(zé)誘導(dǎo)宿主體內(nèi)中和抗體的抗原結(jié)構(gòu)域,但S1亞基能誘導(dǎo)更高中和活性的單克隆抗體(monoclonal antibodys,mAbs)的產(chǎn)生,甚至比HE誘導(dǎo)的抗體更穩(wěn)定[33]。對S1亞基抗原表位的深入研究可能有助于開發(fā)針對BCoV有效安全的基因工程疫苗,如人們已基于其S1亞基成功研制出具有顯著預(yù)防作用的SARS-CoV-2商業(yè)化疫苗,并進行大量生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用[34]。

圖8 IEBD預(yù)測 S蛋白的 B細胞表位信息(筆者團隊制作)Fig.8 IEBD predicts B cell epitope information of S protein(made by the writers group)

有研究人員在BCoV中和抗S蛋白可識別競爭結(jié)合試驗中定義了A(氨基酸殘基位點 324 至 403)和B(氨基酸殘基位點517至720)兩組不同位點的抗原表位,發(fā)現(xiàn)雖然A組和B組mAb在體外都可以中和BCoV,但只有A組mAb表現(xiàn)出了體內(nèi)病毒中和保護反應(yīng)[35]。因此,S蛋白的抗原位點A在宿主物種中具有重要功能,如病毒抗原性及宿主特異性。有研究將B組mAb的中和表位定位到氨基酸殘基位點517至621(結(jié)構(gòu)域II),將結(jié)構(gòu)域II中氨基酸位置528的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸,定點突變導(dǎo)致B組失去中和活性,單個氨基酸的變化賦予了其對病毒中和的抵抗力,證實了S蛋白中和表位的單點突變是BCoV從免疫選擇性壓力中逃逸的原因[13]。有研究表明,免疫逃逸可能是暴露于宿主免疫系統(tǒng)的自然進化模式,而S1亞基是最有可能因免疫選擇壓力而發(fā)生變化的結(jié)構(gòu)[36]。

多項研究使用針對BCoV的mAbs對S蛋白進行表征,表明S1亞基上含有最多抗原識別位點,也說明主要的中和表位位于BCoV的S1亞基上,而S2亞基被較少部分具有中和活性的mAbs識別[37]。這和SARS-CoV-2免疫血清中存在的90%中和抗體都是針對SARS-CoV-2刺突蛋白S1亞基的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(receptor binding domain,RBD)的結(jié)果基本保持一致[38]。RBD由誘導(dǎo)高水平的S蛋白特異性中和抗體產(chǎn)生和Th1偏置反應(yīng)的免疫顯性表位組成,已被認為是理想的疫苗靶標[39]。同時,目前大多數(shù)SARS[40]和SARS-CoV-2[41]疫苗也是基于RBD這一結(jié)構(gòu)域設(shè)計的,且單獨的RBD比S1亞基或完整的S基因所構(gòu)建的疫苗策略具有更高的體液免疫和細胞免疫水平和保護效力,這可能是由于S蛋白其他結(jié)構(gòu)域的部分抗原表位具有抗體依賴性[42]。盡管據(jù)報道稱冠狀病毒的S2亞基引發(fā)的中和免疫反應(yīng)較弱,但其依舊可以誘導(dǎo)特異性細胞免疫反應(yīng)和高水平的總IgG,并能夠針對SARS-CoV毒株給予小鼠免疫保護[43]。由于S2亞基在不同變異毒株中高度保守,這為廣譜BCoV疫苗開發(fā)提供了重要參考信息。目前,對于BCoV的RBD區(qū)域尚無清楚的描述,但是冠狀病毒具有明顯的共同特征,因此BCoV可能與SARS-CoV-2的RBD區(qū)域在結(jié)構(gòu)和功能上存在一定的相似性,SARS-CoV-2的研究成果也許能夠為BCoV的RBD區(qū)域研究提供一些參考。同時,目前BCoV疫苗大多為滅活疫苗或者減毒活疫苗,尚無商業(yè)化的牛冠狀病毒疫苗上市,SARS-CoV-2疫苗研究成果對BCoV疫苗開發(fā)和抗病毒藥物的設(shè)計具有重要借鑒意義。

表1 IEBD預(yù)測S蛋白的 T細胞表位信息(筆者團隊制作)

3.3 S蛋白用于系統(tǒng)發(fā)育分析

盡管S蛋白的S2亞基在BCoV全基因組中相當(dāng)保守,但完整的S基因仍然被允許進行分子比較。人們通過對S蛋白部分特定基因或者全長基因進行系統(tǒng)發(fā)育分析,從而揭示BCoV的分子流行病學(xué)和遺傳進化信息,以及剖析S基因中遺傳信息與毒力強弱的相關(guān)性(表 2)。

由于研究者在研究中僅使用部分或整個S序列進行分析,因此被認為推斷進化路徑或共同祖先的依據(jù)并不充分。HE序列甚至于全基因組序列也應(yīng)該被考慮,使得溯源分析趨于完善。分析不同BCoV毒株之間S基因中氨基酸差異,了解其存在的抗原表位與遺傳關(guān)系,能夠為確定最適合冠狀病毒疫苗的成分提供有用的信息。同時有必要從分子水平進行病毒監(jiān)測和深度分析,以發(fā)現(xiàn)抗原特性改變的新BCoV譜系,確保為有效疫苗的研發(fā)提供準確信息以應(yīng)對預(yù)出現(xiàn)的新變異株。

表2 完整S蛋白或部分S蛋白基因用于系統(tǒng)發(fā)育分析

4 S蛋白變異分析

4.1 重組事件

近三年SARS-CoV-2的出現(xiàn)和傳播再次引起了人們對冠狀病毒的關(guān)注,高突變率和重組率是冠狀病毒基因型和表型變異的重要原因之一。重組已被報道為冠狀病毒基因組擴增和基因型變異的驅(qū)動力,并有助于新病毒的誕生和新病例的出現(xiàn)[49]。之前有研究表明,BCoV的HE基因存在明顯的重組事件,后來人們也發(fā)現(xiàn)了S基因內(nèi)的潛在重組事件[50]。新重組毒株的出現(xiàn)可能有利于病毒進化與提高其對環(huán)境適應(yīng)性,如與雞傳染性支氣管炎病毒的重組導(dǎo)致跨物種傳播和致病性變化[51],這是由于重組導(dǎo)致新冠狀病毒出現(xiàn)的第一個證據(jù)。隨后在雪貂冠狀病毒[52]、犬呼吸道冠狀病毒[53]的S基因區(qū)域均檢測到重組事件。此外,最近研究發(fā)現(xiàn),牛的雙重感染可能導(dǎo)致SARS-CoV-2和BCoV重組,產(chǎn)生具有這兩種病毒特征的嵌合病毒[54]。

由此推斷BCoV之間的跨物種傳播,除了本身的基因突變外,冠狀病毒之間S基因和HE基因的重組事件也是造成宿主范圍轉(zhuǎn)變的主要原因之一,應(yīng)強調(diào)限制接觸冠狀病毒庫的重要性,因為病毒庫為新病毒的產(chǎn)生提供了巨大的遺傳物質(zhì)來源[55]。另外,通過深度測序技術(shù)對不同BCoV種群進行遺傳進化分析,以監(jiān)測BCoV新的基因型和其他β冠狀病毒重組體的出現(xiàn),并評估它們在未來流行病中的致病潛力,以便更好地揭示可能發(fā)生的重組事件與預(yù)測未來BCoV的分子流行病學(xué)。

4.2 免疫壓力選擇

Franzo等[36]發(fā)現(xiàn),免疫逃逸可能是暴露于宿主免疫系統(tǒng)的自然進化模式,而S1亞基是最有可能因免疫選擇壓力而發(fā)生變化的結(jié)構(gòu)。研究人員利用收集到的大量的可用S蛋白數(shù)據(jù)集進行了選擇性壓力分析,證明了免疫壓力選擇是主要影響S蛋白變異的因素,特別是在S1區(qū)域檢測到不同位點的突變,高數(shù)量氨基酸的變化證明了突變是偶然發(fā)生的多樣化選擇[24]。這表明進化不是普遍存在的,主要通過選擇性爆發(fā)來發(fā)揮作用,例如由環(huán)境、宿主等因素引起[56]。遺傳多樣性的壓力作用于暴露在S表面的氨基酸,同時宿主免疫壓力也會反作用于S蛋白,致使S蛋白不斷發(fā)生循環(huán)進化,使BCoV不斷適應(yīng)新宿主與增強自身在宿主體內(nèi)存留的持久性。

4.3 蛋白質(zhì)的相互作用

蛋白質(zhì)之間的相互作用能夠促進S蛋白的變異,而S蛋白通過與唾液酸結(jié)合可以形成穩(wěn)定的復(fù)合物來阻止蛋白質(zhì)多樣化,使結(jié)合位點高度保守,進而保持S蛋白的穩(wěn)定,這一猜測在HCoV-OC43和豬血凝性腦脊髓炎病毒中得到了證明[33]。蛋白質(zhì)功能是長期進化過程的結(jié)果,涉及不同領(lǐng)域的精細相互作用,因此,在一個位點發(fā)生突變后,往往需要其他位點的補償性突變才能獲得適度的功能性增益,從而在進化中確認一個病毒與宿主相互兼容的模式[57]。S蛋白氨基酸多個位點的共同進化表明S蛋白在與宿主相互作用中保持整體蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的相關(guān)性。由此推測,不同位點共同進化的發(fā)生可能是保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和功能的補償性突變的結(jié)果。

4.4 宿主向性

除上述原因外,宿主向性是有利于S蛋白變異的因素之一。對冠狀病毒宿主范圍的評估確定了牛是BCoV引入散養(yǎng)、圈養(yǎng)和野生物種的主要宿主來源,也證實了BCoV作為主要病毒庫與其它新型冠狀病毒的出現(xiàn)具有明確的相關(guān)性[58]。令人驚訝的是,人類感染HCoV-OC43的病例和動物冠狀病毒的起源也可以追溯到牛(圖9),目前的結(jié)果進一步顯示該病毒具有巨大的人畜共患感染潛力,從而有必要對S蛋白結(jié)構(gòu)和功能進行深入研究[59]。同一種BCoV在不同宿主中有不同程度的變異,不同的BCoV在同一宿主中的致病性也不盡相同,這可能是S蛋白與宿主內(nèi)的其他病毒或者細菌以及環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。

圖9 BCoV的潛在跨物種傳播Fig.9 Potential cross-species transmission of BCoV

總體而言,CoV作為一種快速進化的新興病原體,能夠短時間內(nèi)進行跨物種傳播和新宿主的定植,其中最主要的原因之一是S蛋白變異所導(dǎo)致。免疫壓力選擇的作用已被證明是導(dǎo)致S蛋白遺傳變異的主要原因,有利于S蛋白的進化,進而擴大宿主范圍和重塑病毒的傳染性。

5 S蛋白的選擇模式

S1亞基中的兩個結(jié)構(gòu)域具有明確的正選擇模式。正選擇模式通常用于物種與環(huán)境之間的適應(yīng)性進化機制研究,例如在豬圓環(huán)病毒[60]和豬細小病毒[61]中記錄了編碼病毒蛋白的正選擇基因片段,并闡述了其與環(huán)境之間的進化機制。Zhu等[62]利用生物信息學(xué)軟件檢測到處于正選擇狀態(tài)的氨基酸位點為113、499、501、509、1 238,N端結(jié)構(gòu)域中含有的正選擇位點通過受體結(jié)合亞基在宿主免疫系統(tǒng)起作用,這可能與其含有的中和表位有關(guān)[8]。研究表明,S蛋白中強正向選擇序列與免疫反應(yīng)和受體結(jié)合有關(guān),因此連續(xù)監(jiān)測陽性選擇位點的變化可能為識別未來的主要流行株提供潛在的有用數(shù)據(jù),在將來有效預(yù)防BCoV的疫苗研發(fā)中提供關(guān)鍵信息。

S2亞基具有的是一種負選擇模式,病毒生命周期中具有基本功能的基因通常具有負選擇模式,該模式是限制和調(diào)節(jié)病毒表型的主導(dǎo)力量[63]。與其他模式相比,這種模式更靈活且能夠減弱有害突變的積累[64],例如,在感染了BCoV的S2重組體的細胞中觀察到大量合胞體形成,這加速了病毒的復(fù)制和造成免疫逃避,從而提高病毒的感染能力[65]。由此推測,S2亞基的主要功能是與細胞區(qū)室而不是宿主的免疫系統(tǒng)元件相作用,但是N端除外,因為S2序列N末端的突變經(jīng)常導(dǎo)致抗原性的改變[66]。S蛋白的受體結(jié)合亞基具有強陽性選擇位點,而融合亞基處于負選擇模式,基于這種選擇模式暗示了BCoV的適應(yīng)性進化,這解釋了BCoV在牛和其他動物甚至到人之間循環(huán)傳播而不會消失的作用機制,同時也表明其感染的持久性以及跨物種傳播的巨大潛力。

6 基于S蛋白的BCoV侵染的潛在雙受體系統(tǒng)

冠狀病毒的病毒進入依賴于病毒粒子表面的S-三聚體與宿主細胞受體之間的特異性相互作用,宿主受體的參與使S-三聚體不穩(wěn)定而暴露出S1和S2亞基之間的切割位點,然后被宿主中的組織蛋白酶或細胞外蛋白酶切割,啟動S2介導(dǎo)的膜融合和病毒進入[67]。最近有人對SADS-CoV結(jié)構(gòu)進行了詳細分析,提出了一種基于S蛋白的雙受體結(jié)合基序系統(tǒng)的獨特見解[67],這可能也適用于BCoV。對于大多數(shù)冠狀病毒而言,S1-NTD能識別細胞表面碳水化合物,S1-CTD可以特異性地與細胞蛋白受體結(jié)合。之前的報告中提出BCoV使用5-N-乙?；?9-O-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5,9Ac2)作為S1-NTD識別的受體(圖10)。然而,最近發(fā)現(xiàn)Neu5,9Ac2只是BCoV的附著受體,識別受體還未確定[68]。此外,Szczepanski等[69]使用多克隆抗體阻斷了病毒與人類白細胞抗原I (human leukocyte antigen, HLA-I)分子之間的相互作用,防止了BCoV的感染,這表明HLA-1是BCoV的進入受體,根據(jù)目前研究推測,BCoV也可能使用雙受體結(jié)合基序系統(tǒng),其中Neu5,9Ac2作為S1-NTD識別的聚糖附著受體,HLA-I作為S1-CTD識別的蛋白質(zhì)附著受體。

結(jié)構(gòu)使用密度擬合方案對蛋白結(jié)構(gòu)進行著色,*表示糖受體Neu5,9Ac2的結(jié)合位點The protein structure was colored using a density fitting scheme, and the * indicated the binding site of the sugar receptor Neu5,9Ac2

研究表明,宿主受體結(jié)合的S1亞基是宿主向性及傳播范圍的主要決定因素。Millet等[70]發(fā)現(xiàn),冠狀病毒的S1在一定程度上可以被認為是已經(jīng)進化出NTD和CTD結(jié)合模塊,作為擴大宿主范圍以及不同宿主物種之間的細胞向性的策略。推測NTD允許新出現(xiàn)的冠狀病毒適應(yīng)新的宿主環(huán)境并盡量保持低水平的結(jié)合,以促進對宿主細胞的感染,這可能在跨越物種屏障中發(fā)揮關(guān)鍵作用。相反,CTD通過調(diào)整并獲得適應(yīng)性突變,以優(yōu)化與新宿主蛋白受體的結(jié)合。

假定的雙受體識別系統(tǒng)可能在BCoV的跨物種傳播和感染過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。具體機制的闡述仍需深入了解S蛋白的整體結(jié)構(gòu)以便進一步解讀和驗證。迄今為止,細胞識別受體尚不確定,病毒進入的機理尚不清楚,RBD的功能仍需闡明。這限制了人們對BCoV致病特性和潛在跨物種傳播研究以及S蛋白詳細機理分析。

7 結(jié)語與展望

S糖蛋白是BCoV的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一,在病毒的初始感染、致病毒力、宿主向性、跨越種間屏障和誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答等多個過程中發(fā)揮著重要作用。在當(dāng)今強傳染性和高致病率的SARS-CoV-2全球流行的趨勢下,對于S蛋白的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究已經(jīng)成為國內(nèi)外冠狀病毒研究的一個熱點和重要內(nèi)容。人們利用S蛋白的各種截斷形式以及完整的三聚體結(jié)構(gòu)開發(fā)疫苗,有些經(jīng)過三期試驗后已進入商業(yè)化生產(chǎn)和臨床應(yīng)用,并得到了良好的預(yù)防效果。但就目前而言,人們對BCoV的關(guān)注度較低,對該病毒S蛋白相關(guān)研究闡述較少,且尚未生產(chǎn)出安全的商業(yè)化疫苗用于預(yù)防BCoV大規(guī)?；腥?。BCoV的S蛋白作為病毒的多功能性蛋白,應(yīng)當(dāng)充分發(fā)揮其在診斷、預(yù)防和治療方面的應(yīng)用價值。對BCoV的S蛋白深入研究將有利于BCoV感染疾病的治療與防控以及明確該病毒對人類跨物種屏障傳播風(fēng)險,以降低該病的發(fā)病率、致死率和人畜共患病概率,以促進全球畜牧業(yè)經(jīng)濟穩(wěn)定發(fā)展和公共衛(wèi)生安全保障。