片慧芳,杜旭彬,2,李 妍,張雨辰,何 惠,虞德兵*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,南京 210095;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,南京 210095;3.泰興市鵬源養(yǎng)殖有限公司,泰州 225400)

機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)嚴(yán)重影響動物的繁殖性能,產(chǎn)蛋后期蛋雞由于過度排卵,活性氧(ROS)大量積累,卵巢抗氧化能力減弱,卵泡閉鎖增多,卵泡數(shù)量減少,加速了產(chǎn)蛋率的下降[1-2]。近年來,大量研究表明,飼糧中添加抗氧化劑可以減輕衰老引起的氧化應(yīng)激,維持畜禽的繁殖能力。葡萄籽原花青素提取物可以增加衰老卵巢中的抗氧化酶活性及其基因表達(dá)來挽救抗氧化能力的下降,維持衰老卵巢中細(xì)胞增殖和凋亡之間的穩(wěn)態(tài)[3]。蝦青素可以提高蛋雞的抗氧化能力,促進(jìn)生殖激素的產(chǎn)生,通過降低卵泡閉鎖來改善產(chǎn)蛋后期的繁殖性能[4]。戴宏建等[5]報道山楂葉黃酮可以通過提高蛋殼腺的抗氧化能力來提高產(chǎn)蛋后期種雞的蛋殼品質(zhì)。綜上說明,通過提升蛋雞抗氧化能力來延長產(chǎn)蛋周期、提升繁殖效率是可行的。

甜菜堿,又稱三甲基甘氨酸,是一種高質(zhì)量的飼料添加劑,在提高家禽生產(chǎn)性能、維持家禽健康狀況等方面發(fā)揮重要作用。Omer等[6-7]研究發(fā)現(xiàn),蛋雞日糧中添加甜菜堿可以通過表觀遺傳調(diào)控肝的脂質(zhì)代謝,促進(jìn)肝中蛋黃前體物質(zhì)的合成和釋放,提升蛋雞產(chǎn)蛋率。Shakeri等[8]發(fā)現(xiàn),日糧中添加甜菜堿可以緩解熱應(yīng)激條件下肉雞的氧化應(yīng)激現(xiàn)象,提高谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶的活性。

顆粒細(xì)胞是卵泡內(nèi)數(shù)量最多的細(xì)胞,參與激素的合成和分泌,并向卵母細(xì)胞傳遞信息,在卵泡的發(fā)育成熟過程發(fā)揮主要調(diào)控作用[9]。產(chǎn)蛋后期蛋雞卵巢清除氧化物的能力減弱,日糧中添加甜菜堿是否通過緩解衰老蛋雞卵巢的氧化應(yīng)激及卵泡顆粒細(xì)胞微環(huán)境的變化來改善卵泡發(fā)育進(jìn)而提升產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能尚未有相關(guān)報道。因此,本研究在產(chǎn)蛋后期蛋雞日糧中添加甜菜堿,研究其對產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能和抗氧化能力的影響,為延長產(chǎn)蛋周期,提高經(jīng)濟(jì)效益提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計與樣品采集

試驗(yàn)選取生理狀態(tài)、產(chǎn)蛋率相近的108只海蘭褐殼蛋雞(500日齡),隨機(jī)分為3組,每組3個重復(fù),每個重復(fù)12只雞。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧,試驗(yàn)組在基礎(chǔ)日糧中分別添加1 000、3 000 mg·kg-1甜菜堿?；A(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)成分見表1。甜菜堿(C5H12NO2Cl含量≥98%)購自山東祥維斯生物科技股份有限公司。試驗(yàn)于2023年4月在江蘇省泰州市泰興市鵬源養(yǎng)殖有限公司進(jìn)行。預(yù)試驗(yàn)1周,正式試驗(yàn)6周。試驗(yàn)期間,蛋雞采用階梯式籠養(yǎng),自由采食和飲水,舍內(nèi)光照維持16 h,黑暗8 h。每天7:00、13:30各飼喂1次。試驗(yàn)結(jié)束時,每組隨機(jī)選取6只蛋雞翅靜脈采血,4 ℃、2 800×g離心10 min,分離獲得的血清儲存于-20 ℃?zhèn)溆谩Ｃ拷M隨機(jī)選擇6只雞,頸部放血處死,采集卵巢、直徑為6～8 mm的小黃卵泡,分離顆粒層,液氮速凍后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 生產(chǎn)性能及蛋品質(zhì)的測定

每天記錄各組各重復(fù)的產(chǎn)蛋數(shù)和蛋重,計算飼養(yǎng)日產(chǎn)蛋率。每天記錄各組各重復(fù)的采食量,計算料蛋比。

試驗(yàn)結(jié)束時每個重復(fù)收集6枚蛋,每組18枚蛋。使用游標(biāo)卡尺和螺旋測微器(日本三豐公司)測定蛋形指數(shù)和蛋殼厚度;使用蛋殼強(qiáng)度測定儀(北京天翔飛域科技有限公司)測定蛋殼強(qiáng)度;使用多功能蛋品質(zhì)自動分析儀(日本Touhoku Rhythm Co. Ltd.公司)測定蛋白高度、哈氏單位、蛋黃顏色;分離蛋黃蛋清,蛋黃稱重。

1.3 血清激素、抗氧化水平及卵巢抗氧化水平相關(guān)指標(biāo)的測定

使用ELISA試劑盒(南京奧青生物技術(shù)有限公司)檢測血清中雌二醇(E2)、促卵泡生成素(FSH)、黃體生成素(LH)、孕酮(Prog)含量,按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

使用試劑盒(南京奧青生物技術(shù)有限公司)測定蛋雞血清和卵巢中總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量,按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4 總RNA的分離和qRT-PCR

使用TRIzol試劑(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)從小黃卵泡顆粒層樣品中提取總RNA。使用5×All-In-One RT MasterMix試劑盒(愛必夢生物科技有限公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,反應(yīng)體系為:400 ng 總 RNA、反轉(zhuǎn)錄酶 4 μL,加去離子水至 20 μL; 反應(yīng)條件: 37 ℃ 15 min,60 ℃ 10 min。通過熒光定量PCR檢測目的基因的表達(dá)水平,反應(yīng)體系為20 μL:cDNA 2 μL、2×SYBR Green Master Mix(愛必夢生物科技有限公司)10 μL、雙蒸水7 μL、目的基因上/下游引物(1 μmol·L-1)各0.5 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性 3 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,40 個循環(huán)。根據(jù)GenBank 中收錄的雞相關(guān)基因序列,用NCBI設(shè)計引物,選擇β-actin作為內(nèi)部參照基因,用2- ΔΔCT法[10]進(jìn)行計算,引物由南京擎科生物科技有限公司合成,引物序列信息見表2。

表2 基因的引物序列

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),使用Duncan’s法進(jìn)行多重比較,采用多項(xiàng)式中的線性和二次分析對不同濃度梯度的效果進(jìn)行分析。結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 甜菜堿對產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能的影響

如表3所示,與對照組相比,日糧中添加3 000 mg·kg-1甜菜堿可以使產(chǎn)蛋后期蛋雞的產(chǎn)蛋率和平均蛋重提高10.98%(P<0.01)和4.69%(P<0.05),且產(chǎn)蛋率和平均蛋重與甜菜堿添加水平呈顯著線性關(guān)系(PL<0.01);對料蛋比無顯著影響(P>0.05);日糧中添加1 000 mg·kg-1甜菜堿對產(chǎn)蛋率、平均蛋重和料蛋比均無顯著影響(P>0.05)。

2.2 甜菜堿對產(chǎn)蛋后期蛋品質(zhì)的影響

如表4所示,與對照組相比,日糧中添加3 000 mg·kg-1的甜菜堿使蛋白高度、蛋黃顏色、蛋黃重量分別提高了19.18%、15.04%、8.08% (P<0.05),且蛋白高度、蛋黃顏色和蛋黃重量與甜菜堿添加量呈顯著線性關(guān)系(PL<0.05),而其他指標(biāo)與對照組比均無顯著差異(P>0.05);日糧中添加1 000 mg·kg-1的甜菜堿對產(chǎn)蛋后期蛋品質(zhì)無顯著影響(P>0.05)。

表4 甜菜堿對產(chǎn)蛋后期蛋雞蛋品質(zhì)的影響

2.3 甜菜堿對產(chǎn)蛋后期蛋雞血清激素水平的影響

如表5所示,與對照組相比,日糧中添加1 000、3 000 mg·kg-1的甜菜堿,均極顯著提升了產(chǎn)蛋后期蛋雞血清中FSH和LH的水平(P<0.01),且FSH分別提高了53.51%、97.37%,LH分別提高了47.12%、68.27%;與對照組相比,添加3 000 mg·kg-1甜菜堿組血清中Prog含量提高了35.08%(P<0.01),且血清中E2水平有提升的趨勢(0.05

表5 甜菜堿對產(chǎn)蛋后期蛋雞血清激素水平的影響

2.4 甜菜堿對產(chǎn)蛋后期蛋雞血清和卵巢抗氧化指標(biāo)的影響

如表6所示,與對照組相比,日糧中添加1 000、3 000 mg·kg-1的甜菜堿,極顯著提升了產(chǎn)蛋后期蛋雞血清中的T-AOC水平和SOD、GSH-Px、CAT的酶活性(P<0.01),且T-AOC分別提升了41.17%、61.31%,SOD分別提升了33.30%、48.56%,GSH-Px分別提升了19.83%、36.97%,CAT分別提升了53.63%、69.92%;極顯著降低了血清中的MDA水平(P<0.01),分別降低了45.24%、53.86%。與對照組相比,日糧中添加3 000 mg·kg-1的甜菜堿產(chǎn)蛋后期蛋雞卵巢中T-AOC水平和SOD、CAT的酶活性顯著提升,分別提升了48.31%、86.52%、75.69%,MDA水平顯著降低(P<0.05),顯著降低了33.71%。但對卵巢中GSH-Px酶的活性無顯著影響(P>0.05)。同時,血清中SOD、GSH-Px活性和卵巢中T-AOC、MDA水平、SOD、CAT活性與甜菜堿添加量呈顯著線性關(guān)系(PL<0.05);血清中T-AOC、MDA水平、CAT活性與甜菜堿添加量呈顯著線性和二次關(guān)系(PL<0.01;PQ<0.01)。

表6 甜菜堿對產(chǎn)蛋后期蛋雞血清和卵巢抗氧化指標(biāo)的影響

2.5 甜菜堿對產(chǎn)蛋后期蛋雞小黃卵泡顆粒細(xì)胞Nrf2/HO-1通路活性及相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖1所示,與對照組相比,日糧中添加甜菜堿線性提高顆粒細(xì)胞中SOD、HO-1基因表達(dá)量(PL<0.01),且3 000 mg·kg-1甜菜堿組顆粒細(xì)胞SOD基因的表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05),1 000和3 000 mg·kg-1甜菜堿組均可以提高小黃卵泡顆粒細(xì)胞HO-1基因的表達(dá)水平(P<0.05或P<0.01);日糧中添加甜菜堿,Nrf2基因的表達(dá)水平呈二次曲線升高(PQ<0.01),且與對照組相比,日糧中添加1 000 mg·kg-1可以極顯著提升Nrf2基因的表達(dá)水平(P<0.01);日糧中添加甜菜堿線性和二次曲線升高NQO1基因的表達(dá)水平(PL<0.01;PQ<0.01),且與對照組相比,添加1 000、3 000 mg·kg-1甜菜堿可以極顯著提高提高NQO1基因的表達(dá)水平(P<0.01);此外,日糧中添加甜菜堿可以顯著提升CAT基因的表達(dá)水平(P<0.05),但對GPX基因的表達(dá)量無顯著影響(P>0.05)。

*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05);**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)* mean significant difference compared with the control group (P<0.05); ** mean highly significant difference compared with the control group (P<0.01)

2.6 甜菜堿對產(chǎn)蛋后期蛋雞小黃卵泡顆粒細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖2所示,與對照組相比,日糧中添加1 000、3 000 mg·kg-1甜菜堿對顆粒細(xì)胞PCNA和Caspase3基因的表達(dá)水平均無顯著影響(P>0.05)。

圖2 甜菜堿對產(chǎn)蛋后期蛋雞小黃卵泡顆粒細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.2 Effect of betaine on the expression of genes related to proliferation and apoptosis of small yellow follicle granulosa cells of late-phase laying hens

3 討 論

3.1 甜菜堿對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

甜菜堿是一種高效的飼料添加劑,在提升畜禽生長性能,提高畜禽產(chǎn)品品質(zhì)等方面發(fā)揮重要作用[11-12]。Alagawany等[13]研究發(fā)現(xiàn),日糧中添加甜菜堿可以提高產(chǎn)蛋后期蛋雞的產(chǎn)蛋率、蛋品質(zhì)和免疫機(jī)能。本試驗(yàn)結(jié)果表明,日糧中添加3 000 mg·kg-1甜菜堿顯著提升了產(chǎn)蛋后期蛋雞的產(chǎn)蛋率和平均蛋重。

類固醇激素對于卵泡的生長、成熟、排卵具有重要作用,是衡量蛋雞產(chǎn)蛋性能的關(guān)鍵指標(biāo)[14]。FSH可以促進(jìn)卵泡的生長、發(fā)育和成熟,LH誘導(dǎo)卵泡排卵,兩者協(xié)同作用,調(diào)節(jié)卵泡E2的生成,進(jìn)而影響動物的繁殖性能[15]。在蛋雞衰老過程中,血清中激素水平的下降,降低蛋雞的繁殖性能,在本試驗(yàn)中,日糧中添加1 000、3 000 mg·kg-1的甜菜堿,極顯著提升了產(chǎn)蛋后期蛋雞血清中的FSH和LH的水平;日糧中添加3 000 mg·kg-1的甜菜堿極顯著提升了產(chǎn)蛋后期蛋雞血清中Prog的水平,這與產(chǎn)蛋率的增加相一致。故甜菜堿可以通過增加激素水平促進(jìn)卵泡發(fā)育,改善產(chǎn)蛋后期蛋雞的繁殖性能。

3.2 甜菜堿對蛋品質(zhì)的影響

隨著蛋雞日齡的增加,產(chǎn)蛋后期蛋雞蛋品質(zhì)逐漸下降,如蛋殼厚度降低、蛋白高度下降等[16],調(diào)節(jié)基礎(chǔ)日糧的組成或使用添加劑可以改善產(chǎn)蛋后期的蛋品質(zhì)。曲昆鵬等[17]研究表明,日糧中添加500 g·t-1甜菜堿可以提升海蘭褐殼蛋雞的蛋黃顏色和蛋黃比重;Zaki等[18]研究發(fā)現(xiàn),蛋雞日糧中添加甜菜堿可以顯著增加蛋黃顏色;喬淑文等[19]研究表明,日糧中添加甜菜堿可以緩解熱應(yīng)激下蛋殼強(qiáng)度、蛋殼厚度、哈氏單位等指標(biāo)的下降。

蛋雞日糧中的葉黃素被載脂蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至卵黃中沉積,影響蛋黃顏色[20],產(chǎn)蛋后期蛋雞卵黃前體物質(zhì)和載脂蛋白合成能力減弱,卵黃合成和積累能力降低,降低產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)[21]。甜菜堿可以作為甲基供體促進(jìn)肝載脂蛋白的合成[17],促進(jìn)卵黃蛋白原(VTG)和飼料中的葉黃素的運(yùn)輸及其在蛋黃中的沉積,本研究添加3 000 mg·kg-1的甜菜堿顯著提高蛋黃顏色、蛋黃重量和蛋白高度可能與此有關(guān),但具體的內(nèi)在機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

3.3 甜菜堿對產(chǎn)蛋后期蛋雞卵巢抗氧化能力的影響

衰老引起的氧化應(yīng)激是產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能下降的主要原因[22]。ROS的積累打破了機(jī)體正常的氧化劑和抗氧化系統(tǒng)間的平衡[23],過量的ROS會破壞生物大分子,產(chǎn)生MDA,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和組織損傷[24]。CAT、GSH-Px、SOD等抗氧化酶可以維持體內(nèi)的氧化平衡狀態(tài),保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷[25]。研究表明甜菜堿可以增加血清中抗氧化相關(guān)酶的水平[26]。本試驗(yàn)中,日糧中添加1 000、3 000 mg·kg-1甜菜堿均顯著提升了血清中的T-AOC水平和SOD、GSH-Px、CAT的酶活性,顯著降低了血清中MDA含量;日糧中添加3 000 mg·kg-1的甜菜堿顯著提升了產(chǎn)蛋后期卵巢的T-AOC水平和SOD、CAT的酶活性且顯著降低了卵巢中MDA水平,與楊密等[27]和Cai等[28]的研究結(jié)果一致,即日糧中添加甜菜堿可以提高畜禽的抗氧化能力。

增齡或衰老伴隨的氧化損傷會導(dǎo)致卵巢功能不斷下降[29]。在卵巢衰老過程中,顆粒細(xì)胞受到氧化應(yīng)激的影響發(fā)生凋亡,使得卵泡閉鎖,最終導(dǎo)致產(chǎn)蛋后期蛋雞的繁殖性能降低[30]。基于血清和卵巢中抗氧化酶活性的提升,本試驗(yàn)進(jìn)一步研究了小黃卵泡顆粒細(xì)胞中抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)水平。核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)在抗氧化系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,它可以激活抗氧化反應(yīng)元件(ARE),促進(jìn)下游抗氧化基因例如HO-1、NQO1、CAT、SOD和GPX的表達(dá)[31]。蛋雞衰老過程中,卵巢氧化應(yīng)激加強(qiáng),Nrf2/HO-1通路活性降低[22]。Chen等[32]研究表明,高劑量甜菜堿通過上調(diào)Nrf2和HO-1在胸肌中的mRNA表達(dá)水平,改變Nrf2信號通路來提高肌肉的抗氧化能力。本研究在日糧中添加1 000、3 000 mg·kg-1甜菜堿,均顯著提升了CAT、HO-1、NQO1基因的表達(dá)水平,與Cai等[28]發(fā)現(xiàn)湖羊日糧中添加甜菜堿,可增加湖羊睪丸CAT、SOD和GSH-Px的mRNA表達(dá)水平,增強(qiáng)湖羊睪丸的抗氧化能力結(jié)果一致。因此,甜菜堿可能通過激活Nrf2通路,提升產(chǎn)蛋后期蛋雞卵泡顆粒細(xì)胞的抗氧化水平。

越來越多的證據(jù)表明,氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡,卵泡閉鎖加劇可能是老年蛋雞繁殖力下降的根本原因[33-34]。先前的研究表明,甜菜堿可以通過增加人前列腺癌細(xì)胞的凋亡和炎癥來抑制細(xì)胞增殖[35];Samie等[36]發(fā)現(xiàn),甜菜堿可以抑制高糖條件下小鼠顆粒細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖,而Cai等[28]發(fā)現(xiàn)湖羊日糧中添加甜菜堿,睪丸PCNA基因的表達(dá)降低,本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),日糧中添加甜菜堿PCNA和Caspase3基因表達(dá)水平與對照組相比無顯著差異,由于物種和組織的差異,與前人研究結(jié)果不同,甜菜堿是否可以改變產(chǎn)蛋后期顆粒細(xì)胞的增殖水平還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

綜上所述,產(chǎn)蛋后期蛋雞日糧中添加甜菜堿,可以通過增加血清激素水平和血清、卵巢中抗氧化酶的活性,促進(jìn)小黃卵泡顆粒細(xì)胞中抗氧化相關(guān)基因CAT、SOD、Nrf2、HO-1、NQO1的表達(dá),提高顆粒細(xì)胞的抗氧化能力,進(jìn)而延緩蛋雞衰老,提升產(chǎn)蛋后期蛋雞的生產(chǎn)性能。