朱宗財(cái) 王志軍 高能 武冬梅

摘要：植物病害是影響作物生長的重要因素之一，對世界糧食安全構(gòu)成很大的威脅，培育優(yōu)良的抗病品種成為最優(yōu)策略。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)自問世以來備受關(guān)注，因該系統(tǒng)簡單、高效、穩(wěn)定的特點(diǎn)，逐漸成為分子育種領(lǐng)域重要的技術(shù)手段。本綜述簡單回顧了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的技術(shù)原理和在植物中的應(yīng)用情況，系統(tǒng)總結(jié)了該技術(shù)在植物抗真菌、細(xì)菌和病毒方面的應(yīng)用。還列舉了可用于提高植物抗病性的基因位點(diǎn)以及真菌、細(xì)菌和病毒等病原物的致病相關(guān)基因位點(diǎn)編輯應(yīng)用情況，探討了該技術(shù)主要的優(yōu)勢和不足，以及未來應(yīng)用的前景和挑戰(zhàn)，以期為今后研究提供參考和借鑒。

關(guān)鍵詞：CRISPR/Cas9；基因編輯技術(shù)；植物抗病性；抗病性改良；抗病育種

中圖分類號(hào)：S432.1? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）03-0001-11

植物病害是影響作物生長的重要因素之一，因植物病害引起的作物減產(chǎn)高達(dá)20%左右，對世界糧食安全構(gòu)成很大的威脅［1］。雖然化學(xué)藥劑的使用一定程度上可以降低植物病害帶來的危害，但由于化學(xué)藥劑的特性，對人類健康和自然環(huán)境帶來潛在的風(fēng)險(xiǎn)［2］，因而，嚴(yán)重依賴化學(xué)藥劑的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式是不可持續(xù)的，迫切需要綠色環(huán)保、有效可靠的方式為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)保駕護(hù)航［3］。近年來，隨著一些生物農(nóng)藥的成功研制，為植物病害的防治帶來了新的手段，但存在防治效果緩慢、易受環(huán)境因素的制約與干擾等問題，所以目前植物病害的防治仍然以化學(xué)防治為主，生物農(nóng)藥僅占全球作物保護(hù)市場的5%［4］。因此，培育優(yōu)良的抗病品種成為最優(yōu)策略［5］。

不管是傳統(tǒng)的作物育種還是近年來迅速發(fā)展的分子育種，本質(zhì)上兩者都是促進(jìn)基因間的交流，但分子育種的優(yōu)勢在于能夠定向的設(shè)計(jì)和操作，實(shí)現(xiàn)從傳統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)育種到定向高效的精準(zhǔn)育種的躍升［6］。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)因能夠精準(zhǔn)地對生物體基因組特定目標(biāo)基因進(jìn)行修飾，而逐漸成為分子育種領(lǐng)域的重要技術(shù)手段，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)療、工業(yè)等領(lǐng)域［7-8］。

1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)

CRISPR/Cas系統(tǒng)廣泛存在于原核生物基因中，是細(xì)菌和古細(xì)菌為應(yīng)對病毒和質(zhì)粒的不斷攻擊而進(jìn)化出的RNA介導(dǎo)的適應(yīng)性防御系統(tǒng)［9］。CRISPR/Cas系統(tǒng)分為3類，分別是Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型，其中Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR系統(tǒng)利用Cas蛋白與crRNAs的復(fù)合物介導(dǎo)對靶標(biāo)DNA識(shí)別與剪切，Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)則是通過RNA引導(dǎo)的內(nèi)切酶Cas9以及2種非編碼crRNA和tracrRNA識(shí)別并剪切靶標(biāo)DNA［10］。2012年，Jinek等發(fā)現(xiàn)一種雙鏈RNA，即tracrRNA-crRNA，它能夠指導(dǎo)Cas9蛋白在特定位點(diǎn)剪切雙鏈DNA，并且將tracrRNA-crRNA二元復(fù)合體改造為單鏈RNA嵌合體后，仍能夠指導(dǎo)Cas9蛋白［11］。2013年Cong等首次利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了基因敲除［12］。隨著研究的不斷深入，CRISPR/Cas9系統(tǒng)不僅僅用于基因敲除，而且在內(nèi)源基因表達(dá)的調(diào)控、染色體位點(diǎn)活細(xì)胞標(biāo)記、單鏈RNA編輯、高通量基因篩選等方面也得到了應(yīng)用，并且因該系統(tǒng)簡單、高效、穩(wěn)定的特點(diǎn)，迅速吸引了眾多科學(xué)家在動(dòng)植物育種、藥物篩選等相關(guān)領(lǐng)域展開研究［13］。

1.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的技術(shù)原理

CRISPR/Cas9系統(tǒng)由單向?qū)NA（single guide RNA，簡稱sgRNA）和核酸內(nèi)切酶Cas9組成［11］，其中crRNA和tracrRNA融合形成sgRNA，crRNA則是RNA酶Ⅲ加工CRISPR轉(zhuǎn)錄成的一條長的RNA分子（Precursor crRNAs，pre-crRNAs）后形成的，tracrRNA 則是與crRNA互補(bǔ)的一段序列［14］。Cas9包含HNH和RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域，其中HNH域是單個(gè)域，而RuvC域由3個(gè)子域組成，分別是RuvC-Ⅰ、RuvC-Ⅱ和RuvC-Ⅲ，RuvC-Ⅰ在Cas9氨基端，RuvC-Ⅱ和RuvC-Ⅲ位于HNH兩側(cè)［15］。Cas9在sgRNA的引導(dǎo)下到達(dá)靶標(biāo)基因位點(diǎn)解開DNA雙鏈，使crRNA與互補(bǔ)鏈雜交，另一條鏈保持游離的單鏈狀態(tài)，然后由Cas9蛋白的HNH活性位點(diǎn)剪切crRNA的互補(bǔ)DNA 鏈（目標(biāo)鏈），RuvC活性位點(diǎn)剪切非互補(bǔ)鏈（非目標(biāo)鏈），最終產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（double-strand break，簡稱DSB）［9，15］。當(dāng)產(chǎn)生DSB后，會(huì)觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)DNA修復(fù)機(jī)制，在無修復(fù)模板時(shí)，非同源末端連接（nonhomologous end joining，簡稱NHEJ）修復(fù)機(jī)制被激活，在DSB位置出現(xiàn)隨機(jī)插入、缺失或替換；當(dāng)存在同源性供體DNA修復(fù)模板時(shí)，通常會(huì)觸發(fā)同源定向修復(fù)（homology directed repair，簡稱HDR）機(jī)制，形成手術(shù)刀式的精確修飾［15］。在實(shí)際應(yīng)用中，crRNA序列是與靶標(biāo)基因同源的20個(gè)核酸序列，tracrRNA為通用序列，并且靶標(biāo)基因位點(diǎn)緊鄰PAM序列（通常是PAM序列上游 3 bp 處），當(dāng)PAM序列為NGG（N為任意堿基）序列時(shí)切割效率最高［16］（圖1）。

1.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物中的應(yīng)用

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)因操作方便、成本低廉、編輯效率高等特點(diǎn)，已經(jīng)成為植物基因編輯的有力工具之一［17］。隨著研究的不斷深入，經(jīng)過改造的CRISPR/Cas9系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于擬南芥、煙草、高粱、水稻、小麥、玉米等不同植物基因組的定向編輯，作用方式包括基因敲除、基因組缺失、順式調(diào)控元件的破壞、基因敲入和病毒感染的抑制等，并且獲得較高的誘導(dǎo)突變率和可穩(wěn)定遺傳的基因組編輯植株［18-19］。該技術(shù)不僅可以對單個(gè)靶標(biāo)進(jìn)行編輯，而且能夠?qū)崿F(xiàn)多靶標(biāo)編輯，Ma等開發(fā)了一種能夠?qū)Χ鄠€(gè)基因位點(diǎn)（最多8個(gè)）編輯的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，并成功應(yīng)用于水稻和擬南芥的水稻類成花素家族（FT-like）功能的研究［20］。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的基因敲入或替換主要依賴于細(xì)胞的HDR機(jī)制，由于HDR僅在S期和G2期晚期活躍，而NHEJ在除有絲分裂外的整個(gè)細(xì)胞周期中均比較活躍。因此，基因敲入或替換的編輯效率較低［21］，但仍在許多植物中實(shí)現(xiàn)了基因片段的精確敲入或替換。例如，在玉米、水稻等植物中已有相關(guān)報(bào)道［22-24］。近年來，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)也開始應(yīng)用于植物與病原物互作的研究中，對于提高植物抗病性具有重大意義［25］。

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物抗真菌中的應(yīng)用

2.1 編輯寄主基因產(chǎn)生抗病性

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)為真菌研究領(lǐng)域帶來了巨大的變革。2015年，Ndvig等通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)有效地將定向突變引入到構(gòu)巢曲霉菌（Aspergillus nidulans）中［26］。同年Matsu-Ura等發(fā)現(xiàn)，該技術(shù)同樣可以有效編輯粗糙鏈孢霉菌（Neurospora crassa），并猜想可能還適用于鏈孢霉屬自然分離物和絲狀真菌的基因編輯［27］。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)已成功構(gòu)建OsERF922和Pi21等基因缺失的突變株系，與野生型相比，突變株系對稻瘟病的抗性均有所提高，而不影響主要農(nóng)藝性狀［28-30］。小麥?zhǔn)荏w類細(xì)胞質(zhì)激酶基因TaPsIPK1是一個(gè)已知的被銹病效應(yīng)蛋白靶向的易感基因，通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除TaPsIPK1基因的突變株系對小麥條銹病病原菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici）能夠產(chǎn)生廣譜抗性，農(nóng)藝性狀同樣未受到影響［31］。TCP轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育、激素合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及對生物和非生物脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮重要作用，而大豆在感染大豆赤霉病后，TCP基因會(huì)被顯著誘導(dǎo)［32］。因此，F(xiàn)an等利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在大豆品種Williams 82中特異性誘導(dǎo)GmTCP19L靶向突變，發(fā)現(xiàn)GmTCP19L直接或間接調(diào)節(jié)大豆對赤霉病的抗性［33］。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)不僅用于糧食作物病害的研究，還應(yīng)用于蔬菜病害的研究。研究顯示，通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)同時(shí)敲除番茄中的miR482b和miR482c基因，能夠提高番茄對晚疫病的抗性，并且同時(shí)敲除miR482b和miR482c比單獨(dú)敲除miR482b的抗性更強(qiáng)［34］。晚疫病同樣也是危害馬鈴薯的主要病害之一，在我國發(fā)生較為普遍。Moon等將StSR4基因通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)引入馬鈴薯原生質(zhì)體中，產(chǎn)生StSR4基因缺失的突變株系，盡管對晚疫病的抗性有所提高，但馬鈴薯的生長受到抑制［35］。

尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）是土傳真菌病原中最具代表性的病原之一，危害棉花、番茄、香蕉和甜瓜在內(nèi)的許多重要作物，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。植物磺肽素（phytosulfokine，簡稱PSK）是一種二硫酸五肽植物激素，在植物生長發(fā)育以及植物免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用［36-37］。通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除編碼PSK前體的Clpsk1基因，發(fā)現(xiàn)Clpsk1功能喪失后的西瓜幼苗，增加了對尖孢鐮刀菌的抗性［38］。陸地棉為異源四倍體，導(dǎo)致傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)的應(yīng)用存在一定困難，因此Zhang等利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成功將Gh14-3-3d基因插入陸地棉中，突變株系顯著增加了對大麗輪枝菌的抗性［39］。通常CRISPR/Cas9系統(tǒng)包含2個(gè)啟動(dòng)子，分別用來啟動(dòng)Cas9蛋白和sgRNA。2021年，Mishra等首次使用單個(gè)啟動(dòng)子的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，對辣椒的易感基因CaERF28進(jìn)行缺失突變，與野生型相比，抗炭疽病能力明顯增強(qiáng)［40］。CRISPR/Cas9系統(tǒng)直接編輯寄主基因提高對真菌病害的抗性詳見表1。

2.2 編輯真菌基因產(chǎn)生抗病性

小麥穎枯病是由穎枯殼針孢（Parastagonospora nodorum）引起的小麥死體營養(yǎng)型真菌病害，研究顯示CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可用于P. nodorum反向遺傳的研究，并且在NHEJ途徑和HR途徑均進(jìn)行了驗(yàn)證［41］。子囊菌亞門稻綠核菌屬稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）是稻曲病的致病因子，研究人員以U. virens的Gln-tRNA為啟動(dòng)子構(gòu)建了Cas9-gRNA載體，并轉(zhuǎn)化至U. virens菌株的原生質(zhì)體中，有效地靶向缺失U. virens中的USTA和UvSLT2基因［42］。由于疫霉（Phytophthora）同源重組率低，所以無法有效對其進(jìn)行基因編輯。2017年Fang等利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在大豆疫霉（P. sojae）中建立基因編輯體系，而且在其他疫霉的基因編輯研究中提出優(yōu)化方案，為更深層次的研究提供了新思路［43］。環(huán)磷酸腺（cyclic adenosine monophosphate，簡稱cAMP）信號(hào)通路在控制植物病原體的形態(tài)變化和致病性方面發(fā)揮重要作用［44］。PcPdeH是一種編碼高親和力磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）的基因，是cAMP信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［45］。在辣椒疫霉（P. capsici）中利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得PcPdeH缺失的突變菌株，突變菌株表現(xiàn)出營養(yǎng)生長缺陷的現(xiàn)象，并且與野生型菌株相比毒力顯著降低［46］。尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）作為典型的土傳病害，能夠引起植物產(chǎn)生多種病害，最常見的則為枯萎病，植物感染后表現(xiàn)出褪綠、壞死、發(fā)育遲緩和萎蔫等癥狀［46］。Wang等基于同源性靶向整合（homology-independent targeted integration，簡稱HITI）和同源性重組整合（homology-dependent recombination Integration，簡稱HDRI），利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成功建立尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）等真菌的內(nèi)源性基因標(biāo)記（endogenous gene tagging，EGT）系統(tǒng)，為闡明尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）毒力因子及發(fā)病機(jī)制提供了強(qiáng)有力的技術(shù)手段［47］。

3 ?CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物抗細(xì)菌中的應(yīng)用

3.1 編輯寄主基因產(chǎn)生抗病性

植物細(xì)菌病害防控水平取決于植物病原細(xì)菌學(xué)的基礎(chǔ)研究水平和創(chuàng)新能力［48］，假單胞桿菌屬（Pseudomonas）作為植物病原細(xì)菌主要類群之一，造成的危害主要是葉斑、葉枯、萎蔫。丁香假單胞菌番茄致病變種（P. syringae pv. tomato DC3000，Pto DC3000）是番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病的致病因子，主要通過氣孔和傷口入侵番茄，而Pto DC3000入侵番茄后，則產(chǎn)生刺激氣孔打開和促進(jìn)細(xì)菌定殖的冠菌素（coronatine，COR），SlJAZ2蛋白是氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中COR的主要供受體，Ortigosa等通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)編輯SlJAZ2基因，產(chǎn)生C端結(jié)構(gòu)域缺失的突變體，進(jìn)而通過COR阻止氣孔重新開放，增加了對Pto DC3000的抗性［49］。蘋果火疫病是由梨火疫歐文氏桿菌（Erwinia amylovora）侵染所引起的一類毀滅性病害，E. amylovora的致病基因DspA/E編碼的致病效應(yīng)子與蘋果易感蛋白MdDIPM4相互作用觸發(fā)植物感染，因此，有研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除MdDIPM4，以降低對E. amylovor的敏感性［50］。水稻白葉枯病是由稻黃單胞菌白葉枯致病變種（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）引起的一種細(xì)菌性病害，提高水稻自身抗性是一種經(jīng)濟(jì)有效的辦法。水稻Os8N3（也稱為OsSWET11）基因是轉(zhuǎn)錄激活類因子（transcription activator-like effector，TAL effector）誘導(dǎo)的易感基因。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除水稻Os8N3（OsSWET11）基因的突變株系，顯著增強(qiáng)了對Xoo的抗性，且農(nóng)藝性狀未發(fā)生顯著變化［51-53］。柑橘潰瘍病由該菌的亞種地毯黃單胞桿菌（X. axonopdis pv. citri）引起的典型病害之一，會(huì)造成柑橘葉子、莖和果實(shí)產(chǎn)生壞死、隆起的病變，導(dǎo)致落葉落果，嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。X. axonopdis pv. citri通過PthA4（一種轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)器）誘導(dǎo)潰瘍易感性基因LOB1的表達(dá)，因此，Peng等利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對晚錦橙易感基因CsLOB1進(jìn)行基因編輯，由于晚錦橙含有3個(gè)拷貝的CsLOB1G等位基因和1個(gè)拷貝的CsLOB1-等位基因，因此，設(shè)計(jì)了5個(gè)sgRNA進(jìn)行編輯，僅對CsLOB1G敲除后明顯增強(qiáng)了對柑橘潰瘍病的抗性［54］。Jia等同樣利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對葡萄柚的雙等位基因TI-LOBP和TI-LLOBP進(jìn)行敲除，雙突變株系的抗性顯著增強(qiáng)［55］。香蕉作為一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，同樣受到黃單胞桿菌屬（Xanthomonas）的危害，其致病菌為香蕉黃單胞菌（X. campestris pv. musacearum，Xcm），目前，只有野蕉（Musa balbisiana）對Xcm具有抗性，而其余栽培種均不具備對Xcm的抗性［56］。有研究顯示，通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對易感基因DMR6進(jìn)行基因編輯，獲得DMR6缺失的突變株系，顯著增強(qiáng)了香蕉對病原細(xì)菌的抗性［57］。

由于傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在編輯雙等位基因存在編輯效率不高的問題，所以甜橙仍然難以產(chǎn)生雙等位/純合突變體。因此，Huang等對CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn)，將35S啟動(dòng)子替換為CsUbi（citrus sinensis ubiquitin，簡稱CsUbi）啟動(dòng)子或CmYLCV（cestrum yellow leaf curling virus，簡稱CmYLCV）啟動(dòng)子，該系統(tǒng)能夠顯著增強(qiáng)甜橙的編輯效率［58］。目前，大多數(shù)報(bào)道主要針對一個(gè)特定基因的sgRNA突變，且大部分突變位點(diǎn)被選擇在基因編碼區(qū)，但由于一些基因含有特殊功能，因此不能采取此方法來進(jìn)行編輯。例如，Xa13基因?yàn)槎喙δ苄曰颍粌H參與調(diào)節(jié)水稻對白葉枯病的抗性，而且還參與花藥的發(fā)育。因此，Li等通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)僅對Xa13基因啟動(dòng)子的部分序列進(jìn)行編輯，獲得了抗水稻白葉枯病但不影響正?；ㄋ幇l(fā)育和結(jié)實(shí)的突變株系［59］。CRISPR/Cas9直接編輯寄主基因提高對細(xì)菌性病害的抗性詳見表2。

3.2 編輯細(xì)菌基因產(chǎn)生抗病性

明確植物病原物致病機(jī)制通常需要挖掘產(chǎn)生致病因子基因的功能，但大多數(shù)分子生物學(xué)技術(shù)僅適用于某種類型致病變種的基因編輯。因此，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的優(yōu)勢可以得到充分體現(xiàn)。假單胞菌屬（Pseudomonas）是自然界種類最多、生態(tài)意義最大的革蘭氏陰性菌群，丁香假單胞菌（P. syringae）是與植物相關(guān)性最大的一類假單胞菌，可引起植物多種病害的發(fā)生。例如，丁香假單胞菌番茄致病變種（P. syringae pv. tomato）和丁香假單胞桿菌菜豆暈疫病致病變種（P. syringae pv. phaseolicola）等。Martí等將Cas9核酸酶和sgRNA融合表達(dá)至pSEVA質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)化至P. syringae pv. tomato和P. syringae pv. phaseolicola，從而達(dá)到基因編輯的目的［60］。黃褐假單胞菌（P. fulva）能夠侵染辣椒、番茄、茄子、馬鈴薯等多種植物，Zhang等基于HDR和噬菌體λ-Red重組系統(tǒng)，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)開發(fā)了一種高效便捷的P. fulva基因編輯方法，并且編輯效率可達(dá)100%［61］。黃單胞桿菌屬（Xanthomonas）是一類重要的植物病原細(xì)菌，產(chǎn)生了多種致病種，主要危害水稻、番茄和柑橘等多種作物。Xoo菌株通常使用高度保守的Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）將毒力效應(yīng)物輸送到水稻細(xì)胞中，并進(jìn)一步抑制宿主的免疫，而對Xoo菌株基因組的編輯將有助于增加對其致病因子的研究。Jiang等利用內(nèi)源性I-C CRISPR/Cas系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了Xoo菌株各種精確、高效的基因編輯，包括缺失、插入、堿基替換等，此系統(tǒng)將有助于植物病原細(xì)菌致病機(jī)制的研究，為宿主-病原物互作研究提供理論基礎(chǔ)［62］。目前，尚未見利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對植物病原細(xì)菌歐氏桿菌屬（Erwinia）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）和棒桿菌屬（Corynebacterium）進(jìn)行相關(guān)研究的報(bào)道。

4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物抗病毒中的應(yīng)用

4.1 編輯寄主基因產(chǎn)生抗病性

以CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)為代表的抗病毒工程成為預(yù)防和控制植物病毒的有效策略，馬鈴薯Y病毒屬是植物病毒中最大的一個(gè)屬，可危害多種作物，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失［63］。真核翻譯起始因子4E（eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E）編碼一個(gè)與甲基化的鳥嘌呤結(jié)合的帽子結(jié)合蛋白，能夠觸發(fā)蛋白質(zhì)翻譯起始復(fù)合物的組裝，是雙子葉植物應(yīng)對馬鈴薯Y病毒屬（potato virus Y，PVY）的一個(gè)S基因。因此，eIF4E已成為CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)設(shè)計(jì)植物抗病毒的主要靶標(biāo)位點(diǎn)。例如，在番茄中，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對eIF4E1進(jìn)行敲除編輯，顯著增強(qiáng)了番茄植株對辣椒斑駁病毒（pepper mottle virus，簡稱PepMoV）的抗性［64］。在小麥中，為增加對小麥黃花葉病毒（wheat yellow mosaic virus，WYMV）的抗性，同樣利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)對eIF4E進(jìn)行編輯，獲得了抗性株系［65］。煙草不僅是重要的非糧食經(jīng)濟(jì)作物，而且還是一種模式植物，感染馬鈴薯Y病毒后，可造成煙草大量減產(chǎn)，嚴(yán)重影響煙草產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。通過雙sgRNA表達(dá)CRISPR/Cas9系統(tǒng)來敲除煙草中eIF4E基因家族的多個(gè)拷貝，同時(shí)缺失eIF4E1-S、eIF4E1-T、eIF4E2-S和eIF4E2-T能夠增加煙草對PVY的持久抗性［66］。AGO蛋白是重要的抗病毒蛋白之一，其中AGO2的抗病毒機(jī)制尚未明確，因此，Ludman等通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得了AGO2缺失的本氏煙株系，證明AGO2是植物應(yīng)對PVX、TuMV和TCV免疫反應(yīng)的重要組成部分［67］。2014年，中東地區(qū)出現(xiàn)了一種危害番茄的病毒，番茄褐色皺果病毒（tomato brown rugose fruit virus，ToBRFV），并開始在世界范圍內(nèi)迅速傳播，嚴(yán)重威脅了番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。煙草病毒增殖蛋白1（TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION1，TOM1）基因?qū)煵莼ㄈ~病毒的高效復(fù)制起著至關(guān)重要的作用，并且在許多植物中發(fā)現(xiàn)TOM1的同源基因。因此，Ishikawa等利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對TOM1同源基因進(jìn)行敲除，獲得了抗ToBRFV的突變株系［68］。植物bZIP類轉(zhuǎn)錄因子參與植物的生長發(fā)育、激素信號(hào)、抗病性及抗逆性等多種生物脅迫過程，為進(jìn)一步明確bZIP類轉(zhuǎn)錄因子抗病毒機(jī)制，研究人員通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得了NbbZIP28基因突變株系，突變株系與野生型植株相比，農(nóng)藝性狀未發(fā)生顯著變化，但NbbZIP28敲除后導(dǎo)致植株對病毒的敏感性上升［69］。番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）病是番茄的主要病害之一，一些番茄品種攜帶了TYLCV的易感基因SlPelo，因此，Pramanik等通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在優(yōu)質(zhì)番茄品種BN-86中，獲得了SlPelo基因的敲除株系，以提高番茄的抗病性［70］。CRISPR/Cas9直接編輯寄主基因提高對病毒性病害的抗性詳見表3。

4.2 編輯病毒基因產(chǎn)生抗病性

CRISPR/Cas9不僅能夠編輯寄主基因來提高抗病毒能力，而且可以直接編輯病毒基因來增強(qiáng)植物對病毒的抗性。例如，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)編輯衣殼蛋白（CP）、復(fù)制蛋白（Rep）、基因間隔區(qū)域（IR）和一些開放閱讀框（ORF）等病毒相關(guān)結(jié)構(gòu)來增強(qiáng)植物病毒抗性［71］。木爾坦棉花曲葉病毒（cotton leaf curl multan virus，CLCuMuV）屬于雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus） 能夠引起棉花曲葉病的發(fā)生。通過

構(gòu)建IR和轉(zhuǎn)錄激活蛋白（TrAP）雙sgRNA的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，突變株系對CLCuMuV的抗性顯著增強(qiáng)，表明該系統(tǒng)可應(yīng)用于抗DNA病毒植物株系的選育，為抗植物雙生病毒科病毒提供新策略［72］。為增加CRISPR/Cas9系統(tǒng)的穩(wěn)定性，Ghorbani等構(gòu)建了由rgsCaM啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cas9的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，以番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）的CP和IR為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)sgRNA，與野生型相比，對TYLCV的抗性顯著增強(qiáng)，并且以rgsCaM啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Cas9效率顯著高于傳統(tǒng)的35S啟動(dòng)子［73］。Ali等則基于TYLCV的CP、Rep和IR設(shè)計(jì)了3種sgRNA，結(jié)果顯示這3種sgRNA均減少了煙草中病毒的積累，但基于IR設(shè)計(jì)的sgRNA效果更加明顯［74］。屬于雙生病毒科（Geminiviridae）曲頂病毒屬（Curtovirus）的甜菜曲頂病毒 （beet severe curly top virus，簡稱BSCTV）也危害多種作物。Ji等以CP和Rep為靶標(biāo)設(shè)計(jì)sgRNA，在擬南芥和本氏煙中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，BSCTV侵染后，過表達(dá)植株表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗病毒能力［75］。有研究報(bào)道，長基因間隔區(qū)（long intergenic region，LIR）也被當(dāng)作提高植物抗雙生病毒設(shè)計(jì)sgRNA的靶標(biāo)位點(diǎn)，在煙草中瞬時(shí)表達(dá)后，接種菜豆黃矮病毒（bean yellow dwarf virus，BeYDV），病毒的拷貝數(shù)和癥狀明顯減弱［76］。為提高植物抗小麥矮縮病毒（wheat dwarf virus，WDV）的能力，研究人員針對WDV基因組的不同片段，設(shè)計(jì)了4個(gè)sgRNA，分別是MP 3′端和CP 5′端（重疊ORF）、Rep/RepA 5′端、LIR和Rep 3′端，突變株系的農(nóng)藝性狀未發(fā)生變化，但抗WDV的能力顯著增強(qiáng)［77］。Malik等基于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，將靶向保守基因組區(qū)域的各種gRNA構(gòu)建體單獨(dú)或串聯(lián)（3個(gè)構(gòu)建體一起）用于觸發(fā)對鷹嘴豆褪綠矮縮病毒（chickpea chlorotic dwarf virus，CpCDV）的抗性，結(jié)果顯示，基于CpCDV基因組的LIR、Rep和RepA設(shè)計(jì)的sgRNA串聯(lián)構(gòu)成的CRISPR/Cas9系統(tǒng)對CpCDV的抗性最強(qiáng)［78］。

相對于DNA病毒，RNA病毒在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的危害更大。例如，煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，簡稱TMV）和黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，簡稱CMV），可對多種作物產(chǎn)生危害。然而利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)編輯RNA病毒的報(bào)道較少。Zhang等以CMV基因組的開放閱讀框1a（open reading frames 1a，ORF 1a）、ORF CP和3′端非編碼區(qū) （3′ untranslated regions，3′ UTRs）為靶標(biāo)設(shè)計(jì)sgRNA，在本氏煙和擬南芥中轉(zhuǎn)化后，表現(xiàn)出抗TMV和CMV的能力，并且后代植物同樣表現(xiàn)出抗性，表明這種抗性是可遺傳的［79］。葡萄卷葉相關(guān)病毒（grapevine leafroll-associated virus 3，GLRaV-3）是葡萄卷葉病的致病因子之一，由于缺乏天然抗性資源，因此，關(guān)于葡萄抗GLRaV-3的研究相對有限。Jiao等則利用FnCas9以GLRaV-3的5 ku 蛋白（5 ku protein，p5）、熱休克蛋白70同系物（Heat shock protein 70 homolog，Hsp70h）、熱休克蛋白90同系物（Hsp90h）、CP以及次外殼蛋白（CPm）為靶標(biāo)設(shè)計(jì)sgRNA，結(jié)果表明，Hsp70h和CP表現(xiàn)出最強(qiáng)抗性，能夠有效賦予葡萄抗GLRaV-3特性［80］。CRISPR/Cas9編輯病毒基因使植物產(chǎn)生抗病性詳見表4。

5 討論與展望

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)自問世以來，就備受關(guān)注。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)不僅可以針對植物自身進(jìn)行定向編輯，而且能夠直接編輯真菌、細(xì)菌和病毒等病原物來提高植物抗病性。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在啟動(dòng)子的選擇上，Cas9通常以35S作為啟動(dòng)子，但部分研究為提高啟動(dòng)效率以及特異性也選擇CmYLCV/CsUbi、Ubi4-2、rgsCaM以及2×35S為啟動(dòng)子，sgRNA通常為U6啟動(dòng)子，僅有少部分為U3啟動(dòng)子。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)由于可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)sgRNA的同時(shí)編輯，因此，較其他基因編輯技術(shù)編輯效率高，利用此特點(diǎn)，可以對某些家族基因的多個(gè)基因位點(diǎn)或含有多個(gè)等位基因進(jìn)行編輯，更有利于基因功能研究［66］。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)還存在一個(gè)明顯的優(yōu)勢，就是可以針對基因的某段序列進(jìn)行突變，所以針對某些多功能基因，則可以避免干擾植物正常的發(fā)育。例如，Xa13為多功能性基因，不僅具有隱性抗細(xì)菌性枯萎病的功能，而且還參與花藥的發(fā)育［59］。當(dāng)然，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)也存在一些不足。例如，對靶標(biāo)基因位點(diǎn)和PAM序列有一定的要求。只有靶標(biāo)位點(diǎn)緊鄰PAM序列（通常是PAM序列上游3 bp處），PAM序列為NGG（N為任意堿基）序列時(shí)切割效率最高，對于一些特殊靶標(biāo)基因位點(diǎn)，則會(huì)出現(xiàn)編輯效率不高的現(xiàn)象［16］。無論是對植物本身，還是針對病原物的基因編輯，主要是通過NHEJ途徑敲除靶標(biāo)基因，而通過HDR途徑進(jìn)行基因編輯的則較少，這主要是源于NHEJ在除有絲分裂外的整個(gè)細(xì)胞周期中均比較活躍，HDR僅在S期和G2晚期活躍［21］，因此，在HDR途徑仍要加大研究力度，充分發(fā)揮CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的潛力。

在植物抗真菌方面，主要以編輯寄主基因產(chǎn)生抗病性為主，包括一些易感基因、轉(zhuǎn)錄因子以及一些植物激素調(diào)節(jié)因子，而且以基因敲除為主［81］。多數(shù)研究顯示，轉(zhuǎn)基因植物農(nóng)藝性狀未發(fā)生變化，但并未經(jīng)過多代驗(yàn)證，仍存在一些風(fēng)險(xiǎn)，部分研究表明，對某些基因編輯后，造成農(nóng)藝性狀發(fā)生變化。例如，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)將StSR4基因敲除后，突變株系盡管對晚疫病的抗性有所提高，但同時(shí)也導(dǎo)致馬鈴薯出現(xiàn)矮化的現(xiàn)象［35］。在植物抗細(xì)菌方面，針對植物基因的編輯主要是以假單胞桿菌屬、歐文氏桿菌屬和黃單胞桿菌屬為主，對于細(xì)菌基因組的編輯主要以假單胞桿菌屬和黃單胞桿菌屬為主，目前，尚未見利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)對植物病原細(xì)菌歐氏桿菌屬、土壤桿菌屬和棒桿菌屬進(jìn)行相關(guān)研究的報(bào)道。與植物真菌和細(xì)菌不同的是，關(guān)于植物抗病毒的研究，對于病毒本身的編輯要多于寄主植物。在編輯寄主植物時(shí)，圍繞eIF4E進(jìn)行的相關(guān)研究較多。例如，關(guān)于PepMoV、WYMV以及PVY等多個(gè)病毒的研究中均以eIF4E為靶標(biāo)設(shè)計(jì)sgRNA［64-66］。雖然相對于DNA病毒，RNA病毒在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中造成的危害更大，但是利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對于病毒的研究則是以DNA病毒為主，針對RNA病毒基因組的研究較少。

作為一種強(qiáng)大而通用的基因編輯和調(diào)控工具，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)已經(jīng)在加速各個(gè)科學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，并成為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的源泉［82］。目前，基于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的植物抗病性研究取得了一定的成果，但多數(shù)研究以室內(nèi)研究為主，在田間條件下的抗病性并未經(jīng)過驗(yàn)證，在未來應(yīng)該要加強(qiáng)田間試驗(yàn)，選育穩(wěn)定遺傳抗病性，且不影響農(nóng)藝性狀的優(yōu)良品系。許多科學(xué)家認(rèn)為，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)只涉及到植物本身DNA的變化，而不設(shè)計(jì)外源基因的插入，應(yīng)該是屬于誘變，但歐盟法院作出判決，認(rèn)為使用基因組編輯技術(shù)創(chuàng)造的生物將被監(jiān)管為轉(zhuǎn)基因生物，而此決定勢必會(huì)影響相關(guān)研究的積極性［83］。雖然CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)存在一些不足和挑戰(zhàn)，但在未來仍然是作物抗病育種研究的優(yōu)勢技術(shù)，特別是在野生抗性資源稀缺時(shí)，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)誘導(dǎo)的突變將為植物抗病育種提供多種選擇，促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

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