苗 圃，劉 暢，張夢(mèng)丹，陳玉國(guó)，苗淑月，白靜科，李淑君，劉劍君，李小杰*

1. 河南省煙草公司洛陽(yáng)市公司，河南省洛陽(yáng)市洛龍區(qū)開元大道246 號(hào) 471000

2. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所 煙草行業(yè)黃淮煙區(qū)煙草病蟲害綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南省許昌市魏都區(qū)永昌東路260 號(hào) 461000

3. 中國(guó)煙草總公司河南省公司，鄭州市鄭東新區(qū)商務(wù)外環(huán)15 號(hào) 450046

絲囊霉（Aphanomyces）屬于鞭毛菌亞門、卵菌綱、水霉目、水霉科中的一屬，可引起稻苗綿腐病和魚類水霉?。?-2］。目前國(guó)內(nèi)外均有絲囊霉屬引起植物根莖部病害的相關(guān)報(bào)道。1940 年Weimer 發(fā)現(xiàn)根腐絲囊霉菌（Aphanomyces euteiches）可引起箭筈豌豆根腐?。?］。1974 年，在日本首次發(fā)現(xiàn)鳶尾絲囊霉（Aphanomyces iridis Ichitani & Kodama）可引起荷蘭鳶尾基腐病［4］。在我國(guó)福建、青海和甘肅地區(qū)，發(fā)現(xiàn)根腐絲囊霉（Aphanomyces euteiches Drechs）可引起豌豆的根腐?。?-7］。李小杰等［8］初次報(bào)道了由鳶尾絲囊霉（Aphanomyces iridis）引起的煙草漂浮苗根腐病是煙草上的一種新病害，近年來(lái)在河南洛陽(yáng)煙區(qū)部分苗床發(fā)生嚴(yán)重。該病原可導(dǎo)致煙苗生長(zhǎng)緩慢、葉色發(fā)黃、根部呈現(xiàn)褐色變軟壞死，嚴(yán)重影響煙苗質(zhì)量。目前對(duì)于植物病害的防治仍以化學(xué)防治為主，針對(duì)煙草根莖部病害化學(xué)藥劑篩選的研究已有相關(guān)報(bào)道。常劍波等［9］篩選出了對(duì)煙草黑脛病防效較好的化學(xué)藥劑30%霜霉·嘧菌酯、50%苯醚甲環(huán)唑·烯酰嗎啉、50%吲唑磺菌胺和8%辛菌胺醋酸鹽。其中，30%霜霉·嘧菌酯防效最好，田間防效達(dá)70.2%；姚晨虓等［10］測(cè)定了10種內(nèi)吸性化學(xué)殺菌對(duì)煙草根腐病主要致病菌尖孢鐮刀菌的室內(nèi)活性。其中，500 g/L 氟啶胺SC、25%戊唑醇WP、40%苯醚甲環(huán)唑SC毒性較強(qiáng)且具有較好的盆栽防效。目前針對(duì)絲囊霉根腐病防治藥劑的篩選研究報(bào)道相對(duì)較少。劉鐵斌等［11］研究表明，噁霉靈對(duì)鐮刀菌（Fusarium spp.）、腐霉菌（Pythium spp.）、絲囊霉菌（Aphanomyces spp.）等多種病原菌具有較好的抑制作用，但有關(guān)煙草鳶尾絲囊霉根腐病防治藥劑篩選的研究還鮮見報(bào)道。為此，對(duì)煙草苗期鳶尾絲囊霉根腐病開展了防治藥劑的篩選研究，通過漂浮苗接種試驗(yàn)驗(yàn)證其防效并進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)，旨在為該病害的有效防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑

供試藥劑為70%甲基硫菌靈可濕性粉劑［WP，日本日友商社（香港）有限公司］；58%甲霜靈·錳鋅可濕性粉劑（WP，浙江東風(fēng)化工有限公司）；50%氯溴異氰尿酸可溶性粉劑（SP，江蘇克勝集團(tuán)股份有限公司）；20%辛菌胺鹽酸鹽水劑（AS，濰坊萬(wàn)勝生物農(nóng)藥有限公司）；30%霜霉·嘧菌酯懸浮劑（SC，四川利爾作物科學(xué)有限公司）；80%烯酰嗎啉水分散粒劑（WG，天津市施普樂農(nóng)藥技術(shù)發(fā)展有限公司）；48%霜霉·絡(luò)氨酮水劑（AS，四川百事東旺生物科技有限公司）。

1.2 供試菌株及煙草品種

靶標(biāo)病原菌為鳶尾絲囊霉（Aphanomyces iridis），由本實(shí)驗(yàn)室提供并保存。供試煙草品種為NC89。

1.3 不同藥劑對(duì)煙草鳶尾絲囊霉的抑制作用及室內(nèi)毒力測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法［10］測(cè)定了70%甲基硫菌靈WP、58%甲霜靈·錳鋅WP、50%氯溴異氰尿酸SP、20%辛菌胺鹽酸鹽AS、30%霜霉·嘧菌酯SC、80%烯酰嗎啉WG 和48%霜霉·絡(luò)氨酮AS 7 種化學(xué)殺菌劑對(duì)鳶尾絲囊霉菌絲生長(zhǎng)的抑制效果。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，制備不同質(zhì)量濃度梯度的含藥劑PDA平板，以含無(wú)菌水處理為空白對(duì)照。選用直徑為5 mm 的打孔器，打取培養(yǎng)3 d 的病原菌菌落邊緣制備菌餅，用挑針挑取菌餅分別接種于不同質(zhì)量濃度的含藥平板中心，每組處理重復(fù)3次，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。待對(duì)照處理的菌落剛長(zhǎng)滿平板時(shí)，利用十字交叉法測(cè)量各處理菌落生長(zhǎng)直徑，計(jì)算出各處理對(duì)病原菌的相對(duì)抑制率，并求出有效中濃度（EC50）值。

相對(duì)抑制率＝（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）／（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）×100%（1）

1.4 不同藥劑對(duì)煙草鳶尾絲囊霉的室內(nèi)防效測(cè)定

采用煙草漂浮育苗水培接種法，將生長(zhǎng)至4葉期的NC89 煙草幼苗置于無(wú)菌托盤（71 cm×45 cm）中，每盤45 株煙苗，每株煙苗灌根接種鳶尾絲囊霉懸液（6.0×107cfu/mL）0.8 mL。選用對(duì)鳶尾絲囊霉抑制效果較好的化學(xué)殺菌劑30%霜霉·嘧菌酯SC600 倍液、48%霜霉·絡(luò)氨酮AS1200倍液和58%甲霜靈·錳鋅WP550 倍液分別進(jìn)行灌根處理，以無(wú)菌水灌根處理為對(duì)照，每株灌根1 mL。以不接種鳶尾絲囊霉為空白對(duì)照，每個(gè)處理45 株煙苗，3 次重復(fù)。置于25 ℃、黑暗/光照為12 h/12 h 的人工氣候箱中培養(yǎng)，對(duì)照開始發(fā)病時(shí)進(jìn)行調(diào)查。參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23222—2008［12］中煙草黑脛病的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，自行制定了鳶尾絲囊霉根腐病的分級(jí)方法進(jìn)行病害調(diào)查和嚴(yán)重度分級(jí)，0 級(jí)：全株無(wú)病，植株生長(zhǎng)正常；1 級(jí)：1/3以下葉片輕微萎蔫，或出現(xiàn)1/3 以下葉片黃葉；3 級(jí)：1/3至1/2葉片輕度萎蔫，或出現(xiàn)1/3至1/2葉片黃葉；5 級(jí)：1/2 至2/3 葉片萎蔫，或出現(xiàn)1/2 至2/3 葉片黃葉及葉片腐爛；7級(jí)：2/3以上葉片萎蔫，或出現(xiàn)2/3以上葉片黃葉及葉片腐爛；9級(jí)：病株基本枯死。每隔2 d調(diào)查1次，直至發(fā)病情況穩(wěn)定，計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)和相對(duì)防效。

1.5 化學(xué)藥劑對(duì)煙草幼苗的安全性評(píng)價(jià)

通過室內(nèi)防效測(cè)定選出對(duì)鳶尾絲囊霉防治效果好的藥劑，按藥劑推薦濃度用滅菌水配制成藥液，即30%霜霉·嘧菌酯SC600 倍液、48%霜霉·絡(luò)氨酮AS1200倍液分別噴霧處理煙草幼苗葉片和根部，以無(wú)菌水噴霧處理為對(duì)照。分別于施藥后1、3、5、7、9、11 d觀察煙苗生長(zhǎng)情況，確定其是否對(duì)煙苗產(chǎn)生藥害。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，結(jié)合DPS數(shù)據(jù)處理軟件，以藥劑濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，相對(duì)抑制率為縱坐標(biāo)，得出毒力回歸方程和相關(guān)系數(shù)r，根據(jù)最小二乘法計(jì)算出EC50和置信區(qū)間等，并比較不同殺菌劑對(duì)鳶尾絲囊霉的抑制作用。利用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行處理間差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學(xué)藥劑對(duì)鳶尾絲囊霉菌絲生長(zhǎng)的影響

如表1、圖1所示，在不同含藥PDA培養(yǎng)基上，鳶尾絲囊霉菌絲的生長(zhǎng)均受到不同程度的抑制。接種后5 d，48%霜霉·絡(luò)氨酮對(duì)鳶尾絲囊霉的抑菌效果最好，當(dāng)其質(zhì)量濃度為2.00 μg/mL 時(shí)，抑菌率可達(dá)100%；其次是30%霜霉·嘧菌酯和20%辛菌胺鹽酸鹽，當(dāng)其質(zhì)量濃度分別為6.24 μg/mL和64 μg/mL時(shí)，抑菌率分別可達(dá)88.03%和92.35%；80%烯酰嗎啉和70%甲基硫菌靈的抑菌效果較差，當(dāng)其質(zhì)量濃度分別為4 000 μg/mL 和1 400 μg/mL 時(shí)，其抑菌率僅為59.21%和16.14%。表明除70%甲基硫菌靈和80%烯酰嗎啉外，其余5種化學(xué)藥劑對(duì)鳶尾絲囊霉均具有較好的抑菌效果，且隨著藥劑質(zhì)量濃度的增加，對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用越強(qiáng)，抑菌率越高。

圖1 30%霜霉·嘧菌酯對(duì)鳶尾絲囊霉的平板抑菌效果Fig.1 Plate antifungal effect of 30% propamocarbazoxystrobin on A. iridis

表1 7種殺菌劑對(duì)鳶尾絲囊霉菌絲生長(zhǎng)的影響Tab.1 Effects of seven fungicides on mycelial growth of A. iridis

2.2 化學(xué)藥劑對(duì)鳶尾絲囊霉的毒力分析

室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果（表2）表明，48%霜霉·絡(luò)氨酮和30%霜霉·嘧菌酯對(duì)鳶尾絲囊霉的抑制作用最強(qiáng)，其EC50值分別為0.255μg/mL和0.367μg/mL；其次為20%辛菌胺鹽酸鹽、58%甲霜靈·錳鋅、50%氯溴異氰尿酸和80%烯酰嗎啉，其EC50值分別為14.107、37.495、148.902和2 066.769μg/mL。6種殺菌劑的相關(guān)系數(shù)在0.938 5～0.997 5之間，說(shuō)明這6種殺菌劑對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用與藥劑的濃度呈正相關(guān)。70%甲基硫菌靈的抑菌效果最差，EC50為無(wú)窮大，表明鳶尾絲囊霉對(duì)該藥劑不敏感。

表2 7種殺菌劑對(duì)鳶尾絲囊霉的室內(nèi)毒力測(cè)定Tab.2 Indoor toxicity testing of seven fungicides against A. iridis

2.3 化學(xué)藥劑對(duì)鳶尾絲囊霉根腐病的室內(nèi)防效

煙草漂浮苗接種試驗(yàn)結(jié)果表明，接種鳶尾絲囊霉后5 d，30%霜霉·嘧菌酯和48%霜霉·絡(luò)氨酮處理的煙苗發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著低于無(wú)菌水接種對(duì)照和58%甲霜靈·錳鋅處理，對(duì)鳶尾絲囊霉引起的煙苗根腐病具有很好的防效，均可達(dá)90%以上；58%甲霜靈·錳鋅的防效較差，僅有36.29%（表3）。接種后10 d，30%霜霉·嘧菌酯和48%霜霉·絡(luò)氨酮的防效仍可達(dá)86%以上，而58%甲霜靈·錳鋅的防效僅有13.01%（表4，圖2b～e）?？瞻讓?duì)照煙苗長(zhǎng)勢(shì)正常（圖2a）。

圖2 不同藥劑處理的煙苗發(fā)病癥狀Fig.2 Symptoms of tobacco seedlings treated with different fungicides

表3 不同藥劑處理的煙苗發(fā)病情況（接種后5 d）Tab.3 Incidences of tobacco seedlings treated with different fungicides（5 days after inoculation）

表4 不同藥劑處理的煙苗發(fā)病情況（接種后10 d）Tab.4 Incidences of tobacco seedlings treated with different fungicides（10 days after inoculation）

2.4 安全性評(píng)價(jià)

試驗(yàn)結(jié)果表明，48%霜霉·絡(luò)氨酮噴霧處理對(duì)煙苗的影響較大，處理后1 d煙苗葉片開始出現(xiàn)水漬狀壞死斑，隨著時(shí)間推移水漬狀壞死加重，處理后11 d所有煙苗葉片均表現(xiàn)出壞死癥狀，藥害現(xiàn)象明顯（圖3c）。30%霜霉·嘧菌酯噴霧處理對(duì)煙苗生長(zhǎng)未產(chǎn)生任何影響，與無(wú)菌水對(duì)照長(zhǎng)勢(shì)一致（圖3a、b），無(wú)藥害現(xiàn)象產(chǎn)生，安全性好。

圖3 不同藥劑處理對(duì)煙苗的影響Fig.3 Effects of spraying treatments with different fungicides on tobacco seedlings

3 討論

嘧菌酯（azoxystrobin）屬于甲氧基丙烯酸酯類新型抗菌劑，具有殺菌譜廣、滲透性強(qiáng)、持效期長(zhǎng)、可復(fù)配等特點(diǎn)，可有效抑制孢子萌發(fā)和菌絲的生長(zhǎng)，對(duì)幾乎所有的真菌病害如白粉病、霜霉病、黑星病、稻瘟病等均表現(xiàn)出良好的防治效果，而且與現(xiàn)有殺菌劑均無(wú)交互抗性［13-15］。有研究表明，自然條件下嘧菌酯在水、土壤和植株中消解較快，不會(huì)造成累積性殘留污染［16-17］。本研究中通過室內(nèi)毒力測(cè)定，篩選出對(duì)鳶尾絲囊霉抑制作用較強(qiáng)的化學(xué)殺菌劑48%霜霉·絡(luò)氨酮、30%霜霉·嘧菌酯、20%辛菌胺鹽酸鹽和58%甲霜靈·錳鋅。其中，30%霜霉·嘧菌酯對(duì)鳶尾絲囊霉引起的煙苗根腐病防效較好且安全性高，這與前人研究結(jié)果基本一致［18-19］。但針對(duì)不同病原菌，其效果不同。因此，生產(chǎn)中可使用30%霜霉·嘧菌酯來(lái)預(yù)防煙草苗床期絲囊霉根腐病。但盡量避免長(zhǎng)期單一使用嘧菌酯單劑，要選擇其復(fù)配藥劑，以延長(zhǎng)藥劑使用壽命，保證殺菌效果。

化學(xué)防治仍是目前防治植物病害的主要措施之一，但長(zhǎng)期大量使用單一藥劑，易使病原菌產(chǎn)生抗藥性。過去常使用甲基硫菌靈防治植物多種真菌病害，在田間表現(xiàn)出了良好的防治效果［20-21］，但因長(zhǎng)期使用已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有部分植物病原真菌對(duì)甲基硫菌靈產(chǎn)生了抗性［22-23］。本研究結(jié)果表明，鳶尾絲囊霉對(duì)70%甲基硫菌靈藥劑非常不敏感，因此生產(chǎn)中應(yīng)避免使用該藥劑來(lái)防控由鳶尾絲囊霉引起的植物病害，但鳶尾絲囊霉是否對(duì)該藥劑產(chǎn)生了抗性還需進(jìn)一步研究。同時(shí)，下一步將針對(duì)鳶尾絲囊霉篩選高效生防菌株，在有效防控病害的同時(shí)，減少化學(xué)殺菌劑的使用，為煙苗的健康安全生產(chǎn)提供保障。

4 結(jié)論

通過室內(nèi)毒力測(cè)定及漂浮苗接種試驗(yàn)，篩選出對(duì)煙草鳶尾絲囊霉毒力強(qiáng)、防效高且安全性好的新型殺菌劑30%霜霉·嘧菌酯，可用于預(yù)防煙草苗床期絲囊霉根腐病。