許子鑫，郭玉寶，魏 秦，劉昕煜，王馨雨

（安徽工程大學生物與食品工程學院，蕪湖 241000）

我國是世界上稻谷產(chǎn)量較高的國家之一，年產(chǎn)量高達2.12 億t［1］。2021 年全球約產(chǎn)出5.19 億t大米［2］，預計到2030 年大米產(chǎn)量還會增加40%［3］。淀粉、蛋白質和脂質是稻米的主要化學組分，總質量分數(shù)為85% ～90%［4］。精白米中蛋白質質量分數(shù)為8%左右，而糙米中蛋白質質量分數(shù)為13%左右［5］。蛋白質是稻米中的第二大組分，其對稻米食用品質的形成及儲藏期間的品質變化具有明顯影響，蛋白質含量對稻米的蒸煮品質與感官特性的影響也尤為重要。

稻米中大部分的儲藏蛋白，存在于亞細胞結構蛋白體中，蛋白體直徑通常在0.5 ～4.0 μm之間［6］。蛋白體以2 種形式存在，即PB －Ⅰ和PB －Ⅱ［7］，除儲藏蛋白外還包括少量植酸、植物凝集素、一些酶及無機鹽離子如K2＋、Mg2＋等［6］。PB － I 具有環(huán)狀結構，呈球形，大小在0.5 ～2.0 μm 之間，主要組成是醇溶蛋白；PB －Ⅱ具有晶體結構，呈圓形、橢圓形或不規(guī)則形狀，大小在2.5 ～4.0 μm之間，主要組成是谷蛋白和球蛋白。稻米中的蛋白體是由質體、內質網(wǎng)及液泡發(fā)育而來，蛋白體的形成和發(fā)育受儲藏蛋白質組分、植物凝集素及一些細胞器的調控［6］。成熟水稻籽粒中的蛋白體主要存在于3 個區(qū)域：胚乳糊粉層、亞糊粉層和胚［6］。胚乳糊粉層的蛋白體和胚中的一些蛋白體含有球狀晶體，而亞糊粉層中的蛋白體則不含球狀晶體［6］。

蛋白體的分離方法主要有高壓均質法［8］和蔗糖密度梯度離心法［9］。高壓均質機法是將浸泡過的米粉微細化至低于5 μm，再通過高速離心分離蛋白，此方法要求較高的均質壓力（200 ～250 kg／cm2）［8］，淀粉顆粒容易破裂，不利于后續(xù)蛋白體的純化。蔗糖密度梯度離心法分離蛋白體，原料是未成熟稻米穎果，是未經(jīng)烘干的濕基形式，蛋白體與淀粉之間易出現(xiàn)結合黏連，且分離過程會消耗大量蔗糖，分離效率較低，通常在作物生理學中用于研究不同耕作條件下蛋白質對稻米食用品質和營養(yǎng)價值的影響［8－10］，但在食品加工領域從成熟的穎果即稻米中分離蛋白體還鮮有報道。

鑒于目前蛋白體分離效率較低且步驟繁瑣，研究以富含蛋白體的糙米為原料，建立利用稀堿分離蛋白體的方法，然后采用適當?shù)姆椒▽Ψ蛛x的蛋白體進行純化，最后對獲得的蛋白體形態(tài)和結構進行鑒定和表征，為研究蛋白體影響稻米品質的形成提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糙米：鎮(zhèn)稻88，市售。氫氧化鈉、氯化鈣均為分析純。

1.2 儀器與設備

LW200CA 光學顯微鏡，DM2500LED 熒光顯微鏡，S －4800SEM 冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡，MS －2000 激光粒度分析儀，BIO － RAD 通用電泳儀，D8 FOCUSX－射線衍射儀，IRPretige －21 傅里葉變換紅外光譜儀，Thermo Fisher DXRxi 顯微拉曼成像光譜儀，JW－3021H 高速離心機，JA －2603N 電子天平，JK－100DB數(shù)控超聲波清洗器，SHZ－D（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵，LD －T400 高速萬能粉碎機，MPLK －707 數(shù)顯集熱式磁力攪拌器，125 μm標準檢驗篩120目，LGJ－12 真空冷凍干燥機，0.1、5.0 μm尼龍微孔濾膜。

1.3 實驗方法

1.3.1 蛋白體分離和純化方法

蛋白體分離方法：將糙米粉碎，過120目（125 μm）篩，收集篩下物；篩上物繼續(xù)粉碎，直至全部通過120目篩；將篩下物混合均勻裝入自封口袋，存于4 ℃?zhèn)溆谩７Q取5 g 糙米粉于100 mL 三角燒瓶中，按液料比6∶1（mL／g）加入10 mmol／L的NaOH溶液30 mL，用玻璃棒攪拌均勻，于40 ℃下恒溫磁力攪拌120 min。然后，在功率100 W、25 ℃下超聲30 min。將所得混合物混勻，取少量用于測定蛋白體的體積分數(shù)；向其余混合物中加入40 mL 蒸餾水并攪拌均勻，之后在12 000 r／min 下離心20 min，分別收集上清液、沉淀表層黃軟物質和下層白色沉淀。上清液中主要是蛋白體，體積分數(shù)73.40%，其他為淀粉等雜質；黃軟物中蛋白體較少，體積分數(shù)僅5.81%，其他主要是淀粉；下層白色沉淀中只有極少夾帶蛋白體殘留，體積分數(shù)僅0.12%。

蛋白體體積分數(shù)的測定：取少量超聲處理后的含蛋白體混合物，采用激光粒度分析儀測定粒度分布，獲得蛋白體的體積分數(shù)。測定條件：分散劑為水，儀器轉速為1 800 r／min，超聲分散，加樣使遮光度為10% ～20%之間，每個樣品平行測定5次，取平均值。

蛋白體純化方法：將收集的上清液和黃軟物質分別進行處理。上清液（或黃軟物質稀釋后）先用5 μm尼龍濾膜抽濾，取膜下物；再用0.10 μm尼龍濾膜抽濾，將膜上物轉移至離心管中，然后加入30 mL 4.0 mol／L 的CaCl2溶液，在室溫下糊化20 min［11］。之后在12 000 r／min下離心20 min，取上清液，再用0.10 μm尼龍濾膜抽濾，將膜上物轉移至培養(yǎng)皿中，用2 層保鮮膜密封，置于－18 ℃冷凍24 h 后凍干，稱質量后裝入自封口袋，存于4 ℃下備用。

1.3.2 蛋白體分離條件優(yōu)化

1.3.2.1 單因素實驗

為了提高蛋白體的分離效率，以蛋白體的體積分數(shù)為指標，分別研究堿液濃度、液料比、攪拌時間、超聲功率、超聲溫度和超聲時間對蛋白體分離的影響。單因素實驗的基本條件為：堿液濃度10 mmol／L、液料比6 mL／g、攪拌時間120 min、超聲功率100 W、超聲溫度25 ℃和超聲時間30 min。固定基本條件不變，分別考察堿液濃度（0、5、10、15、20 mmol／L）、液料比（6、8、10、12、14 mL／g）、攪拌時間（30、60、90、120、150 min）、超聲功率（60、70、80、90、100 W）、超聲溫度（25、35、45、55、65 ℃）及超聲時間（0、10、20、30、40、50 min）對蛋白體分離的影響。

1.3.2.2 響應面優(yōu)化

根據(jù)單因素實驗結果，選擇影響較大的4 個單因素，進行三水平四因素Box － Behnken 響應面優(yōu)化，以蛋白體體積分數(shù)為考察指標，進行二次多項式回歸擬合及優(yōu)化分析。實驗設計因素及水平見表1。

表1 Box－Behnken實驗設計因素水平表

1.3.3 蛋白體表征方法

1.3.3.1 普通光學顯微觀察

取少許凍干樣品于潔凈載玻片上，滴加1 滴蒸餾水，浸潤后，加蓋玻片。將0.1%考馬斯亮藍染液從一側滴入，用吸水紙從另一側吸出，使考馬斯亮藍染液充分浸漬樣品，染色2 min。用蒸餾水洗去多余考馬斯亮藍染液，反復多次，直至流出水為無色，置于光學顯微鏡下進行觀察。

1.3.3.2 熒光顯微形態(tài)觀察

取少許凍干樣品于載玻片上，滴加1 滴蒸餾水，加蓋玻片。打開熒光光源，將濾光片調節(jié)器調至藍色熒光位置，利用普通光與熒光在40 倍物鏡下進行觀察。

1.3.3.3 掃描電鏡形態(tài)觀察

取少許凍干樣品，撒在雙面導電膠上，粘于樣品臺，噴金10 nm，在加速電壓5 kV下拍照。

1.3.3.4 十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）

采用Laemmli 電泳系統(tǒng)，分離膠質量分數(shù)為15%，濃縮膠質量分數(shù)為5%［12］，蛋白經(jīng)還原性樣品緩沖液（含巰基乙醇和SDS）處理。電泳結束后，用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3.3.5 X－射線衍射（XRD）分析

1.3.3.6 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）分析

紅外光譜分析采用溴化鉀壓片法［13］：將蛋白體樣品與干燥的溴化鉀按質量比1∶100 混合后研磨至足夠細，在壓片機上以10 T／cm壓片，直至得到的壓片為均勻無裂痕且呈半透明狀。在紅外光譜儀上掃描，波數(shù)500 ～4 000 cm－1，分辨率2 cm－1，掃描512次獲得疊加譜，實驗重復3 次，譜圖用Omnic 8.0分析。

1.3.3.7 蛋白體的拉曼光譜分析

蛋白體的拉曼光譜分析參照Guo 等［13］的方法，測定條件：激光波長514.5 nm，功率20 mW，到達樣品的光斑直徑約1 μm。測前，激光波長在520.7 nm處以單晶硅校正。掃描時間60 s，掃描波數(shù)范圍200 ～4 000 cm－1，分辨率為2 cm－1，樣品掃描速度為120 cm－1／min，每1 cm－1記錄數(shù)據(jù)。50 倍長焦鏡頭（LMP），在背散射方向收集拉曼信號，至少3 個不同的樣品點被測試并記錄。所獲得數(shù)據(jù)采用Omnic 8.0 軟件進行基線校正、平滑（Nine － point golay －savitzky procedure）。因實際獲得的拉曼光譜強度不僅與物質含量有關，還受到激光器強度、拉曼探頭與樣品相對距離、光纖傳輸效率、檢測器量子效率等其他因素的影響，因此以苯丙氨酸峰為基準進行歸一化處理進行強度校正。

1.4 數(shù)據(jù)處理

蛋白體體積分數(shù)以平均值±標準差來表示。數(shù)據(jù)處理在SPSS 2.0 軟件中進行，單因素方差分析采用鄧肯多重范圍檢驗，響應面數(shù)據(jù)處理采用Designexpert 8.0.6 軟件，繪圖采用OriginPro 9 軟件。

2 結果與分析

2.1 蛋白體分離單因素實驗

由圖1 可知，隨著氫氧化鈉溶液濃度的增加，蛋白體體積分數(shù)先增加后略有降低；當堿液濃度為15 mmol／L時，蛋白體體積分數(shù)最大。這可能是氫氧化鈉溶液濃度的增加，促進了蛋白體與淀粉顆粒之間的分離，使更多蛋白體成為懸浮狀態(tài)。隨著氫氧化鈉溶液濃度繼續(xù)增加，蛋白體體積分數(shù)有所降低，可能是蛋白體在較高濃度的堿液中會逐漸溶解成為蛋白質溶液。選擇氫氧化鈉溶液濃度為15 mmol／L 較為合適。

蘇聯(lián)的官僚主義是在斯大林時期的政治經(jīng)濟體制條件下形成和滋長起來的。當然不能說所有的各級領導人都變成了墨守成規(guī)的官僚主義者，但也應該看到，患有不同程度官僚主義習氣的人，卻是厚厚的一層。所以，戈爾巴喬夫執(zhí)政以來，一再抨擊官僚主義是有道理的，它確實成了阻礙機制的主要社會力量。

圖1 堿液濃度、液料比、攪拌時間、超聲功率、超聲溫度、超聲時間對蛋白體體積分數(shù)的影響

隨著液料比的增大，蛋白體體積分數(shù)呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢；當液料比為12 mL／g 時，蛋白體體積分數(shù)最高。這可能是因為當液料比較低時，蛋白體與淀粉分離程度較低；當液料比過大時，分離的蛋白體可能會部分發(fā)生溶解，不利于蛋白體的獲取。因此選擇液料比為12 mL／g較為合適。

隨著攪拌時間的增加，蛋白體體積分數(shù)先緩慢增加后略有下降。當攪拌時間為90 min 時，蛋白體體積分數(shù)最高。這可能是因為，起初隨著攪拌時間的增加，有利于蛋白體與淀粉顆粒之間的分離；但攪拌時間過長，蛋白體發(fā)生一定程度的溶解，體積分數(shù)有所下降，但總體變化幅度不大。因此本因素不進入響應面，選擇攪拌時間為90 min。

隨著超聲功率的增大，蛋白體體積分數(shù)呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，但超過90 W時基本穩(wěn)定，90 W時對應的蛋白體體積分數(shù)最高。這可能是因為超聲功率提高，有助于蛋白體與淀粉顆粒之間的分離；但超聲功率過大時，又可能對蛋白體的溶解具有促進作用。因此選擇超聲功率為90 W較好。

隨著超聲溫度的增加，蛋白體體積分數(shù)先緩慢增加，然后逐漸下降，最后急劇下降。當超聲溫度為35 ℃時，蛋白體體積分數(shù)最大。這可能是因為起初超聲溫度升高，促進了蛋白體與淀粉顆粒間的分離，蛋白體進入堿液的數(shù)量增多；但隨著超聲溫度的繼續(xù)升高，蛋白體的溶解性增加，溶出的蛋白體部分變成溶解狀態(tài)進入溶液；溫度達到65 ℃時，可能因淀粉顆粒在此溫度下溶脹較快而包裹了蛋白體，不利于蛋白體與淀粉的分離。除了65 ℃下蛋白體體積分數(shù)很低外，其他溫度下變化幅度不大，因此該因素不進入響應面，選擇超聲溫度為35 ℃較佳。

隨著超聲時間的增加，蛋白體的體積分數(shù)呈現(xiàn)先緩慢增加后快速增加，最后明顯下降的趨勢。超聲時間在0 ～40 min范圍內，超聲時間延長促進了蛋白體與淀粉顆粒間的分離；超過40 min后，可能超聲促進了溶出蛋白體的溶解。超聲時間為40 min 時，蛋白體的體積分數(shù)最大。因此超聲時間40 min較好。

2.2 蛋白體分離響應面優(yōu)化

2.2.1 模型的建立與顯著性檢驗

以對蛋白體分離影響較大的因素堿液濃度（A）、液料比（B）、超聲功率（C）和超聲時間（D）為自變量，以蛋白體體積分數(shù)為響應值，進行響應面優(yōu)化，實驗安排與結果見表2。運用Design－Expert軟件進行擬合，得到的回歸模型方程為：

表2 Box－Behnken實驗設計方案及實驗結果

Y ＝19.88 －0.66A ＋0.086B ＋0.32C －0.24D －0.013AB－7.50 ×10－3AC ＋0.40AD ＋5.00 ×10－3BC ＋0.02BD－0.048CD－1.74A2－0.99B2－0.47C2－1.11D2

通過比較方程中一次項系數(shù)絕對值的大小，可以判斷影響因子的主次性。本實驗中對蛋白體體積分數(shù)的影響從大到小依次為堿液濃度、超聲功率、超聲時間和液料比，可見堿液濃度對蛋白體分離的影響最大。

由表3 響應面實驗結果分析可見，F(xiàn)回歸＝9.02，P ＜0.000 1，表明模型極顯著；模型相關系數(shù)的平方即R2為0.900 2，為0.800 4，回歸方程擬合程度良好；失擬項P 值大于0.05，擬合性好，說明該方程能夠較好地擬合真實的實驗結果。

表3 回歸模型方差分析結果

各實驗因子對響應值的影響不是線性關系，其中A對Y值影響極顯著，C 對Y值影響顯著，A2、B2、D2對Y值的影響極顯著，C2對Y值的影響顯著。

2.2.2 響應面分析

響應面分析可知，所有響應面均呈凸起狀，因此響應值均容易取得最大值。當堿液濃度一定時，蛋白體體積分數(shù)隨著液料比、超聲功率及超聲時間的增大而先增大后減??；當液料比一定時，蛋白體體積分數(shù)隨著超聲功率及超聲時間的增大而先增大后減??；當超聲功率一定時，蛋白體體積分數(shù)隨著超聲時間的延長而先增大后減小。因此，在堿液濃度14 mmol／L、液料比12 mL／g、超聲功率90 W 及超聲時間40 min附近蛋白體體積分數(shù)可取得最大值。

2.2.3 最佳分離條件的確定

綜合4 個主要因素的影響，并確保各影響因素在設定的優(yōu)化條件范圍內，利用計算機程序采用最速上升法找到使蛋白體體積分數(shù)最高的最佳條件組合為：堿液濃度14 mmol／L、液料比12 mL／g、超聲功率90 W和超聲時間40 min，此條件下蛋白體的體積分數(shù)預測值為20.21%。在此最佳條件下分離蛋白體，以驗證條件的可靠性，實驗平行進行3 次，測定實際的蛋白體體積分數(shù)為20.10%，說明所得優(yōu)化條件有效且可靠。

2.3 光學顯微觀察

蛋白體的光學顯微形態(tài)見圖2。純化前上清液中蛋白體呈微球形，且大部分呈聚集態(tài)（圖2a），分散狀的蛋白體數(shù)量較少，蛋白體不能被考馬斯亮藍染色，但可見被染成藍色的絮狀物，可能是分離過程中溶出的可溶性蛋白。純化后上清液中的蛋白體微球狀立體感增強，且均為分散狀（圖2b），彼此不聚集，也不被考馬斯亮藍染色，未見藍染的絮狀物，蛋白體較純凈，說明純化效果較明顯。純化前黃軟物中的蛋白體呈微球形，但可見片狀物（圖2c），純化后黃軟物中的蛋白體更潔凈，片狀物消失（圖2d）。高壓均質法分離后在光鏡和掃描電鏡下可見蛋白體數(shù)量較少；蔗糖密度梯度離心法分離蛋白體在光鏡和掃描電鏡下可見淀粉雜質較多，且蛋白體與淀粉呈黏連狀態(tài)，不易分散。而研究所建立的稀堿法得到的蛋白體較純凈，雜質少，純化后考馬斯亮藍染色未見明顯藍色。

圖2 蛋白體的光學顯微形態(tài)

2.4 熒光顯微觀察

純化前，熒光與可見光下蛋白體的位置相對應（圖3a和圖3c），熒光下顯示藍色的是可見光下的無色微球體，說明蛋白體顯示藍色熒光；而在可見光下觀察到的考馬斯亮藍藍染的絮狀可溶性蛋白，在熒光下卻為無色，這說明蛋白體確實不能被考馬斯亮藍染色，可能因它的結構較致密。純化后（圖3b 和圖3d），考馬斯亮藍著色的絮狀物消失，蛋白體呈分散狀，顯示藍色熒光，純化后蛋白體更純凈。黃軟物中的蛋白體，純化前也呈分散狀態(tài)且有少量片狀物存在（圖3e和3g），但無絮狀物；純化后片狀物消失，蛋白體更潔凈（圖3f和圖3h）。

圖3 蛋白體的熒光顯微形態(tài)

2.5 掃描電鏡觀察

純化前上清液中蛋白體大多被連續(xù)基質所覆蓋，蛋白體暴露不完全（圖4a）。純化后蛋白體呈彼此分離狀態(tài)（圖4b），彼此間無連續(xù)基質填充或黏連，且蛋白體形態(tài)更加飽滿、立體感強，蛋白體多數(shù)較完整，有少數(shù)蛋白體上有較大孔洞或破裂，但多數(shù)蛋白體表面均有數(shù)量較多的微坑。純化前黃軟物中蛋白體大多呈分散狀態(tài)且有少量雜質存在（圖4c）；而純化后黃軟物中蛋白體形態(tài)清晰，蛋白體間無填充物，蛋白體的個體形態(tài)與上清液中基本類似（圖4d）。

圖4 蛋白體的掃描電鏡形態(tài)

2.6 十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS －PAGE）

蛋白體樣品的SDS －PAGE 見圖5。結果顯示，純化前上清液和黃軟物蛋白體的條帶較多，純化后條帶減少，其中黃軟物在16 ku 處的條帶較模糊，是PB－Ⅰ的多肽組成亞基［12］；蛋白體在22、33、57 ku處出現(xiàn)條帶，這些條帶是PB－Ⅱ的重要組分［12］。由此表明，獲得的蛋白體樣品中不僅包含PBⅠ，也包含PB－Ⅱ。

圖5 蛋白體電泳圖

2.7 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）

蛋白體紅外光譜見圖6。蛋白體的酰胺A 帶吸收峰（氨基的反對稱伸縮振動峰）在3 432 cm－1，與淀粉的羥基吸收峰位3 456 cm－1明顯不同，且蛋白體純化后此峰的強度減弱。蛋白體的C—H 伸縮振動峰出現(xiàn)在2 926 cm－1，與淀粉的甲基、亞甲基C—H伸縮振動峰同位，但是前者峰形明顯變窄，與淀粉有明顯的區(qū)別。蛋白體在1 650 cm－1附近出現(xiàn)酰胺Ⅰ帶的N—H彎曲振動峰，淀粉在1 650 cm－1附近出現(xiàn)C ═O伸縮振動峰，但蛋白體的峰強度更小。另外，蛋白體在1 000 ～500 cm－1范圍內918 cm－1處的指紋峰比淀粉更小。常用酰胺Ⅰ帶1 600 ～1 700 cm－1的紅外吸收光譜研究蛋白質的二級結構，其特征振動取決于C═ O 與N—H 的氫鍵性質［14］。純化前后，蛋白體在酰胺Ⅰ帶（1 650 cm－1）和酰胺Ⅱ帶（1 464 cm－1，C—N的伸縮振動）的紅外吸收光譜不變，但純化后蛋白體在酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶的紅外吸收強度有不同程度的減弱。在1 028 cm－1的吸收峰是C═ N共價鍵的吸收，純化后蛋白體的吸收強度也減弱。

圖6 蛋白體紅外光譜

2.8 X－射線衍射（XRD）

蛋白體的X－射線衍射見圖7。蛋白體在10.1°和19.9°處的2 個寬衍峰分別對應蛋白體的二級結構α －螺旋和β －折疊［15］。在19.9°處蛋白體和淀粉同時出現(xiàn)了衍射峰，且蛋白體的峰值強度明顯低于淀粉，說明蛋白體中蛋白質分子鏈比淀粉顆粒中淀粉分子鏈更松散。在15°、17°、18°、23°附近是淀粉的衍射峰，蛋白體在相應位置的衍射峰強度很弱，蛋白體內可能嵌合少量淀粉。

圖7 蛋白體XRD衍射圖

2.9 拉曼光譜

通過分析拉曼光譜圖的頻率和強度，可以得出信息以反映蛋白質構象變化。純化前后蛋白體在波數(shù)600 ～1 800 cm－1范圍內的拉曼光譜如圖8 所示。其中1 200 ～1 350 cm－1稱為酰胺Ⅲ帶，為N—H 面內彎曲振動和C—N伸縮振動；1 400 ～1 550 cm－1是C—H的伸縮振動區(qū)域，即酰胺Ⅱ帶；1 600 ～1 700 cm－1是酰胺Ⅰ帶，是表征蛋白質二級結構最常用、最可靠的譜帶區(qū)間，主要是C—O 和C—N 2 種官能團的伸縮振動［16］。由圖8 可見，蛋白體在1 650／1 651 cm－1、1 422／1 423 和1 303／1 308 cm－1出現(xiàn)酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶和酰胺Ⅲ帶峰，而淀粉只在相近的1 459 cm－1和1 340 cm－1處出峰，因此表明所分離的是蛋白體。由表4 可以看出，純化后上清液和黃軟物蛋白體在1 652／1 653 cm－1及1 305／1 304 cm－1處的拉曼光譜強度明顯高于純化前，這2 個峰分別歸屬于酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅲ帶。874／878 cm－1為酪氨酸的Fermi共振，純化后拉曼強度增大，說明蛋白體中酪氨酸殘基更加暴露［17］。792／787／784 cm－1為色氨酸吲哚環(huán)的拉曼峰位［18］。純化后蛋白體在420 cm－1處的拉曼強度增強，此峰歸屬于C—H鍵，說明經(jīng)純化處理后C—H鍵更加暴露。O—H伸縮峰在3 576／3 678 cm－1，純化后強度明顯減弱，說明分子間結合程度下降。這些拉曼光譜特征說明了純化后得到的是蛋白體。

圖8 蛋白體的拉曼光譜

表4 蛋白體紅外特征頻率及歸屬

表5 蛋白體拉曼光譜特征峰指認

3 結論

經(jīng)單因素及響應面實驗確定了蛋白體分離的優(yōu)化條件為：堿液濃度14 mmol／L、液料比12 mL／g、攪拌時間90 min、超聲功率90 W、超聲溫度35 ℃和超聲時間40 min，此條件下蛋白體體積分數(shù)為20.10%。分離的蛋白體經(jīng)微孔濾膜和氯化鈣純化后，經(jīng)光學顯微鏡、熒光顯微鏡和掃描電鏡、SDS －PAGE電泳、X －射線衍射、紅外和拉曼光譜分析表明，所得蛋白體呈微球形，有熒光，由16、22、33、57 ku的亞基組成；X －衍射在19.9°顯現(xiàn)出β －折疊的吸收峰峰，紅外具有1 464 cm－1和1 534 cm－1的Amide Ⅱ帶吸收峰，拉曼在1 303 cm－1和1 651 cm－1具有Amide Ⅲ和Amide Ⅰ帶散射峰，均屬于蛋白質的特征吸收，表明分離純化后得到的是蛋白體。因此，以低濃度氫氧化鈉溶液從糙米中分離蛋白體是可行的，從而可為稻米中蛋白體的結構和性質及其對稻米食用品質的形成等研究提供方法。