草莓莖基腐病病原菌鑒定、致病力分析及防治藥劑篩選

葉梓 謝雨璐 張國芳 李曉媛 陳衛(wèi)良 毛碧增，*

（1浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物病蟲分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/浙江省作物病蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310058；2浙江省建德市草莓科技小院，浙江 建德 311600；3浙江省寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究所，浙江 寧波 315100；4杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310024）

草莓（FragariaananassaDuchesne.）是薔薇科（Rosaceae）草莓屬（Fragaria）多年生漿果類草本植物［1］。草莓營(yíng)養(yǎng)豐富，其中維生素B1、C，礦質(zhì)元素鉀、磷、鈣、鐵，抗氧化物質(zhì)鞣花酸、類黃酮等含量頗豐，在人體防病抗衰老方面有良好功效，有“水果皇后”之美譽(yù)［2］。浙江省為我國草莓主產(chǎn)區(qū)之一，草莓也已成為浙江省特色高效優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)代表之一。在建德、奉化、諸暨和臨海等重點(diǎn)草莓種植區(qū)域，草莓已經(jīng)成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民的主要經(jīng)濟(jì)來源［3］。浙江草莓種植主要以設(shè)施栽培為主，由于種植環(huán)境密閉、高溫高濕，加上連作的種植方式，草莓土傳病害頻發(fā)，嚴(yán)重影響草莓品質(zhì)和產(chǎn)量［4］。已報(bào)道的草莓根莖部病原菌有20多種，其中大多為真菌病原菌［5］。近年來，根莖部細(xì)菌性病害也被陸續(xù)報(bào)道，2021年Song等［6］和Li等［7］分別報(bào)道了由草莓黃單胞菌（Xanthomonasfragariae）引起的草莓冠腐病，該病害導(dǎo)致莖部出現(xiàn)空洞，發(fā)病植株往往苗期就死亡，發(fā)病率高達(dá)40%。而謝昀燁等［8］在浙江臺(tái)州發(fā)現(xiàn)了草莓細(xì)菌性莖基部壞死病，經(jīng)鑒定病原菌為路氏腸桿菌（Enterobacterludwigii）。本課題組于2021年在浙江寧波草莓種植地新發(fā)現(xiàn)了一種由菠蘿泛菌（Pantoeaananatis）引起的草莓細(xì)菌性基腐病［9］，病害前期葉背面出現(xiàn)水漬狀病斑，之后蔓延擴(kuò)大形成褐色不規(guī)則斑點(diǎn)和病斑，后期植株枯萎死亡，剖開莖基部發(fā)現(xiàn)空腔結(jié)構(gòu)。該病嚴(yán)重危害草莓生長(zhǎng)發(fā)育，可使草莓減產(chǎn)50%。但目前對(duì)草莓莖基腐病的研究較少，且局限于病害發(fā)生的初步報(bào)道［9-10］。因此，本研究在浙江省建德草莓種植基地采集具有相同癥狀的發(fā)病植株，進(jìn)行病原菌分離純化，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)對(duì)其進(jìn)行鑒定，同時(shí)對(duì)該病原菌的致病性、生物學(xué)特性和寄主范圍進(jìn)行測(cè)定，并挑選20種具有不同作用機(jī)理的藥劑開展對(duì)該病原菌的抑菌試驗(yàn)，篩選有效防治藥劑，以期為草莓莖基腐病的防控提供科學(xué)有效的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

病株來源：在浙江省建德市草莓種植基地采集具有草莓莖基腐病典型癥狀的植株。

供試菌株：水稻細(xì)菌性葉斑病病原菌P.ananatisZJU11由浙江大學(xué)李斌教授惠贈(zèng)；大腸桿菌DH5α來源于本課題組。

供試植物：草莓品種為粉玉。寄主范圍測(cè)定試驗(yàn)所用作物：番茄（SolanumlycopersicumL.）、辣椒（Capsicum annuumL.）、西瓜（CitrulluslanatusThunb.）、白菜（BrassicaparachinensisL.H.Bailey）、西蘭花（Brassica oleraceaL.）、豆角（VignaunguiculataL.Walp.）和水稻（OryzasativaL.）。

供試殺菌劑：根據(jù)農(nóng)藥的不同作用機(jī)理，參考文獻(xiàn)［11-12］，挑選供試藥劑20種，詳細(xì)信息見表1。

表1 供試藥劑Table 1 Bactericides for sensitivity assays

1.2 病原菌分離純化

無菌水沖洗干凈草莓病株根莖部表面，置于超凈工作臺(tái)中，用滅菌刀片在病健交界部位切取1 cm×1 cm樣品，75%酒精中浸泡30 s，無菌水沖洗1～2次后置于0.1%升汞中3 min，無菌水漂洗3次，晾干后放入研缽中加入無菌水充分研磨，研磨液經(jīng)梯度稀釋后涂布于溶菌肉湯（Luria-Bertani，LB）平板，以最后一次漂洗的無菌水作為空白對(duì)照，30 ℃培養(yǎng)24～48 h，挑取單菌落進(jìn)行下一步試驗(yàn)，并與20%甘油1∶1混合后置于-80 ℃冰箱中保存。

1.3 致病性驗(yàn)證

依據(jù)科赫氏法則進(jìn)行分離物回接。將過夜培養(yǎng)的菌液配制為1×108CFU·mL-1濃度的菌懸液，采用灌根接種法將15 mL的菌懸液澆至2月齡的草莓苗根部，無菌水作為對(duì)照，每處理組10株草莓苗，重復(fù)2次。置于人工氣候箱（28～30 ℃，相對(duì)濕度75%，光周期16 h光∶8 h暗）內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況，當(dāng)植株發(fā)病后再次分離病原菌并鑒定。

1.4 病原菌鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將病原菌轉(zhuǎn)接于LB和氯化三苯四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌在平板上的生長(zhǎng)及菌落形態(tài)。普通光學(xué)顯微鏡觀察菌體著色和運(yùn)動(dòng)情況，電子顯微鏡觀察菌體的形態(tài)、大小。

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定 將純化后菌株接種至LB培養(yǎng)液中，28 ℃培養(yǎng)18 h后，用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒（諾唯贊生物，南京）對(duì)病原菌DNA進(jìn)行提取，提取的DNA在-20 ℃保存。為了對(duì)病原菌進(jìn)行分類鑒定，分別使用16S核糖體RNA（16S ribosomal RNA，16S rRNA）、DNA促旋酶B亞基（DNA gyrase subunit B，gyrB）、延伸因子G（elongation factor G，fusA）、亮氨酰tRNA合成酶（leucyl-tRNA synthetase，leuS）、胞嘧啶核苷三磷酸合成酶（cytidine triphosphate synthetase，pyrG）、核糖體蛋白L2（ribosomal protein L2，rplB）、ATP合成酶β亞基（ATP synthase beta subunit，atpD）和翻譯起始因子2（translation initiation factor 2，infB）基因引物進(jìn)行擴(kuò)增［13-14］，所用引物序列見表2。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%凝膠電泳檢測(cè)后切膠回收，測(cè)序后通過BLAST進(jìn)行同源性比較，并下載高相似度序列。利用MEGA Ⅹ（V10.0.5）進(jìn)行多基因串聯(lián)，采用最大似然（maximum likelihood，ML）法構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹。

表2 目標(biāo)片段擴(kuò)增引物序列Table 2 Target fragment amplification primer sequences

1.5 生物學(xué)特性研究

1.5.1 生理生化檢測(cè) 參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)（第八版）》［15］，用細(xì)菌生化鑒定試劑盒（濱和微生物，杭州）對(duì)病原菌進(jìn)行運(yùn)動(dòng)性、淀粉水解、吲哚、硝酸鹽、硫化氫、麥芽糖、七葉靈苷、氧化酶、苯丙氨酸脫氨酶和Voges-Proskauer試驗(yàn)（V-P）共10項(xiàng)生理生化指標(biāo)測(cè)定，以無菌水作陰性對(duì)照。

1.5.2 生長(zhǎng)曲線繪制 將過夜培養(yǎng)的菌液OD600調(diào)為1.0，作為種子液進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。加1 mL種子液至50 mL LB液體培養(yǎng)基，28 ℃、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)。每隔2 h測(cè)1次OD600值，至OD600值數(shù)據(jù)無明顯變化。重復(fù)3次，整理所得數(shù)據(jù)繪制病原菌生長(zhǎng)曲線。

1.5.3 不同鹽濃度、pH值、溫度的影響 分別加1 mL種子液于鹽濃度為0.1%、1%、3%、5%、7%和9%的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)18 h，重復(fù)3次，測(cè)定不同鹽濃度下的菌液OD600值。分別加1 mL種子液于pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)18 h，重復(fù)3次，測(cè)定不同pH值條件下菌液OD600值。分別加1 mL種子液于13、18、23、28、33、38、43、48和53 ℃下的50 mL LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h，重復(fù)3次，測(cè)定不同溫度處理下菌液OD600值。

1.6 菌株寄主范圍研究

挑選薔薇科作物草莓，茄科作物辣椒、番茄，葫蘆科作物西瓜，十字花科作物白菜、西蘭花，豆科作物豆角，禾本科作物水稻等6個(gè)科的8種作物幼苗，采用灌根法接種進(jìn)行寄主范圍的測(cè)定，方法如下：

純化后的菌株培養(yǎng)過夜，用LB培養(yǎng)液配制成濃度為1×108和1×104CFU·mL-1的菌懸液。P.ananatisZJU11配制同樣濃度的菌懸液。1×108CFU·mL-1的大腸桿菌DH5α的菌懸液和LB培養(yǎng)液作為對(duì)照組。每處理組20株幼苗，重復(fù)3次。接種后置于25～35 ℃下培養(yǎng)，每天觀察發(fā)病情況，從發(fā)病部位再次分離病原菌并鑒定。此外，為了便于與ZJU11的致病性比較，除灌根法接種外，對(duì)水稻植株還采用了離體接種法和剪葉法進(jìn)行接種。

根據(jù)癥狀發(fā)生情況制定病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（表3），統(tǒng)計(jì)植株接種后的病情指數(shù)，按照病情指數(shù)范圍0～20、20～50和50以上，將病原菌對(duì)作物的毒性劃分為低毒性、中毒性和高毒性，確定病原菌對(duì)不同作物的毒性。

表3 病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Disease grading standard

1.7 藥劑篩選

本試驗(yàn)采用抑菌圈法，配制含菌量1×108CFU·mL-1的LB平板進(jìn)行有效藥劑篩選。藥劑初篩：根據(jù)20種藥劑推薦的使用劑量［11-12］，設(shè)置4個(gè)濃度梯度。每個(gè)含菌平板放置無菌濾紙片（直徑6 mm）5個(gè)，吸加不同濃度梯度藥劑于濾紙片上，中間濾紙片滴加滅菌水為對(duì)照。將培養(yǎng)皿置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，觀察濾紙片周圍有無抑菌圈，試驗(yàn)重復(fù)3次。藥劑復(fù)篩：根據(jù)初篩確定有抑菌作用的藥劑，并設(shè)置8個(gè)濃度梯度，試驗(yàn)重復(fù)4次。采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈的直徑，對(duì)照組抑菌圈直徑記為6 mm。抑菌率計(jì)算參照文獻(xiàn)［16］，用Origin2023軟件計(jì)算毒力回歸方程、抑制中濃度（EC50）和相關(guān)系數(shù)，分析比較不同藥劑的抑菌效果。抑菌率具體計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 田間癥狀

田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，草莓莖基腐病危害苗期草莓，該病害發(fā)生前期癥狀為葉片背面葉脈周圍出現(xiàn)水漬狀病斑，隨后出現(xiàn)不規(guī)則褐色斑點(diǎn)并融合擴(kuò)大。后期隨著病情加重，病株的根莖部壞死，整株草莓苗萎蔫死亡，剖開莖基部，觀察到空腔結(jié)構(gòu)出現(xiàn)（圖1）。

圖1 田間感病草莓根部癥狀Fig.1 Symptoms of strawberry stem rot in field

2.2 病原菌分離和形態(tài)學(xué)特征

從病健交界部位分離得到較為均一的菌落，從中選擇代表性菌落JD1進(jìn)行致病性驗(yàn)證。JD1接種8 d后，在一些葉片上出現(xiàn)了水漬狀病斑（圖2-A）。接種5周后，接種草莓苗壞死，與田間癥狀相似（圖2-B）。對(duì)照草莓無明顯癥狀（圖2-C、D）。經(jīng)再分離純化后得到的菌株，與初病原分離物形態(tài)特征相同，16S rRNA測(cè)序序列一致，初步判斷菌株JD1為引起草莓莖基腐病的病原菌。

圖2 菌株JD1致病性驗(yàn)證Fig.2 Pathogenicity test of strain JD1 on strawberry

觀察到JD1在LB板上呈黃色、圓形、粘稠狀，透明锃亮，散發(fā)刺激性氣味（圖3-A），在TTC培養(yǎng)基上呈紅色，表面粘稠，周緣光滑，散發(fā)刺激性氣味（圖3-B）。對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色，染色結(jié)果呈紅色陰性反應(yīng)，為革蘭氏陰性菌（圖3-C）；掃描電鏡下菌體大小約（0.2～0.6） μm×（0.9～1.8） μm，兩端鈍圓，呈短桿狀（圖3-D）。該分離物形態(tài)與Zhang等［9］、Song等［10］、王繼承［17］、王琦［18］和張燁等［19］報(bào)道的菠蘿泛菌形態(tài)特征較為一致。

圖3 菌株JD1的形態(tài)Fig.3 Morphology of strain JD1

2.3 分子生物學(xué)鑒定

對(duì)菌株JD1的16S rRNA、fusA、gyrB、leuS、pyrG、rplB、atpD、infB基因進(jìn)行擴(kuò)增，分別得到了長(zhǎng)度1 146、783、1 397、750、424、464、881及1 132 bp的擴(kuò)增片段，符合預(yù)期。隨后從NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）下載親緣關(guān)系較近的成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）、分散泛菌（Pantoeadispersa）和斯氏泛菌（Pantoeastewartii）等其他泛菌屬菌株對(duì)應(yīng)基因序列作為參比序列，構(gòu)建JD1的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示JD1菌株與菠蘿泛菌聚為一支（圖4）。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、致病性驗(yàn)證和分子生物學(xué)結(jié)果，將該病原分離物鑒定為菠蘿泛菌（Pantoeaananatis）。

圖4 基于16S rRNA、gyrB、fusA、leuS、pyrG、rplB、atpD、infB構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogentic tree constructed based on 16S rRNA、gyrB、fusA、leuS、pyrG、rplB、atpD、infB gene sequences

2.4 生物學(xué)特性研究

2.4.1 生理生化特性 生理生化特性檢測(cè)是微生物鑒定常用方法。應(yīng)用細(xì)菌生理生化試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表4，鑒定分離純化后的培養(yǎng)物為菠蘿泛菌。該菌株具有運(yùn)動(dòng)性，能夠分解利用麥芽糖，淀粉水解、七葉靈苷水解、吲哚、V-P試驗(yàn)結(jié)果陽性，能夠產(chǎn)生硫化氫，氧化酶、硝酸鹽還原和苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)結(jié)果陰性。與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)（第八版）》［15］中對(duì)菠蘿泛菌的描述一致。

表4 菌株生理生化特征Table 4 Physiological and biochemical characters of the strain

2.4.2 生長(zhǎng)曲線 以O(shè)D600值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制菌株JD1的生長(zhǎng)曲線如圖5-A所示。該病原菌生長(zhǎng)較快，在2～26 h菌體呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，26 h后菌體生長(zhǎng)趨勢(shì)平緩，處于穩(wěn)定生長(zhǎng)期。

圖5 菌株JD1的生長(zhǎng)特性Fig.5 The Growth characteristics of strain JD1

2.4.3 不同鹽濃度、溫度、pH值下JD1的生長(zhǎng)情況以O(shè)D600值為縱坐標(biāo)，不同鹽濃度為橫坐標(biāo)繪圖，觀測(cè)18 h后JD1的生長(zhǎng)情況（圖5-B），可知JD1最適生長(zhǎng)鹽濃度為1%～5%，鹽濃度高于5%時(shí)菌株生長(zhǎng)受到抑制，生長(zhǎng)緩慢，超過7%以后基本不生長(zhǎng)。觀測(cè)不同pH值的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h后JD1的生長(zhǎng)情況（圖5-C），發(fā)現(xiàn)在pH值4～9范圍內(nèi)JD1都可以生長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度隨pH值升高先加快后下降，最適生長(zhǎng)pH值為8。由此可知，該菌適合在中性及偏堿性環(huán)境生長(zhǎng)。在不同溫度LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h后，觀測(cè)JD1的生長(zhǎng)情況（圖5-D）。發(fā)現(xiàn)菌株JD1最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃，超過該溫度后菌株生長(zhǎng)速率明顯下降，43 ℃以上基本無法生長(zhǎng)。

2.5 菠蘿泛菌菌株寄主范圍研究

對(duì)草莓、番茄、辣椒、西瓜、白菜、西蘭花、豆角和水稻等8種作物，采用灌根法進(jìn)行接種，同時(shí)采用離體法和剪葉法接種水稻。統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表5、圖6）顯示DH5α菌懸液和LB液體培養(yǎng)液處理組都無明顯癥狀。JD1菌株以1×108和1×104CFU·mL-1濃度接種均能夠引起草莓、番茄、辣椒、西瓜和水稻發(fā)病，而對(duì)白菜、西蘭花和豆角沒有致病性。在1×108CFU·mL-1濃度下JD1菌株對(duì)番茄、辣椒和草莓表現(xiàn)為高毒性，對(duì)西瓜和水稻表現(xiàn)為中毒性；1×104CFU·mL-1濃度下JD1菌株對(duì)番茄和辣椒表現(xiàn)為高毒性，對(duì)西瓜表現(xiàn)為中毒性，對(duì)草莓和水稻表現(xiàn)為低毒性。以上說明JD1菌株對(duì)辣椒、番茄和草莓有較強(qiáng)致病性，對(duì)西瓜和水稻具有一定致病性?？傮w來看，JD1菌株對(duì)不同作物危害程度為：番茄＞辣椒＞草莓＞西瓜＞水稻＞白菜、西蘭花、豆角。

圖6 不同作物接種JD1后的發(fā)病情況Fig.6 Disease incidence in different crops after inoculation with P.ananatis JD1

表5 不同作物接種不同濃度JD1或ZJU11后的發(fā)病情況Table 5 Disease incidence of different crops inoculated with different concentrations of P.ananatis JD1 or ZJU11

ZJU11菌株接種各作物，統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表5、圖6）顯示1×108和1×104CFU·mL-1濃度下均能夠引起草莓、番茄、辣椒、西瓜、白菜和水稻發(fā)病，對(duì)西蘭花和豆角沒有致病性。在1×108CFU·mL-1濃度下ZJU11菌株對(duì)草莓表現(xiàn)為高毒性，對(duì)番茄、辣椒、白菜和水稻表現(xiàn)為中毒性，對(duì)西瓜表現(xiàn)為低毒性；1×104CFU·mL-1濃度下ZJU11菌株對(duì)番茄和水稻表現(xiàn)為中毒性，對(duì)草莓、辣椒、西瓜和白菜表現(xiàn)為低毒性。以上說明ZJU11菌株對(duì)草莓、番茄、水稻、辣椒、白菜和西瓜有一定致病性。依此來看ZJU11菌株對(duì)不同作物危害程度為：草莓＞番茄＞水稻＞辣椒＞白菜＞西瓜＞西蘭花、豆角。以上結(jié)果表明JD1和ZJU11對(duì)測(cè)試的8種作物的致病性強(qiáng)弱有所不同，且1×108CFU·mL-1濃度下ZJU11菌株對(duì)草莓、番茄、辣椒和西瓜在致病性上表現(xiàn)為顯著弱于JD1菌株。

2.6 室內(nèi)藥劑篩選

利用平板抑菌圈法測(cè)定了20種藥劑對(duì)P.ananatis的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)12%中生菌素可濕性粉劑、50%福美雙可濕性粉劑、80%乙蒜素乳油和0.3%四霉素水劑4種有效藥劑（圖7中4、6、9、12）。計(jì)算4種藥劑對(duì)P.ananatis的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)和EC50值（表6），結(jié)果顯示50%福美雙可濕性粉劑抑菌效果最好，EC50值為20.805 7 mg·L-1，其次為0.3%四霉素水劑，EC50值為42.540 1 mg·L-1，12%中生菌素可濕性粉劑EC50值為329.443 5 mg·L-1，而80%乙蒜素乳油的抑菌效果不理想，對(duì)應(yīng)EC50值為2 953.344 3 mg·L-1。

圖7 20種殺菌劑對(duì)JD1的抑制效果Fig.7 Inhibitory effect of twenty bactericides on JD1

表6 4種殺菌劑對(duì)JD1的抑菌效果Table 6 Inhibition effects of four bactericides against JD1

3 討論

隨著草莓細(xì)菌性病害近年漸多，關(guān)于草莓莖基腐病病原已有報(bào)道。Zhang等［9］通過形態(tài)學(xué)及16S rRNA、gyrB、fusA多基因聯(lián)合建樹確定了引起浙江寧波草莓根冠腐病的病原菌為P.ananatis。Song等［10］基于形態(tài)學(xué)及gyrB、fusA、leuS、核糖核酸聚合酶β亞基（RNA polymerase beta subunit，rpoB）基因串聯(lián)建樹確定了引起江蘇東海草莓莖腐病的病原菌為P.ananatis。但相關(guān)研究?jī)H限于病害發(fā)生的初步報(bào)道，關(guān)于病原物的研究較為空白，因此明確病原菌的分類地位、生物學(xué)特性、寄主范圍和有效藥劑等，可為后續(xù)病害防控提供理論支持。本研究從浙江省建德市草莓基地發(fā)現(xiàn)了一種草莓病害，依據(jù)泛菌屬保守基因16S rRNA、gyrB、fusA、leuS、pyrG、rplB、atpD和infB［14］構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性，確定了引起建德草莓莖基腐病的病原菌為菠蘿泛菌P.ananatis。這與Zhang等［9］在浙江寧波草莓基地和Song等［10］在江蘇東海草莓種植地的發(fā)病草莓植株上分離到的病原菌一致。由此可見，P.ananatis引起的草莓病害已在多地傳播，應(yīng)引起密切關(guān)注和重視。

P.ananatis最初被劃分在歐文氏菌屬Erwinia，于1989年被分類至泛菌屬Pantoea，在全世界都有分布，存在于水、土壤、植物體表面、植物種子內(nèi)以及人和動(dòng)物的傷口、體液當(dāng)中，具有非常廣闊的生態(tài)位［20］。早期報(bào)道中，P.ananatis常作為內(nèi)生菌或腐生菌提及［18］，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其可以侵染多種植物引發(fā)病害，單子葉植物病害如禾本科的水稻細(xì)菌性葉斑?。?1］、玉米細(xì)菌性褐腐?。?2］和小麥細(xì)菌性葉斑?。?3］，百合科的洋蔥葉枯病［24］；雙子葉植物病害如葫蘆科的甜瓜果實(shí)腐爛?。?5］、黃瓜細(xì)菌性葉斑病［26］，以及高大喬木植物病害如桉樹葉疫病［27］。在2019年和2022年加拿大［28］和埃及［29］分別報(bào)道了由P.ananatis引起的草莓細(xì)菌性葉枯病。本研究發(fā)現(xiàn)分離自草莓莖基腐病株的P.ananatis菌株JD1能夠引起茄科作物番茄、辣椒，葫蘆科作物西瓜，禾本科作物水稻發(fā)病，且對(duì)番茄和辣椒表現(xiàn)出較強(qiáng)致病性；對(duì)十字花科作物白菜、西蘭花，以及豆科作物豆角沒有致病性。輪作或間套作種植模式是防治土傳病害的有效措施，通過填閑期種植不同作物，可調(diào)節(jié)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性，從而減輕作物病害發(fā)生［30］。但從本研究結(jié)果來看，輪作或間套作作物種類的選擇尤為關(guān)鍵，若選擇的作物仍為P.ananatis的寄主，將會(huì)引起病原菌的連續(xù)積累與傳播，作物發(fā)病程度不減反增。因此，建議在草莓莖基腐病發(fā)生的種植區(qū)，考慮白菜、西蘭花和豆角作為草莓生長(zhǎng)期間或收獲后的間套作或輪作作物，避免與茄科的番茄、辣椒，葫蘆科的西瓜和禾本科的水稻等作物輪作，導(dǎo)致田間病原菌積累，加重病害發(fā)生，造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失。

現(xiàn)有研究表明，分離自不同寄主的P.ananatis菌株表現(xiàn)出了致病性上的差異。如Lao等［26］報(bào)道了P.ananatis引起的黃瓜細(xì)菌性葉斑病，而Kido等［25］發(fā)現(xiàn)從甜瓜果腐病中分離的P.ananatis可以引起多種葫蘆科植物果實(shí)腐爛，但對(duì)黃瓜和哈密瓜例外；研究發(fā)現(xiàn)P.ananatis引起大白菜細(xì)菌性干燒?。?9］，但分離自水稻的P.ananatis卻對(duì)土豆和大白菜沒有致病性［18］。本研究發(fā)現(xiàn)分離自水稻病株的P.ananatisZJU11表現(xiàn)出與草莓致病菌P.ananatisJD1不一樣的致病力，ZJU11在1×108和1×104CFU·mL-1濃度下接種水稻，病情指數(shù)和發(fā)病率明顯高于JD1接種，而在同濃度接種草莓時(shí)，ZJU11接種后的草莓病情指數(shù)和發(fā)病率都顯著低于JD1接種結(jié)果（表5），推斷這與病原菌的分離來源密切相關(guān)。ZJU11還能夠引起茄科作物番茄、辣椒和葫蘆科作物西瓜發(fā)病，但同濃度下致病力都顯著弱于JD1（表5），即這兩株分離自不同寄主的P.ananatis菌株出現(xiàn)了較為明顯的致病力分化。此外白菜也可被ZJU11侵染，與王琦［18］報(bào)道的水稻致病菌P.ananatis對(duì)大白菜不致病結(jié)果不同，推測(cè)由于作物品種和生長(zhǎng)環(huán)境不同，同樣的寄主分離得到的病原菌小種也存在差異。

P.ananatis既感染單子葉植物，也感染雙子葉植物，但國內(nèi)針對(duì)P.ananatis引起的病害的防控相關(guān)研究較為空缺，王繼承［17］通過體外藥劑篩選和田間實(shí)驗(yàn)，確定了氯溴異氰尿酸對(duì)引起桑枯萎病的P.ananatis有較好的防治效果。在本研究用來測(cè)定對(duì)P.ananatis抑菌效果的20種殺菌劑中也包含了氯溴異氰尿酸，同樣的濃度下氯溴異氰尿酸對(duì)JD1卻沒有抑菌效果，分析可能是由于寄主及分離地區(qū)不同，菌株互為不同小種，在耐藥性上也有所差異。陳小林等［12］發(fā)現(xiàn)四霉素對(duì)從芒果細(xì)菌性壞死病中分離得到的泛菌屬病原菌具有較好的抑制效果，而氯溴異氰尿酸、中生菌素、乙蒜素等藥劑敏感性較差，與本研究結(jié)果較為一致。通過室內(nèi)藥劑初篩和復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)50%福美雙和0.3%四霉素這兩種藥劑的抑菌效果較好，它們的EC50值分別為20.805 7和42.540 1 mg·L-1，但其田間的實(shí)際防治效果有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

經(jīng)形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定，確定引起浙江省建德市草莓莖基腐病病原菌為菠蘿泛菌P.ananatis。該病原菌JD1生長(zhǎng)最適pH值為8，最適溫度為28 ℃，最適鹽濃度為1%～5%。JD1還可引起番茄、辣椒、西瓜和水稻發(fā)病，但對(duì)白菜、西蘭花和豆角沒有致病性，且與分離自水稻葉斑病的P.ananatisZJU11有明顯的致病力差異。室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果顯示50%福美雙可濕性粉劑和0.3%四霉素水劑有較好的抑菌效果，可用于草莓莖基腐病的化學(xué)防治。