用于正電子斷層掃描成像的68Ga標(biāo)記PM2.5模擬粒子的制備及其活體示蹤

潘棟輝 徐宇平 王辛宇 王立振 嚴(yán)駿杰 施冬健 楊 敏＊, 陳明清＊,

(1江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，合成與生物膠體教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122)

(2江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214063)

0 引 言

隨著經(jīng)濟(jì)和工業(yè)的快速發(fā)展，空氣污染引起了公眾的廣泛關(guān)注。其中，直徑小于2.5 μm 的顆粒物(particulate matter 2.5，PM2.5)已成為最重要的污染物，引起了廣泛關(guān)注。PM2.5由固體和液體顆粒的空氣懸浮混合物組成，其特點(diǎn)是粒徑小、比表面積大和毒素吸收能力強(qiáng)。其可以滲透到人體肺部，并導(dǎo)致許多健康問題，如哮喘、肺炎、中風(fēng)、慢性支氣管炎和心律失常等[1-4]。研究PM2.5對(duì)健康的威脅及其引發(fā)各類疾病的機(jī)制，對(duì)于防治污染、應(yīng)對(duì)污染造成的公共衛(wèi)生事件、開發(fā)防護(hù)器具、治療由其引發(fā)的疾病均具有重要意義。

目前，針對(duì)PM2.5對(duì)機(jī)體器官的毒害研究局限于離體的細(xì)胞、組織水平[5-10]。盡管實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人鼓舞，但仍缺乏系統(tǒng)和全面的研究來評(píng)估PM2.5的體內(nèi)行為。尤其是PM2.5如何通過氣道進(jìn)入人體，在支氣管、肺泡組織中的滯留時(shí)間與累積量有多少，又是如何進(jìn)入血液循環(huán)到達(dá)全身各組織器官的，其攜帶的有機(jī)碳、重金屬、放射性等污染在體內(nèi)是如何釋放或排泄的，在蓄積部位是如何誘導(dǎo)疾病發(fā)生的，發(fā)生前后是否可以通過防護(hù)以改善或避免等等，這一系列科學(xué)問題還未闡釋清楚。

運(yùn)用分子影像技術(shù)可以輕松解決該問題。正電子斷層掃描(positron emission tomography，PET)成像是臨床應(yīng)用最成熟的分子影像技術(shù)，具有靈敏度高、分辨率優(yōu)的特點(diǎn)，不僅可無創(chuàng)、實(shí)時(shí)、連續(xù)、定量、定位監(jiān)測(cè)活體狀態(tài)下生理、病理變化，還是動(dòng)物體內(nèi)“暗箱”過程可視化的極佳工具[11-13]。活體PET顯像將為揭示PM2.5誘導(dǎo)的病理毒理機(jī)制提供有效、客觀、真實(shí)的數(shù)據(jù)。

合適的放射性核素和粒子是活體追蹤PM2.5的關(guān)鍵。天然PM2.5難以收集并進(jìn)行核素標(biāo)記。我們?cè)鴮?duì)二氧化硅顆粒進(jìn)行131I標(biāo)記，以期作為PM2.5模擬粒子進(jìn)行活體單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描(singlephoton emission computed tomography，SPECT) 研究[14]。但該顆粒與131I 核素的螯合效率較差，需耗時(shí)多日(約10 d)才能獲得穩(wěn)定的標(biāo)記產(chǎn)物。黑色素納米顆粒(melanin nanoparticle，MNP)是一類由天然黑色素聚合形成的納米材料，具有廣譜的光學(xué)性質(zhì)[15-19]。MNP 結(jié)構(gòu)以吲哚環(huán)為主，C、H、O 為其主要組成元素，可模擬PM2.5中的有機(jī)碳組分。此外，MNP易與金屬核素螯合形成穩(wěn)定的金屬核素標(biāo)記納米顆粒。因此，MNP是PM2.5的理想模擬粒子前體。

68Ga 是臨床廣泛使用的正電子顯像核素，其物理半衰期為67 min，可通過稀鹽酸淋洗鍺鎵發(fā)生器(68Ge-68Ga)方便獲得，無須使用昂貴的回旋加速器生產(chǎn)，具有核素性質(zhì)優(yōu)良、來源方便、標(biāo)記便捷等優(yōu)勢(shì)[20-23]。68Ge-68Ga 發(fā)生器可24 h 內(nèi)多次使用，4 h 以上淋洗可使放射性活度恢復(fù)至94%以上，這有利于重復(fù)核素標(biāo)記與PET成像。

前期研究發(fā)現(xiàn)MNP 與金屬直接接觸會(huì)產(chǎn)生沉淀，為防止MNP 攜帶放射性金屬核素時(shí)出現(xiàn)沉降，本研究擬先對(duì)MNP 進(jìn)行聚乙二醇(PEG)修飾得到PEG-MNP，隨后將其與68Ga3+離子進(jìn)行螯合，制備得到68Ga 標(biāo)記的PM2.5模擬粒子前體68Ga-PEG-MNP。鑒于PM2.5以霧化粒子形式懸浮于空氣中，為了更好地模擬PM2.5，我們隨后對(duì)68Ga-PEG-MNP 進(jìn)行霧化，制備得到放射性68Ga 標(biāo)記的PM2.5霧化粒子。經(jīng)氣管噴霧使其進(jìn)入小鼠體內(nèi)，使用小動(dòng)物正電子發(fā)射斷層成像(MicroPET)進(jìn)行小鼠全身PET 成像，評(píng)估該霧化粒子在活體內(nèi)生物分布、滯留、代謝等行為，以期闡明PM2.5經(jīng)肺吸入體內(nèi)后的藥代動(dòng)力學(xué)特性，為研究PM2.5污染對(duì)人體的危害，以及防治其所造成的健康危害提供借鑒與指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料及儀器

MNP 購(gòu)自美國(guó)Sigam 公司，氨基化聚乙二醇(NH2-PEG2000)購(gòu)自北京鍵凱科技股份有限公司，其他化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司?；衔锏牧胶托螒B(tài)分別使用粒度分析儀(ZetaSizer Nano-ZS，Malvern，UK)和透射電鏡(transmission electron microscope，TEM，F(xiàn)EI-Tecnai G2 20，USA，200 kV)進(jìn)行測(cè)定。采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(inductively coupled plasma mass spectrometer，ICP-MS，Agilent，USA)測(cè)定Ga3+與PEG-MNP 的負(fù)載效率。采用BioScan 公司的放射性薄層掃描儀進(jìn)行放射性樣品薄層掃描(thin-layer chromatography，TLC)分析。放射自顯影使用Cyclone 磷屏成像系統(tǒng)(美國(guó)PerkinElme 公司)測(cè)定。應(yīng)用德國(guó)SIEMENS 公司Inveon MicroPET 掃描儀進(jìn)行MicroPET 成像。使用德國(guó)百瑞3305 型霧化器進(jìn)行霧化給藥。霧化粒徑采用光學(xué)氣溶膠粒徑譜儀(SND-3100，山東諾方)測(cè)定。68Ga 溶液通過德國(guó)ITG 公司68Ge-68Ga 發(fā)生器獲取。Balb/c 小鼠購(gòu)自常州凱文斯動(dòng)物有限公司。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 PEG-MNP的制備

參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法制備MNP[15]。過程簡(jiǎn)介如下：取20 mg 黑色素顆粒溶解于10 mL 0.1 mol·L-1NaOH 溶液中，在強(qiáng)超聲的條件下，快速加入7 mL 0.1 mol·L-1HCl，將反應(yīng)液的pH 值調(diào)至7。所得粗產(chǎn)品經(jīng)過30 kDa超濾管純化，凍干得MNP。

將50 mg NH2-PEG2000溶于10 mL 去離子水中，調(diào)整pH=9。而后加入到MNP(1 mg·mL-1)溶液中，室溫反應(yīng)12 h 后，采用Amicon 濾器(截留分子量：30 kDa)純化，離心，超純水洗滌，去除未結(jié)合的PEG。收集純化產(chǎn)物，凍干得黑色顆粒PEG-MNP。測(cè)定PEG-MNP的粒徑、形態(tài)。

1.3 Ga-PEG-MNP的制備

取PEG-MNP 的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，1 mL，2 mg·mL-1)至反應(yīng)瓶中，加入1 mL 1 mg·mL-1氯化鎵的0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液。調(diào)整pH=5 后在37 ℃反應(yīng)30 min。采用PD-10 脫鹽柱純化，收集產(chǎn)物，凍干制得Ga-PEG-MNP。采用粒徑分析儀測(cè)量產(chǎn)物尺寸，并用TEM觀察其形態(tài)。

取1 mL 1 mg·mL-1的PEG-MNP(分子量按40 000 估算)水溶液，分別加入4、20、40、80 μL 8.8 mg·mL-1的氯化鎵水溶液，其中MNP 與Ga3+離子的物質(zhì)的量之比分別為1∶10、1∶50、1∶100 和1∶200。MNP 與Ga3+在37 ℃反應(yīng)30 min后，用30 kDa超濾管離心純化，去離子水清洗3 次，取內(nèi)管產(chǎn)物凍干得Ga-PEG-MNP，采用ICP-MS 測(cè)定Ga3+與PEG-MNP 的負(fù)載效率。

1.4 68Ga-PEG-MNP的制備

取新鮮淋洗的68Ga(185 MBq)鹽酸溶液至反應(yīng)瓶中，加入1 mol·L-1醋酸鈉溶液調(diào)節(jié)其pH 至3～4。隨后，加入5 mL 1 mg·mL-1PEG-MNP 溶液，37 ℃下孵育20 min(圖1)。反應(yīng)結(jié)束后使用30 kDa 超濾管離心除去未反應(yīng)的游離68Ga3+。利用TLC 測(cè)定放射化學(xué)純度(RCP)。其中，玻璃纖維色譜紙為固定相，甲醇、水體積比為85∶15 的溶液為流動(dòng)相。68Ga-PEG-MNP 和游離68Ga3+的相對(duì)保留值分別為0～0.1和0.9～1.0。

圖1 68Ga-PEG-MNP螯合標(biāo)記示意圖Fig.1 Scheme of 68Ga-PEG-MNP chelation labeling

1.5 68Ga-PEG-MNP的體外穩(wěn)定性研究

取3.7 MBq68Ga-PEG-MNP 生理鹽水溶液分別置于0.5 mL PBS 溶液和0.5 mL 小鼠血漿中，于37 ℃下放置0.5、1、2 h后分別采用TLC測(cè)定RCP。

1.6 MicroPET顯像

將小鼠固定于密閉飼養(yǎng)箱中，頭部與硅膠面罩貼合。該面罩通過軟管與霧化器連接。取37 MBq68Ga-PEG-MNP 的生理鹽水溶液注入霧化器中。68Ga-PEG-MNP顆粒經(jīng)霧化后由小鼠氣管進(jìn)入體內(nèi)。

小鼠給藥后將其置于MicroPET 掃描床上，使用異氟烷進(jìn)行麻醉。調(diào)整位置使其位于視野中心。分別于給藥后第10、30、60、120、240 min進(jìn)行10 min靜態(tài)掃描，采集模式為三維模式，能峰為511 keV，時(shí)窗為3.432 ns。采用三維有序子集期望最大化(3D OSEM)算法進(jìn)行圖像重建。應(yīng)用ASIPROV 軟件勾畫肺、肝和腎等器官為感興趣區(qū)，計(jì)算各組織放射性攝取值(%·g-1)。

1.7 離體放射自顯影

小鼠MicroPET 成像后經(jīng)異氟烷麻醉處死并解剖。肺組織取出后立即進(jìn)行冷凍切片。將不同區(qū)域的肺組織切片置于放射自顯影膠片上曝光1 h。采用OptiQuant軟件對(duì)自顯影結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 7.0 處理，采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)均以3次獨(dú)立測(cè)量的平均值(±SD)表示，p<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 PEG-MNP的表征

NH2-PEG 通過氨基與MNP 表面的二羥基吲哚/吲哚醌基反應(yīng)[19]，在堿性條件下室溫反應(yīng)12 h后，純化，凍干，制得PEG-MNP，產(chǎn)率約為50%。將其配制成0.5 mg·mL-1的PEG-MNP 水溶液，肉眼觀察為澄清透明溶液。動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scattering，DRS)結(jié)果顯示PEG-MNP 水溶液的平均粒徑為18.2 nm，與MNP 粒徑(10.9 nm)相比略有增加且分布較窄，表明PEG-MNP 在水中分散性良好(圖2A)。TEM測(cè)試結(jié)果表明PEG-MNP 顆粒呈球形(圖2B)，與MNP相比形態(tài)沒有明顯變化[15]。

圖2 PEG-MNP的DLS曲線(A)和TEM圖(B)Fig.2 DLS curve(A)and TEM image(B)of PEG-MNP

2.2 Ga-PEG-MNP的表征

為了優(yōu)化PEG-MNP 與Ga3+離子的螯合條件，我們通過ICP-MS 測(cè)定Ga3+與PEG-MNP 的螯合效率，結(jié)果顯示，PEG-MNP、Ga3+離子在物質(zhì)的量之比為1∶10、1∶50、1∶100 和1∶200 時(shí)，Ga3+離子的螯合效率分別約為60.32%、60.56%、64.66%、70.21%，這表明PEG-MNP與Ga3+有很高的螯合效率。

在pH=5 的條件下，PEG-MNP 與Ga3+離子物質(zhì)的量之比為1∶50(后文如無特別說明，均指該比例)時(shí)，Ga3+離子與PEG-MNP 表面的酚羥基快速螯合形成穩(wěn)定的金屬配合物(圖1)，反應(yīng)30 min 后純化，測(cè)得Ga-PEG-MNP 產(chǎn)率約為51%。DLS 結(jié)果表明Ga-PEG-MNP 的平均粒徑為24.4 nm(圖3A)，分散性良好。TEM顯示Ga-PEG-MNP粒子呈球形(圖3B)。

圖3 Ga-PEG-MNP的DLS曲線(A)和TEM圖(B)Fig.3 DLS curve(A)and TEM image(B)of Ga-PEG-MNP

2.3 68Ga-PEG-MNP的表征

PEG-MNP 具有良好的金屬螯合性能，幾乎能與正電子顯像核素68Ga 發(fā)生定量反應(yīng)，將68Ga 淋洗液調(diào)節(jié)至pH=3～4，加入PEG-MNP的水溶液中，攪拌反應(yīng)10 min后即到平臺(tái)期，放射性標(biāo)記產(chǎn)率為95.6%±1.9%(圖4A)。TLC 分析表明68Ga-PEG-MNP 的RCP大于95%(圖4B)。與先前報(bào)道的放射性核素標(biāo)記的PM2.5模擬粒子(131I 標(biāo)記的二氧化硅顆粒)相比，68Ga-PEG-MNP 的標(biāo)記工藝簡(jiǎn)便，且產(chǎn)率顯著提高約2倍[14]。研究表明68Ga-PEG-MNP 是合適的PM2.5模擬前體，可滿足動(dòng)物研究需求。

圖4 (A) 68Ga-PEG-MNP的標(biāo)記率隨時(shí)間變化圖;(B) 68Ga-PEG-MNP和(C)游離68Ga3+離子的TLC圖Fig.4 (A)Time-labeling yield curve of 68Ga PEG-MNP;TLC curves of(B) 68Ga-PEG-MNP and(C)free 68Ga3+

2.4 68Ga-PEG-MNP體外穩(wěn)定性

68Ga-PEG-MNP 在PBS 溶液中放置2 h 后進(jìn)行玻璃纖維色譜紙點(diǎn)樣，在甲醇/水混合溶液中層析，采用TLC 檢測(cè)其RCP 仍大于95%。與之相似，68Ga-PEG-MNP 在小鼠血漿中放置2 h 后，RCP 仍維持在95%左右(圖5)。這些結(jié)果表明68Ga-PEG-MNP 在生理環(huán)境中具有良好的穩(wěn)定性，能確保MicroPET 掃描儀采集的放射性信號(hào)源于68Ga-PEG-MNP 而非游離68Ga3+。

2.5 MicroPET顯像

我們?cè)捎?31I 標(biāo)記二氧化硅顆粒(粒徑約2.5 μm)混懸液模擬PM2.5粒子，將其通過氣管滴注入大鼠，并嘗試通過SPECT 觀察該粒子在活體內(nèi)的行為[14]。盡管實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚可，但二氧化硅核素附載效率不高，需要投入較大劑量的核素，且該給藥方法存在顆粒聚集導(dǎo)致分布不均勻等不足，這可能影響相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)的研究。研究表明，PM2.5主要以氣溶膠的形式分散懸浮于大氣之中。因此，本研究擬將68Ga-PEG-MNP 顆粒用霧化器霧化成2.5 μm 的液滴以更好地模擬自然環(huán)境中PM2.5狀態(tài)。此外，霧化可使模擬粒子均勻地沉積在組織器官中，以便更準(zhǔn)確地觀測(cè)粒子在活體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特性，包括分布、代謝等。

目前市場(chǎng)在售的各種壓縮空氣霧化裝置、超聲霧化裝置，甚至納米霧化儀，其平均粒徑均在5～10 μm 及以上，其中魚躍的手持式超聲霧化儀勉強(qiáng)能達(dá)到平均3.5 μm，而德國(guó)百瑞3305 型兒童霧化器霧化平均粒徑小于2.5 μm，能夠保證模擬粒子的噴霧滿足實(shí)驗(yàn)需求。因此，我們選用該裝置將68Ga-PEGMNP溶液霧化，經(jīng)諾方SND-3100光學(xué)氣溶膠粒徑譜儀對(duì)模擬噴霧粒徑進(jìn)行測(cè)試，顯示霧化粒徑集中在2.5 μm左右，濃度約148 μg·m-3，達(dá)到中重度PM2.5污染程度(圖6)，然后通過霧化進(jìn)入小鼠體內(nèi)。應(yīng)用MicroPET觀察該顆粒在活體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)行為。

圖6 模擬噴霧霧化粒徑測(cè)試圖Fig.6 Test chart of simulated spray atomization particle size

由MicroPET 成像可見給藥10 min 后氣管呈放射性濃聚，30 min 后放射性粒子由氣管擴(kuò)展到肺，1 h 后氣管及肺雙葉均可見高濃度放射性聚集，4 h后放射性信號(hào)在肺部濃聚(圖7)。定量分析表明給藥10 min、30 min、1 h、2 h、4 h 后氣管和肺的放射性攝取值分別為(7.20±2.44)%·g-1、(4.46±1.04)%·g-1、(4.91±2.48)%·g-1、(4.71±2.39)%·g-1、(3.34±1.14)%·g-1和(17.90±3.75)% ·g-1、(18.10±4.52)% ·g-1、(19.49±6.11)%·g-1、(19.19±2.83)%·g-1、(20.87±2.40)%·g-1(圖8)。研究表明放射性粒子經(jīng)霧化吸入后可由氣管逐步向肺部雙葉區(qū)域擴(kuò)散，并滯留于肺，提示肺是PM2.5靶標(biāo)器官。此外，小鼠腹部器官如腸等也可見放射性攝取，提示PM2.5可能通過消化系統(tǒng)排泄。由于小鼠氣管和食管位置接近，可能會(huì)有少量霧化后的模擬PM2.5通過小鼠的嗆咳進(jìn)入食管及消化系統(tǒng)。后續(xù)將通過改進(jìn)霧化方式來改善口腔誤食的情況。與離體研究相比，MicroPET 成像清晰地展示了PM2.5在活體內(nèi)早期的藥代動(dòng)力學(xué)行為，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

圖7 小鼠噴霧吸入68Ga-PEG-MNP后10 min、30 min、1 h、2 h、4 h時(shí)PET成像Fig.7 PET images of mice at 10 min,30 min,1 h,2 h,and 4 h after inhalation of 68Ga-PEG-MNP

圖8 定量分析不同時(shí)間點(diǎn)68Ga-PEG-MNP在氣管和肺的攝取值Fig.8 Uptake values of 68Ga-PEG-MNP in lung and trachea at different time points by quantitative analysis

2.6 離體放射自顯影

顯像結(jié)束后取小鼠肺組織進(jìn)行冷凍切片，進(jìn)行離體放射性自顯影實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明放射性信號(hào)主要在小肺葉、中肺葉和大肺葉濃聚(圖9)，大肺葉放射性濃聚高于中肺葉與小肺葉，這可能與PM2.5進(jìn)入肺部的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)相關(guān)。

圖9 小鼠噴霧吸入68Ga-PEG-MNP 4 h后肺的體外放射自顯影圖Fig.9 Ex-vivo autoradiograph of lung in mice at 4 h after inhalation administration of 68Ga-PEG-MNP

3 結(jié) 論

我們成功地制備了一種68Ga 標(biāo)記MNP(68Ga-PEG-MNP)。該粒子制備工藝簡(jiǎn)單可控、標(biāo)記效率高、穩(wěn)定性好。霧化后的68Ga-PEG-MNP模擬噴霧粒徑集中在2.5 μm左右，能較好地模擬PM2.5環(huán)境。小動(dòng)物的MicroPET 成像可將68Ga 標(biāo)記PM2.5模擬粒子在小鼠活體內(nèi)的早期生物分布情況快速可視化。MicroPET 成像結(jié)果顯示68Ga-PEG-MNP 經(jīng)霧化吸入4 h后由氣管逐步向肺部雙葉區(qū)域動(dòng)態(tài)擴(kuò)散，并滯留于肺。這為PM2.5的活體代謝機(jī)制和毒理研究提供了新思路和新方法。