洪譯 王真權(quán) 羅雯鵬

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是以彌漫性、連續(xù)性病變?yōu)樘卣鞯穆苑翘禺愋匝装Y性疾病,屬于炎癥性腸病范疇[1]。該病全球發(fā)病率逐年上升[2],已成為臨床較難治愈的常見消化道疾病之一。針對UC的病因及發(fā)病機制仍未達成共識,目前已提出包括遺傳、免疫學失調(diào)、微生物群失衡和環(huán)境觸發(fā)等多種致病因素,其中較為公認的是與免疫功能障礙失調(diào)相關的免疫學說。

中醫(yī)并無與UC相對應病名,臨床根據(jù)患者癥狀分為“泄瀉”“腸澼”等病。中醫(yī)認為,UC病位在大腸,與脾胃、肝、肺等多臟腑相關。脾虛濕熱蘊腸為基本病機,本虛標實為病性特點。多由飲食不節(jié)、外感六淫、情志失調(diào)[3]或稟賦不足所致。臨床診療中發(fā)現(xiàn)大多UC發(fā)病與中醫(yī)“濕熱[4]”“瘀血[5]”“濁毒[6]” 等病理因素相關。

復方芩柏顆粒是我院多年來臨床治療UC的純中藥制劑,療效確切,在防治UC的發(fā)生發(fā)展方面有其獨特優(yōu)勢。前期已有研究顯示,復方芩柏顆粒具有較強的抑菌抗炎作用,能夠有效增強機體免疫力,且無明顯毒副作用[7]。同時復方芩柏顆粒可促進UC大鼠腸道黏膜愈合,減輕腸道炎癥反應,其機制可能是通過上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor 1, TGF-β1)表達,調(diào)控輔助性T細胞(helper T cell)17/調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Treg)細胞穩(wěn)態(tài)平衡,并與用藥濃度相關。該結(jié)果提示 Th17/Treg 可能是復方芩柏顆粒治療 UC 的重要靶點[8-10]。本研究旨在證實復方芩柏顆粒對UC大鼠Th1/Th2、Th17/Treg細胞穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)作用,探討復方芩柏顆粒對潰瘍性結(jié)腸炎的治療機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠42只(動物質(zhì)量合格證編號:422023100001662),SPF級,6～7周齡,體質(zhì)量(230±15)g,購于湖北貝恩特生物科技有限公司,許可證號:SCXK(鄂)2021-0027,本次實驗已通過動物實驗倫理審查[編號:LACUC(準)- BNT-2022-002]。大鼠飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境,飼養(yǎng)室溫度(22±3)℃,相對濕度 50%～60%,12小時明暗交替,實驗前適應性喂養(yǎng)7天。

1.2 實驗藥物、試劑及儀器

復方芩柏顆粒,組成:黃柏、檳榔、秦艽、防風炒炭、熟大黃、生地黃、當歸尾、桃仁、延胡索、黃芩、澤瀉,藥物比例:黃柏∶黃芩∶澤瀉∶當歸∶檳榔∶秦艽∶防風∶熟大黃∶延胡索∶生地黃∶桃仁=4∶4∶4∶4∶3.5∶3.5∶3.5∶3.5∶3.5∶5∶2,規(guī)格:6 g/包,批號:湘藥制字Z20080819,湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院提供;美沙拉嗪腸溶片(黑龍江天宏藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn),批號:20190109);葡聚糖酸鈉(dextran sulfate,DSS)(Sigma,批號:PHL83846);糞便隱血檢測試劑(遠慕生物,批號YM-TC0511),二甲苯(國藥,批號:10023418);無水乙醇(國藥,批號:10009259);蘇木素—伊紅染液(三鷹,批號:B600020);CD4流式抗體(biolegend,批號:201505);干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)流式抗體(Cell Signaling,批號:62675S);白介素(interleukin,IL)-4流式抗體(biolegend,批號:511905);IL-17A流式抗體(Invitrogen,批號:12717781);CD25流式抗體(biolegend,批號:202113);叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3(forkhead box protein P3,FoxP3)流式抗體(biolegend,批號:320007);熒光定量PCR MasterMix(TSINGKE,批號:TSK201);BCA蛋白定量試劑盒(碧云天,批號:P0009);ECL底物發(fā)光試劑盒(武漢聚能譯通,批號:K-12043-D10);SDS聚丙烯酰胺分離膠(Solarbio,批號:S8010);HRP標記山羊抗兔(武漢三鷹,批號:SA00001-2);HRP標記山羊抗小鼠(武漢三鷹,批號:SA00001-1)。病理切片機(德國Leica,型號:RM 2016);(流式細胞儀Beckman,型號:CytExpert);實時熒光定量PCR儀(ABI,型號:QuantStudio 12K);PCR儀(LongGene,型號:A300);水平電泳儀(JUNYI Electrophoresis Co,型號:JY300);紫外分析儀(JUNYI Electrophoresis Co,型號:JY02S);凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad,型號:ChemiDocTMXRS+)。

1.3 造模、分組及給藥

SD大鼠按照SPF級標準適應性喂養(yǎng)7天后,根據(jù)隨機數(shù)字表選取30只大鼠為模型制備組,剩余12只為正常組,模型制備組自由飲用5% DSS溶液[11-12],正常組自由飲用純凈水,連續(xù)7 天后,正常組和模型制備組各隨機抽取3只大鼠,對照兩組大鼠一般情況、結(jié)腸組織形態(tài)改變及病理結(jié)構(gòu)改變確定造模是否成功[13]。造模成功后模型制備組27只大鼠根據(jù)隨機數(shù)字表分為模型組、美沙拉嗪組、復方芩柏顆粒組三組,每組9只大鼠。

正常組及模型組:灌服生理鹽水,2 mL/次,2次/天,連續(xù)3周方式干預;美沙拉嗪組:美沙拉嗪在成人潰瘍性結(jié)腸炎急性活動期服用劑量為3 g/d,參照《動物實驗方法學》一書[14],可得大鼠等效劑量為270 mg/(kg·d)。將美沙拉嗪腸溶片用蒸餾水溶解配置成500 mg/mL母液,按照灌胃濃度用蒸餾水稀釋成15.5 mg/mL,使用時按照灌服,2次/d,2 mL/次,連續(xù)3周方式干預;復方芩柏顆粒組:前期實驗已得出最佳復方芩柏顆粒大鼠給藥濃度為2.52 g/(kg·d)[9],將復方芩柏顆粒用蒸餾水溶解配置成1g/mL母液,按照灌胃濃度用蒸餾水稀釋為145 mg/mL,使用時按照灌服,2次/d,2 mL/次,連續(xù)3周方式干預。干預結(jié)束后處死大鼠。

1.4 標本采集

將大鼠固定于無菌操作臺上,用3%戊巴比妥腹腔注射深度麻醉大鼠后,打開大鼠胸腔,暴露心臟,針頭刺入右心室采血,離心后將血清保存在-80℃環(huán)境下,以待后續(xù)檢測。頸椎脫臼法處死大鼠,打開大鼠腹腔,采集大鼠腸系膜淋巴結(jié)及脾臟用于后續(xù)單細胞懸液制作。離斷大鼠恥骨聯(lián)合,分離肛管,取出腸道,于回盲部分離,縱軸剖開,祛除殘余糞便,觀察大鼠腸道情況,病變明顯處留取標本,保存在-80℃環(huán)境下以待后續(xù)檢測。

1.5 大鼠一般情況觀察

自造模第一日起,每日密切觀察并記錄各組大鼠飲食、飲水、糞便及大便隱血、活動、體質(zhì)量等一般情況。根據(jù)疾病活動指數(shù)(disease activity index,DAI)評估大鼠潰瘍性結(jié)腸炎嚴重程度,DAI 評分=(體質(zhì)量下降分數(shù)+大便性狀分數(shù)+便血分數(shù))/3。DAI 評分法見表1。

表1 DAI評分標準

1.6 大鼠結(jié)腸組織病理變化觀察

大鼠結(jié)腸組織放置于4%多聚甲醛溶液中固定24小時后石蠟包埋切片,脫蠟水化后進行蘇木素—伊紅(hemotoxylin-eosin staining,HE)染色,于顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理學變化,記錄并拍照。

1.7 流式細胞儀檢測大鼠脾臟、腸系膜淋巴結(jié)中Th1/Th2、Th17/Treg細胞比例

取大鼠腸系膜淋巴結(jié)及脾臟細胞,研磨過濾后制作單細胞懸液,重懸并調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL。取100 μL上述單細胞懸液按照細胞表面抗原染色方法標記表面抗原(CD4+、CD25+),4 ℃孵育30分鐘,加入預冷后的流式染色緩沖溶液洗滌細胞,離心5分鐘(1000 r/min),加入1 mL的固定/破膜工作液(1∶3稀釋),混勻,4 ℃避光孵育45分鐘,再加入2 mL破膜緩沖液(1∶9去離子水稀釋)離心洗滌細胞后棄上清,加入FoxP3(或IL-4、IL-17A、IFN-γ)抗體,避光4℃孵育30分鐘后加入1 mL破膜工作液離心洗滌細胞2次并棄上清,最后加入0.5 mL PBS重懸細胞,上機檢測。

分別檢測各組大鼠脾臟、腸系膜淋巴結(jié)中CD4+IFN-γ+細胞、CD4+IL-4+T細胞、CD4+IL-17A+T細胞、CD4+CD25+FoxP3+T細胞占CD4+T細胞百分比,以觀察治療前后Th1、Th2、Th17、Treg細胞百分比含量。

1.8 RT-PCR 法檢測結(jié)腸組織中T-bet、GATA-3、RORγt、FoxP3 的mRNA表達

Trizol法提取總RNA后進行基因組DNA去除反應,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將組織RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,引物設計如表2。

表2 T-bet、GATA-3、RORγt、FoxP3引物序列

再置于PCR儀上擴增檢測,反應條件為95℃預變性1分鐘;95℃10秒,60℃10秒,72℃10～15秒,循環(huán)40次。獲得運行數(shù)據(jù),最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct法進行分析并整理。

1.9 Western blot 法檢測結(jié)腸組織中RORγt、FoxP3的蛋白表達

樣品制備:大鼠腸道組織冰上研磨后加入裂解液冰上裂解20分鐘,離心后取上清用BCA試劑盒檢測總蛋白含量,加入適量5×上樣緩沖液,混勻后煮5分鐘。后進行SDS-PAGE電泳:固定電泳裝置,加Tris-甘氨酸電泳緩沖液,加樣品和預染Marker。連接電源(電壓80V),待溴酚藍至分離膠時電壓改120V,直到溴酚藍至分離膠底部,關閉電源。 Western blot 檢測:轉(zhuǎn)膜、封閉、洗滌后將一抗和靶蛋白結(jié)合,洗滌后溫育二抗和一抗,洗滌后將ECL 試劑滴加在封口膜上。將PVDF膜的正面朝下接觸發(fā)光試劑,顯色2分鐘,翻轉(zhuǎn)PVDF膜,觀察結(jié)果。

1.10統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 對大鼠一般情況及腸黏膜影響

正常組大鼠食欲旺盛,飲水正常,體質(zhì)量未見明顯下降,反應敏捷,糞便色黑,麥粒狀,糞便隱血(-)。腸壁無增厚,黏膜完整,絨毛排列整齊,未見脫落、潰瘍、隆起、壞死;模型組大鼠體質(zhì)量下降,易驚恐,飲食飲水減少,出現(xiàn)行動遲緩、大便稀溏、大便隱血陽性等癥狀。其結(jié)腸長度變短,腸壁水腫,腸黏膜面充血,有彌漫性出血點、糜爛和潰瘍,隱窩膿腫;美沙拉嗪組及復方芩柏顆粒組大鼠癥狀較模型組改善, 飲食、 飲水量、 體質(zhì)量趨向正常組,結(jié)腸長度較正常組稍短,腸黏膜及腸壁形態(tài)及結(jié)構(gòu)較模型組恢復,充血水腫、潰瘍病變處減少。四組大鼠DAI評分總體均數(shù)不等(H=30.051,P=0.000),如表3所示。

表3 各組大鼠DAI評分

2.2 對大鼠結(jié)腸病理形態(tài)改變影響

正常組大鼠結(jié)腸組織黏膜完整連續(xù)、腺體排列整齊規(guī)則,結(jié)構(gòu)清楚,未見明顯炎性細胞浸潤;模型組大鼠結(jié)腸組織可見黏膜下層充血、水腫,毛細血管擴張,黏膜及黏膜下層有炎性細胞浸潤,腺體破壞嚴重,肌層變薄。美沙拉嗪組及復方芩柏顆粒組大鼠治療后其結(jié)腸組織病理形態(tài)改變相似,均為黏膜及黏膜下層存在少量充血和水腫現(xiàn)象,肌層較正常組略微變薄,炎性細胞浸潤較模型組減少。見圖1。

注: A 正常組;B 模型組;C 美沙拉嗪組;D 復方芩柏顆粒組。

2.3 對大鼠Th1/Th2、Th17/Treg細胞比例影響

與正常組相比,模型組Th1細胞含量顯著升高(P<0.05)。美沙拉嗪組及復方芩柏顆粒組干預后Th1細胞含量較模型組降低(P<0.05);模型組Th2細胞含量較正常組顯著降低(P<0.05)。美沙拉嗪組及復方芩柏顆粒組干預后Th2細胞含量較模型組明顯升高(P<0.05);模型組Th17細胞含量較正常組顯著升高(P<0.05)。美沙拉嗪組及復方芩柏顆粒組干預后Th17細胞含量較模型組降低(P<0.05);模型組Treg細胞含量較正常組明顯降低(P<0.05)。復方芩柏顆粒組、美沙拉嗪組干預后Treg細胞含量較模型組降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠Th1、Th2、Th17、Treg細胞百分比

由于模型組Th1、Th17細胞比例較正常組上升,Th2、Treg細胞比例較正常組下降,故模型組中Th1/Th2、Th17/Treg細胞比值較正常組升高;與模型組相比,美沙拉嗪組及復方芩柏顆粒組Th1、Th17細胞比例回調(diào)下降,Th2、Treg細胞比例回升,故美沙拉嗪組及復方芩柏顆粒組Th1/Th2、Th17/Treg細胞比值較模型組下降。其中復方芩柏顆粒組Th1/Th2細胞比值下調(diào)較美沙拉嗪組更明顯。

2.4 對大鼠T-bet、GATA-3、RORγt、FoxP3的 mRNA 表達影響

通過 RT-PCR 檢測大鼠結(jié)腸組織中轉(zhuǎn)錄因子T-box轉(zhuǎn)錄因子(T-box expressed in T cells,T-bet)、GATA結(jié)合蛋白3(GATA binding protein-3,GATA-3)、維甲酸相關孤兒受體γt(retinoid-related orphan nuclear receptor γt,RORγt) 及FoxP3 的 mRNA 表達水平。模型組中T-bet 、RORγt的mRNA含量高于正常組(P<0.05),模型組GATA-3、FoxP3的mRNA含量低于正常組(P<0.05)。與模型組相比,美沙拉嗪組及復方芩柏顆粒組治療后T-bet、RORγt的mRNA含量降低(P<0.05),GATA-3、FoxP3的mRNA含量升高(P<0.05)。各組T-bet、GATA-3、RORγt、FoxP3的 mRNA 表達見表5。

表5 各組大鼠T-bet、GATA-3、RORγt、FoxP3的 mRNA 表達

2.5 對大鼠RORγt、FoxP3 的蛋白表達影響

通過Western blot檢測大鼠結(jié)腸組織中RORγt、FoxP3的蛋白表達。與正常組相比,模型組RORγt 蛋白表達升高(P<0.05),FoxP3蛋白表達降低(P<0.05)。與模型組相比,美沙拉嗪組及復方芩柏顆粒組治療后RORγt 蛋白表達降低(P<0.05),美沙拉嗪組及復方芩柏顆粒組治療后FoxP3蛋白表達升高(P<0.05)。復方芩柏顆粒組RORγt的蛋白表達較美沙拉嗪組下調(diào)更為明顯(P<0.05)。見表6、圖2。

注:NC正常組; UC模型組; QB復方芩柏顆粒組; ME美沙拉嗪組。

表6 各組大鼠RORγt、FoxP3的蛋白表達

3 討論

目前研究認為,UC的發(fā)病機制中免疫功能失衡是重要因素之一,T淋巴細胞在炎癥刺激下可激活 CD8+T 細胞,進一步激活CD4+T 細胞,二者之間的平衡反映T細胞功能。CD4+T 細胞可分為Th 細胞和Treg細胞,Th 細胞又可分為Th1、Th2、Th9及 Th17等細胞亞群。

3.1 Th1/Th2免疫平衡及相關細胞因子

Th1和Th2細胞由Th0細胞分化而成。Th1細胞主要產(chǎn)生IFN-γ、IL-2等促炎因子,對抗細胞內(nèi)病原體導致的免疫反映。轉(zhuǎn)錄因子T-bet是Th1細胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子,IL-2可通過誘導T-bet表達增加Th1細胞分化。T-bet在產(chǎn)生IFN-γ過程中起決定性作用,IFN-γ又可誘導T-bet表達,二者之間形成正反饋調(diào)節(jié)環(huán)[15]。T-bet亦可轉(zhuǎn)導進入Th2細胞中,抑制IL-4等抑炎因子表達及Th2細胞分化;Th2細胞主要產(chǎn)生IL-4、IL-5和IL-13等抑炎因子對抗寄生蟲及過敏反應。GATA-3是Th2細胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子,IL-4依靠GATA-3促使Th0細胞分化為Th2細胞[16]。正常情況下,Th1和Th2細胞保持動態(tài)平衡,聯(lián)合其他的因素共同調(diào)節(jié)機體免疫平衡[17]。而在UC急性活動早期外周血中IFN-γ等Th1細胞分泌的促炎細胞因子含量明顯升高,抑炎因子相對不足導致炎癥發(fā)生;后期外周血中IL-4、IL-6等Th2細胞分泌的抑炎細胞因子水平明顯降低導致炎癥反應劇烈,即Th1/Th2細胞平衡被打破致使免疫失常從而誘發(fā)炎癥[18]。

3.2 Th17/Treg免疫平衡及相關細胞因子

Th17/Treg細胞穩(wěn)態(tài)失衡是 UC 發(fā)病的另一重要機制。二者相互抑制互相拮抗,亦可相互轉(zhuǎn)化[19-21]。Th17細胞可防御細胞外細菌感染,也介導自身免疫性疾病和慢性炎癥。主要分泌IL-17、IL-21、IL-23等促炎細胞因子,可促使多種細胞分泌趨化因子和細胞因子,并通過細胞集落刺激因子和趨化因子促進中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞增殖和成熟。RORγt是Th17細胞的特異性細胞轉(zhuǎn)錄因子。RORγt表達可抑制Treg細胞分化,促使TGF-β、IL-6、IL-23等多種促炎因子共同調(diào)控Th17細胞分化,研究發(fā)現(xiàn)去除TGF-β基因可抑制Th17細胞分化,IL-23降低亦可使Th17細胞分化減少[22];Treg細胞通過分泌IL-10、TGF-β等抑炎細胞因子抑制樹突細胞、B細胞等細胞活化和增殖來介導免疫耐受。FoxP3是Treg細胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子,可抑制Th1細胞、Th17細胞等促炎淋巴細胞分化[23]。IL-10維持FoxP3表達同時誘導Treg細胞分化,TGF-β在多種細胞因子調(diào)控下亦可誘導Treg細胞分化。由于TGF-β既能誘導RORγt表達又能誘導FoxP3表達,而二者分別是Th17細胞和Treg細胞分化的重要條件,故Th17細胞和Treg細胞在分化過程中是相互拮抗的。

正常情況下,Th17/Treg細胞處于動態(tài)平衡狀態(tài),共同維持機體腸黏膜免疫穩(wěn)態(tài),其平衡失常則引發(fā)免疫失衡導致炎癥反應[24]。UC患者外周血中Th17細胞分泌的IL-17等促炎因子增多,Treg細胞分泌的 IL-10等抑炎因子減少,引起免疫紊亂,導致UC發(fā)生[25-28]。

3.3 復方芩柏顆粒對UC的治療作用

本實驗中,模型組大鼠DAI評分明顯高于正常組,美沙拉嗪組、復方芩柏顆粒組大鼠經(jīng)干預后DAI評分下降(P<0.05)。模型組大鼠IFN-γ、IL-17促炎因子含量升高,IL-4抑炎因子、FoxP3細胞因子含量降低(P<0.05),即Th1/Th2、Th17/Treg較正常組顯著升高(P<0.05),經(jīng)美沙拉嗪、復方芩柏顆粒干預治療后IFN-γ、IL-17促炎因子含量降低,IL-4抑炎因子、FoxP3含量升高(P<0.05),即Th1/Th2、Th17/Treg細胞比值較模型組下降(P<0.05)。提示復方芩柏顆?？赡芡ㄟ^下調(diào)IFN-γ、IL-17促炎因子百分比含量、上調(diào)IL-4抑炎因子百分比含量、FoxP3水平,恢復Th1/Th2、Th17/Treg細胞動態(tài)平衡達到治療UC效果。

模型組大鼠結(jié)腸組織T-bet及RORγt mRNA表達、RORγt的蛋白表達水平顯著增高(P<0.05),而GATA-3及FoxP3的mRNA表達、FoxP3的蛋白表達水平明顯降低(P<0.05),經(jīng)美沙拉嗪及復方芩柏顆粒干預治療后,T-bet及RORγt的 mRNA表達、RORγt的蛋白表達水平均下降(P<0.05);GATA-3及FoxP3的mRNA表達、FoxP3的蛋白表達水平均上升(P<0.05)。提示復方芩柏顆?？赏ㄟ^上調(diào)GATA-3及FoxP3轉(zhuǎn)錄因子水平、下調(diào)T-bet及RORγt轉(zhuǎn)錄因子水平達到治療UC效果。其機制可能是通過上調(diào)GATA-3水平促進Th2細胞分化,上調(diào)FoxP3水平促進Treg細胞分化,以抑制免疫應答;下調(diào)T-bet、RORγt水平減少促進炎癥反應的Th1細胞及Th17細胞增殖分化以控制腸道炎癥反應修復腸道黏膜。

綜上所述,本實驗通過檢測復方芩柏顆粒對DSS誘導的UC大鼠轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA-3、RORγt、FoxP3表達及檢測Th1/Th2細胞、Th17/Treg細胞治療前后穩(wěn)態(tài)變化,得出結(jié)論:復方芩柏顆粒通過下調(diào)T-bet轉(zhuǎn)錄因子抑制Th1細胞分化,減少IFN-γ等促炎因子分泌。通過上調(diào)GATA-3轉(zhuǎn)錄因子增加Th2細胞分化,以此增加IL-4等抑炎因子分泌,從而調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞穩(wěn)態(tài)平衡,減輕腸道炎癥反應;同時,復方芩柏顆粒可以下調(diào)RORγt轉(zhuǎn)錄因子水平、上調(diào)FoxP3轉(zhuǎn)錄因子水平,抑制Th17細胞分化、促進Treg細胞分化,減少IL-17等促炎因子分泌,以此調(diào)節(jié)Th17/Treg細胞平衡,減輕炎癥反應,增強免疫抑制,達到治療UC、恢復腸道穩(wěn)態(tài)的效果。