李 娜，李 濤，楊冬梨，姚 媛

陜西中醫(yī)藥大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2.第二臨床醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712046

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是中胚層來源的成體干細(xì)胞。研究表明MSCs是構(gòu)成腫瘤微環(huán)境的重要基質(zhì)成分,對(duì)腫瘤的發(fā)展有復(fù)雜的影響[1]。MSCs對(duì)腫瘤的促進(jìn)作用通過多種機(jī)制實(shí)現(xiàn),包括分化為其他促腫瘤成分如腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞、抑制免疫細(xì)胞活性、促進(jìn)血管生成、通過與腫瘤細(xì)胞直接接觸或細(xì)胞因子及外泌體的分泌調(diào)控腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能,最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移、抑制凋亡及增加腫瘤耐藥性[2]。

和厚樸酚是從木蘭屬植物的根和莖皮中分離的生物活性成分,有效抗炎、抗氧化、抗衰老、鎮(zhèn)痛和抗腫瘤等作用[3]。多項(xiàng)研究證實(shí)和厚樸酚可直接作用于腫瘤細(xì)胞,通過抑制其增殖和轉(zhuǎn)移、促進(jìn)凋亡等發(fā)揮抗腫瘤作用[4]。然而,和厚樸酚對(duì)腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)作用研究較少。本研究擬以人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells, hADSCs)為研究對(duì)象,觀察和厚樸酚對(duì)其增殖、凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制,為進(jìn)一步明確和厚樸酚調(diào)控腫瘤微環(huán)境發(fā)揮抗癌效應(yīng)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

1.1.1 細(xì)胞: hADSCs獲贈(zèng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所趙春華課題組。

1.1.2 主要試劑:DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco公司); MTS 試劑盒(Promega公司);臺(tái)盼藍(lán)染色液(翌圣生物科技有限公司);annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒(BD Pharmingen公司);反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增相關(guān)試劑(TaKaRa公司);引物(上海生物工程有限公司);qPCR SYBR Green Master Mix(翌圣生物科技有限公司); GAPDH抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司); BAX抗體、BCL2抗體、CYCLIND1抗體、PCNA 抗體、p-ERK抗體、p-MEK抗體、ERK抗體和MEK抗體(Cell Signaling Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 MTS實(shí)驗(yàn): 按照試劑盒說明書進(jìn)行,具體方法參見文獻(xiàn)[5]。

1.2.2 臺(tái)盼藍(lán)染色液檢測(cè)細(xì)胞活性:離心收集不同濃度和樸厚酚預(yù)處理的hADSCs,PBS清洗后制成單細(xì)胞懸液,按照1:1比例與臺(tái)盼藍(lán)染色液充分混勻,染色1～2 min后加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板,細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)總細(xì)胞、死細(xì)胞和活細(xì)胞。

1.2.3 annexin V/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡:按照試劑盒說明書進(jìn)行,具體方法參見文獻(xiàn)[5]。

1.2.4 RT-qPCR檢測(cè):Trizol裂解液提取不同濃度和樸厚酚預(yù)處理的hADSCs總RNA,兩步法反轉(zhuǎn)錄為cDNA,加入引物、SYBR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá),所用引物見表1。

表1 RT-qPCR 引物Table 1 Primers for RT-qPCR

1.2.5 Western blot實(shí)驗(yàn): 收取不同濃度和樸厚酚預(yù)處理hADSCs的蛋白樣品,檢測(cè)增殖、凋亡及MEK-ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 和厚樸酚抑制hADSCs增殖

采用不同濃度的和厚樸酚(0、5、10、20和50 μmol/L)處理hADSCs 48 h。MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,10、20和50 μmol/L濃度組細(xì)胞的活性均明顯降低(P<0.01) (圖1A),5 μmol/L對(duì)hADSCs活性幾乎無影響。臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,隨著和厚樸酚濃度增加,hADSCs總細(xì)胞數(shù)、活細(xì)胞數(shù)以及活細(xì)胞比例逐漸下降(P<0.01) (圖1B～D)。

The effect of honokiol at different concentrations on the proliferation of hADSCs;A.MTS assay; B-D.cell counts were performed by Trypan blue staining; *P<0.01,**P<0.001 compared with 0 μmol/L group.

隨后采用RT-qPCR和Western blot檢測(cè)不同濃度和厚樸酚(0、10、20和50 μmol/L)處理hADSCs 48 h后對(duì)增殖相關(guān)基因表達(dá)水平的影響。隨著和厚樸酚濃度增加,增殖相關(guān)基因CCND1、MKI67和PCNA的mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05),CYCLIND1和PCNA的蛋白表達(dá)也下調(diào)(圖2A,B)。

上述結(jié)果表明,和厚樸酚可以抑制hADSCs增殖,并且這種抑制效果具有濃度依賴性。

2.2 和厚樸酚促進(jìn)hADSCs凋亡

采用不同濃度的和厚樸酚(0、10、20和50 μmol/L)處理hADSCs 48 h后,annexin V/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡。隨著和厚樸酚濃度增加,hADSCs的凋亡率逐漸上升(P<0.01) (圖3A,B)。

The effect of honokiol of different concentrations on apoptosis of hADSCs; A.cell apoptosis was detected by flow cytometry; B.statistical analysis of apoptosis rate; **P<0.01,***P<0.001 compared with 0 μmol/L group.

進(jìn)一步的RT-qPCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,隨著和厚樸酚濃度增加,促凋亡基因BAX和TP53的mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.01),抗凋亡基因BCL2的mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。促凋亡基因BAX蛋白表達(dá)上調(diào),抗凋亡基因BCL2蛋白表達(dá)下調(diào)(圖4A,B)。

The effect of honokiol at different concentrations on gene expression related to apoptosis of hADSCs; A.RT-qPCR detected the mRNA expression of BAX, BCL2 and TP53; B.Western blot detected the protein expression of BAX and BCL2; *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with 0 μmol/L group.

上述結(jié)果表明,和厚樸酚可以促進(jìn)hADSCs凋亡,并且這種促進(jìn)作用具有濃度依賴性。

2.3 和厚樸酚抑制MEK-ERK1/2信號(hào)通路活化

文獻(xiàn)報(bào)道,和厚樸酚可調(diào)節(jié)MAPK/ERK信號(hào)通路抑制乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[6]。本研究進(jìn)一步采用Western blot方法檢測(cè)不同濃度的和厚樸酚處理后對(duì)hADSCs的MAPK/ERK信號(hào)通路活性的影響。與空白對(duì)照組相比,10、20和50 μmol/L和厚樸酚濃度組hADSCs中p-MEK和p-ERK1/2蛋白的表達(dá)明顯下調(diào),而總的MEK和ERK1/2蛋白的表達(dá)并未發(fā)生明顯變化(圖5)。

圖5 和厚樸酚抑制MEK-ERK1/2信號(hào)通路活化Fig 5 Honokiol inhibited the activation of MEK-ERK1/2 signaling pathway

3 討論

腫瘤微環(huán)境是一個(gè)高度復(fù)雜的系統(tǒng),主要由腫瘤細(xì)胞、浸潤性免疫細(xì)胞、癌相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞(如MSCs)和脂肪細(xì)胞,以及細(xì)胞外基質(zhì)和多種信號(hào)分子組成[2]。MSCs被腫瘤細(xì)胞在癌變過程中分泌的可溶性因子募集到腫瘤組織中,通過直接與腫瘤細(xì)胞接觸、旁分泌甚至與腫瘤細(xì)胞融合的方式促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。因此,抑制腫瘤微環(huán)境中的MSCs生長也是抗癌治療的靶點(diǎn)。

和厚樸酚在體內(nèi)外環(huán)境中都表現(xiàn)出對(duì)不同癌癥的化學(xué)預(yù)防和治療潛力。研究表明和厚樸酚作用于腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)功能(增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和耐藥)發(fā)揮抗癌效應(yīng)[8-9]。本研究著重討論和厚樸酚對(duì)腫瘤微環(huán)境中hADSCs的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)使用0、10、20和50 μmol/L和厚樸酚作用于hADSCs,細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明和厚樸酚通過抑制hADSCs增殖,同時(shí)誘導(dǎo)凋亡,從而有效抑制hADSCs的生長。和厚樸酚作用48 h抑制多數(shù)腫瘤細(xì)胞增殖的IC50在15～50 μmol/L之間[6, 9-10],表明上述濃度的和厚樸酚用于抗腫瘤治療時(shí),可同時(shí)抑制腫瘤微環(huán)境中的MSCs生長,進(jìn)一步發(fā)揮其抗癌效應(yīng)。然而,MSCs廣泛分布于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中。提示和厚樸酚應(yīng)用于抗腫瘤治療時(shí),藥物隨血液到達(dá)全身可能對(duì)正常組織產(chǎn)生影響,表現(xiàn)出組織損傷不易修復(fù)等副作用。

ERK信號(hào)通路能響應(yīng)各種細(xì)胞外刺激,包括生長因子、細(xì)胞因子以及直接的細(xì)胞外應(yīng)激。已有文獻(xiàn)報(bào)道,和厚樸酚能下調(diào)p-ERK1/2表達(dá)水平抑制乳腺癌SK-BR-3 細(xì)胞增殖,促進(jìn)凋亡[6]。因此,本研究中檢測(cè)了不同濃度和厚樸酚處理hADSCs后p-MEK和p-ERK1/2表達(dá)水平,結(jié)果證實(shí)和厚樸酚呈濃度依賴性抑制MEK/ERK1/2 信號(hào)通路。

總之,和厚樸酚可能通過干擾MEK/ERK1/2 信號(hào)通路激活抑制hADSCs增殖,誘導(dǎo)凋亡,從而有效抑制hADSCs生長,減弱其對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的支持作用。這一發(fā)現(xiàn)提示和厚樸酚應(yīng)用于抗癌治療的過程中,腫瘤微環(huán)境的改善也是其治療靶點(diǎn)。