麝香酮調(diào)節(jié)cGAS-STING信號通路對缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)炎癥的影響*

剛 瑛，丁 鵬，李 冰，張文想

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）是由血栓形成或栓塞引起的腦血流中斷，是世界死亡和殘疾的主要原因之一，嚴(yán)重影響人類健康[1]。IS的病理生理機制包括離子失衡、氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥和免疫細(xì)胞異常激活，可導(dǎo)致神經(jīng)元壞死和凋亡。其中炎癥反應(yīng)是腦缺血組織損傷的基礎(chǔ)，大腦中發(fā)生炎癥后，小膠質(zhì)細(xì)胞或其他免疫細(xì)胞活化導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子釋放，促進白細(xì)胞浸潤并進入腦組織，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)激活，參與IS進展并對疾病產(chǎn)生嚴(yán)重影響[2]。因此，抑制炎癥反應(yīng)對于改善IS預(yù)后至關(guān)重要。麝香酮是中藥麝香的主要成分，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、神經(jīng)保護等作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，麝香酮不僅具有促進IS后神經(jīng)功能恢復(fù)的作用，還能減輕脊髓型頸椎病大鼠神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元損傷[3-4]。環(huán)鳥苷酸-腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）作為胞質(zhì)DNA傳感器，在識別單鏈和雙鏈DNA后合成第二信使2'3'-cGAMP，結(jié)合并激活干擾素基因刺激蛋白（stimulator of interferon genes，STING）介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和免疫失衡。cGAS可作為各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療靶點[5]。已有研究發(fā)現(xiàn)cGAS-STING通路的激活參與IS后神經(jīng)炎癥，因此抑制cGAS-STING通路可能有效緩解神經(jīng)炎癥相關(guān)損傷及相關(guān)神經(jīng)病理學(xué)[6]。在IS大鼠體內(nèi)麝香酮能否通過調(diào)節(jié)cGAS-STING信號通路改善神經(jīng)損傷和炎癥尚不清楚，因此本研究通過構(gòu)建IS大鼠模型，對其進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SPF級SD雄性大鼠60只，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2019-0008，實驗動物合格證號：SYXK（京）2020-0013。8周齡左右，體質(zhì)量（250±20）g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22 ℃左右，濕度55%，12 h光暗循環(huán)，不禁水食。本研究通過我院動物倫理委員會批準(zhǔn)（批號：2021-00915）。

1.2 藥品與試劑 麝香酮（純度≥98%，批號：541-91-3）購自上海麥克林生化科技有限公司；cGAS抑制劑RU.521（批號：HY-114180）、STING激動劑2′3′-cGAMP（批號：HY-100564）購自美國MedChemExpress公司；白細(xì)胞介素（IL）-1β酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（批號：EK-R36877）購自上海酶研生物科技公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（批號：ml002953）、IL-6 ELISA試劑盒（批號：ml064292）購自上海酶聯(lián)生物公司；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（批號：60524ES60）購自上海翌圣生物公司；TTC染色液（批號：SBJ-0485）購自南京森貝伽生物科技有限公司；Nissl染色液（批號：R20625）購自上海源葉生物公司；TUNEL試劑盒（批號：E-CK-A320）購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限；一抗p-IRF3（批號：ab76493）、IRF3（批號：ab238521）、二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗兔（批號：ab205719）購自美國Abcam公司；一抗IL-1β（批號：AB2915846）、TNF-α（批號：AB2204371）、cGAS（批號：AB2915749）、STING（批號：AB11153185）和β-actin抗體（批號：AB2792414）購自美國賽默飛世爾公司；RIPA裂解液（批號：SY4680）購自北京伊塔生物科技有限公司；ECL發(fā)光試劑盒（批號：abs920）購自上海愛必信生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 SpectraMax i3x多功能動酶標(biāo)儀（上海美谷分子儀器有限公司）；CX41-12C02光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；Phenom電子顯微鏡（上海復(fù)納科學(xué)儀器有限公司）；HT165R離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；HY2508石蠟切片機（金華惠友儀器設(shè)備有限公司）。

1.4 IS大鼠模型構(gòu)建 隨機選取50只大鼠，采用大腦中動脈閉塞（MCAO）法構(gòu)建IS大鼠模型[7]，麻醉大鼠并保持每只大鼠直腸溫度在（36.5±0.5）℃，暴露大鼠右側(cè)頸總動脈結(jié)構(gòu)至分叉處，用6.0 mm絲線結(jié)扎頸外動脈遠(yuǎn)心端，另一絲線穿過頸外動脈并在頸總動脈分叉處附近打結(jié)，使用動脈夾夾閉頸總動脈，將尼龍線插入頸外動脈、頸內(nèi)動脈并繼續(xù)進入大腦中動脈，缺血1 h后，去除線栓，縫合頸部傷口。對照組大鼠10只暴露頸總動脈結(jié)構(gòu)至分叉處，后縫合傷口，不進行其他操作。對各組大鼠進行Longa神經(jīng)功能評分，評分＞1分表明MCAO模型構(gòu)建成功。

1.5 大鼠分組和藥物干預(yù) 將SD大鼠分為對照組、MCAO組、MCAO+RU.521組、麝香酮組、麝香酮+2′3′-cGAMP組，除去死亡和建模失敗的大鼠，每組10只。MCAO后24 h，MCAO+RU.521組大鼠鼻內(nèi)給藥RU.521（450 μg/kg）溶解于1%二甲基亞石風(fēng)（DMSO）+玉米油[8]，麝香酮組大鼠鼻內(nèi)給藥麝香酮（5 mg/kg）溶解于1% DMSO[3]，麝香酮+2′3′-cGAMP組大鼠鼻內(nèi)給藥麝香酮（5 mg/kg）和2′3′-cGAMP（500 μg/kg）溶解于1%DMSO中[8]，對照組和MCAO組大鼠給予相同劑量生理鹽水。1次/d，連續(xù)給藥7 d。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 神經(jīng)功能缺損評分 給藥結(jié)束后，對大鼠進行神經(jīng)功能評分：0分，無神經(jīng)功能缺損；1分，對側(cè)前肢無法伸展；2分，對側(cè)前肢嚴(yán)重屈曲；3分，走路時向?qū)?cè)傾斜；4分，沒有自主活動，意識障礙。評分范圍1～4分，分值越高表明神經(jīng)缺損越嚴(yán)重。

1.6.2 TTC染色檢測腦梗死面積 神經(jīng)功能缺損評分后麻醉處死大鼠，取5只大鼠腦組織-20 ℃下冷凍，將腦冠狀面切片（約2 mm）在2% TTC溶液中染色30 min，翻轉(zhuǎn)數(shù)次，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定2 h，拍照并計算相對腦梗死面積=梗死面積/總面積×100%。

1.6.3 HE染色和Nissl染色觀察 取剩余5只大鼠海馬組織，固定于4%多聚甲醛中，石蠟包埋，切片（5 μm）后用HE染色、Nissl染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠海馬組織的病理變化和神經(jīng)元損傷。

1.6.4 TUNEL法檢測神經(jīng)元凋亡 取大鼠海馬組織石蠟切片，按照TUNEL試劑盒說明書染色，4 ℃孵育過夜，洗滌后與熒光二抗在37 ℃下孵育1 h，并用DAPI進行核染，在顯微鏡下觀察拍照。

1.6.5 ELISA法檢測炎癥因子水平 取大鼠海馬組織，剪切、研磨，離心取上清，按照ELISA試劑盒說明書，檢測炎證因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.6.6 Western blotting法檢測蛋白表達(dá) 取大鼠海馬組織，用RIPA裂解，提取總蛋白，定量后按步驟進行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，在4 ℃下加入一抗IL-1β、TNF-α、cGAS、STING、p-IRF3、IRF3（1：1 000）和內(nèi)參β-actin過夜孵育，清洗，在4 ℃下加入二抗山羊抗兔IgG（1：2 000），孵育2 h。用ECL發(fā)光顯影，觀察拍照，各條帶灰度值用Image J軟件處理分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 與對照組比較，MCAO組大鼠神經(jīng)功能缺損評分升高（P＜0.05）；與MCAO組比較，MCAO+RU.521組、麝香酮組大鼠神經(jīng)功能缺損評分降低（P＜0.05）；MCAO+RU.521組大鼠神經(jīng)功能缺損評分與麝香酮組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與麝香酮組比較，麝香酮+2′3′-cGAMP組大鼠神經(jīng)功能缺損評分升高（P＜0.05）。（見圖1）

圖1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 （±s，n=10）

2.2 各組大鼠TTC染色腦梗死面積比較 與對照組比較，MCAO組大鼠腦梗死面積顯著升高（P＜0.05）；與MCAO組比較，MCAO+RU.521組、麝香酮組大鼠腦梗死面積顯著降低（P＜0.05）；MCAO+RU.521組大鼠腦梗死面積與麝香酮組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與麝香酮組比較，麝香酮+2′3′-cGAMP組大鼠腦梗死面積顯著升高（P＜0.05）。（見圖2～3）

圖2 大鼠TTC 染色腦梗死面積比較 （±s，n=5）

圖3 各組大鼠腦組織TTC 染色結(jié)果

2.3 各組大鼠HE染色和Nissl染色結(jié)果比較 HE染色顯示，對照組大鼠海馬組織神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核仁清晰且胞質(zhì)豐富；MCAO組大鼠海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞皺縮，細(xì)胞排列松散且腫脹；與MCAO組比較，MCAO+RU.521組、麝香酮組大鼠海馬組織神經(jīng)元病理損傷減輕，形態(tài)有所恢復(fù)，細(xì)胞變異程度減輕；與麝香酮組比較，麝香酮+2′3′-cGAMP組大鼠海馬組織神經(jīng)元病理損傷加重。Nissl染色顯示，對照組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，Nissl體豐富；MCAO組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞萎縮，核質(zhì)固縮，Nissl體顯著減少；MCAO+RU.521組、麝香酮組大鼠海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)有所恢復(fù)，Nissl體增加；麝香酮+2′3′-cGAMP組大鼠海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞損傷程度較麝香酮組加重。（見圖4）

圖4 大鼠海馬組織HE 染色和Nissl 染色結(jié)果 （×400）

2.4 各組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況比較 與對照組比較，MCAO組海馬組織神經(jīng)元凋亡數(shù)目增加，凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與MCAO組比較，MCAO+RU.521組、麝香酮組神經(jīng)元凋亡數(shù)目減少，凋亡率顯著降低（P＜0.05）；MCAO+RU.521組神經(jīng)元凋亡數(shù)目和凋亡率與麝香酮組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與麝香酮組比較，麝香酮+2′3′-cGAMP組神經(jīng)元凋亡數(shù)目增加，凋亡率顯著升高（P＜0.05）。（見圖5～6）

圖5 大鼠海馬組織TUNEL 染色結(jié)果 （×400）

圖6 各組大鼠神經(jīng)元凋亡率比較 （±s，n=10）

2.5 各組大鼠炎癥因子水平比較 與對照組比較，MCAO組大鼠海馬組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著升高（P＜0.05）；與MCAO組比較，MCAO+RU.521組、麝香酮組大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著降低（P＜0.05）；MCAO+RU.521組大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平與麝香酮組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與麝香酮組比較，麝香酮+2′3′-cGAMP組大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著升高（P＜0.05）。（見圖7）

圖7 各組大鼠炎癥因子水平比較 （±s，n=10）

2.6 各組大鼠海馬組織蛋白表達(dá)比較 與對照組比較，MCAO組大鼠海馬組織IL-1β、TNF-α、cGAS、STING、p-IRF3蛋白相對表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；與MCAO組比較，MCAO+RU.521組、麝香酮組大鼠IL-1β、TNF-α、cGAS、STING、p-IRF3蛋白相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；MCAO+RU.521組大鼠各蛋白相對表達(dá)量與麝香酮組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與麝香酮組比較，麝香酮+2′3′-cGAMP組大鼠IL-1β、TNF-α、cGAS、STING、p-IRF3蛋白相對表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。（見圖8～9）

圖8 大鼠海馬組織蛋白表達(dá)Western blotting 圖

圖9 各組大鼠海馬組織蛋白相對表達(dá)量比較 （±s，n=5）

3 討論

IS是一種常見的腦血管疾病，主要是由大腦血管突然阻塞，從而限制相關(guān)區(qū)域的血液流動或供應(yīng)引起的，其中中風(fēng)會增加認(rèn)知缺陷、長期殘疾、抑郁和癡呆的風(fēng)險，嚴(yán)重影響人類健康狀況和生活質(zhì)量[9]。目前IS的主要臨床治療措施是溶栓、血栓切除術(shù)、抗血小板聚集和神經(jīng)營養(yǎng)等，以盡快恢復(fù)缺血區(qū)的腦血流和神經(jīng)功能，但這些療法的使用受時間窗口和出血風(fēng)險的限制。神經(jīng)炎癥是IS的主要病理過程。IS導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡，使小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞過度活化，釋放出高水平的炎癥因子如IL-6、IL-1β和TNF-α，并促進白細(xì)胞進入腦組織，產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應(yīng)，促進更多神經(jīng)元死亡并加重腦損傷[10]。HAN B等[11]發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞PGC-1α通過抑制神經(jīng)炎癥來防止IS后腦損傷；ZHANG Y等[12]也發(fā)現(xiàn)SerpinA3N通過減少細(xì)胞凋亡和神經(jīng)炎癥可減輕IS后腦損傷。因此，在IS后抑制炎癥反應(yīng)可緩解腦損傷。

本研究通過使用MCAO法構(gòu)建IS大鼠模型發(fā)現(xiàn)，MCAO組大鼠神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死面積顯著升高，海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞皺縮損傷，Nissl體減少，且神經(jīng)元凋亡數(shù)目增加，表明MCAO組大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重神經(jīng)功能損傷。且海馬組織IL-6、IL-1β、TNF-α含量顯著升高，表明MCAO組大鼠出現(xiàn)神經(jīng)炎癥。麝香酮在腦血管疾病中具有神經(jīng)保護作用，包括抗氧化應(yīng)激、抗缺血性損傷、抗凋亡、抗炎和觸發(fā)神經(jīng)保護等。其中麝香酮通過作為神經(jīng)保護和促血管生成劑起到對急性腦缺血再灌注損傷的保護作用[13]；麝香酮還能通過減少神經(jīng)元壞死，保護血腦屏障，改善腦缺血引起的神經(jīng)損傷[14]。本研究通過選用麝香酮鼻內(nèi)給藥的方式對MCAO組大鼠進行治療。鼻內(nèi)給藥使麝香酮能直接通過鼻黏膜或肺部的毛細(xì)血管吸收，通過鼻黏膜-腦脊液途徑直接進入腦脊液，繞過血腦屏障直接遞送到腦。麝香酮鼻腔給藥具有生物利用度高、見效快、安全、有效等特點[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，MCAO組大鼠經(jīng)麝香酮治療后，神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死面積降低，海馬組織神經(jīng)元損傷得到改善，Nissl體增加，且神經(jīng)元凋亡數(shù)目和IL-6、IL-1β、TNF-α含量減少，表明麝香酮對MCAO組大鼠神經(jīng)元功能障礙和神經(jīng)炎癥具有改善作用。

胞質(zhì)dsDNA已被證明可激活炎癥和免疫反應(yīng)。cGAS是一種關(guān)鍵的胞質(zhì)DNA傳感器，可通過合成cGAMP激活STING，觸發(fā)由STING級聯(lián)介導(dǎo)的下游促炎信號，同時炎癥因子可激活I(lǐng)RF3、NF-κB等途徑，因此cGAS-STING通路的激活被認(rèn)為與神經(jīng)病理生理學(xué)密切相關(guān)[16]。已有研究發(fā)現(xiàn)cGAS-STING參與創(chuàng)傷性腦損傷[17]、肌萎縮側(cè)索硬化癥[18]、阿爾茨海默病[19]等多種動物模型中的神經(jīng)炎癥。cGAS-STING也與IS后的腦損傷和神經(jīng)炎癥密切相關(guān)。抑制cGAS或cGAS缺失均會減弱IS后的神經(jīng)炎癥，改善腦損傷[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，MCAO組大鼠海馬組織cGAS、STING、p-IRF3蛋白表達(dá)顯著升高，表明IS可能激活cGAS-STING信號通路，參與其腦損傷和神經(jīng)炎癥；而麝香酮治療后cGAS、STING、p-IRF3蛋白表達(dá)降低，麝香酮可能通過抑制cGAS-STING信號通路的激活，改善MCAO組大鼠腦損傷和神經(jīng)炎癥。為進一步驗證麝香酮對cGAS-STING信號通路的干預(yù)作用，本研究在MCAO的基礎(chǔ)上加上cGAS抑制劑RU.521，其作用與麝香酮對神經(jīng)損傷的改善作用一致，表明麝香酮可能發(fā)揮cGAS抑制劑的作用；此外，本研究在麝香酮基礎(chǔ)上加上STING激動劑2′3′-cGAMP，麝香酮對神經(jīng)損傷的改善作用受到抑制，因此麝香酮可能抑制cGAS-STING信號通路激活發(fā)揮作用。

綜上所述，麝香酮可能通過抑制cGAS-STING信號通路激活，減少神經(jīng)元損傷，改善IS大鼠神經(jīng)炎癥。本研究為改善IS大鼠神經(jīng)損傷和神經(jīng)炎癥提供了新思路，但麝香酮對IS大鼠的其他分子機制仍有待闡明。