黃芪多糖調(diào)節(jié)HMGB1-RAGE信號(hào)通路對(duì)自身免疫性心肌炎大鼠心肌損傷的影響*

鄭 俏，狄 巖，岳思恩，張雯雯

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

心肌炎是一種心肌炎癥，可由自身免疫性疾病、感染和心臟毒性藥物誘發(fā)，往往伴隨著快速進(jìn)行性心律失常、心力衰竭及心臟性猝死，是年輕患者因心肌病導(dǎo)致死亡的主要原因[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)約1/3的自身免疫性心肌炎（experimental autoimmune myocarditis，EAM）病例最終可導(dǎo)致心力衰竭，但目前尚未研究出有效的治療方法，因此尋找新的有效治療藥物勢在必行[2]。黃芪多糖（astragalus polysaccharide,AP）是從中藥黃芪中提取的有效成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、促增殖等作用[3]。在病毒性心肌炎研究中，AP可通過抑制多種病理?xiàng)l件下炎癥基因的表達(dá)改善小鼠心肌損傷[4]。據(jù)報(bào)道，高遷移率族蛋白Box-1（high mobility group protein，HMGB1）是炎癥過程的重要細(xì)胞外介質(zhì)，晚期糖基化終產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation endproducts，RAGE）是已知的HMGB1受體。兩者結(jié)合可促進(jìn)促炎性細(xì)胞因子的釋放，參與炎癥性疾病的發(fā)展[5]，包括心肌炎[6]。本研究旨在探討AP對(duì)EAM心肌損傷的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只SPF級(jí)SD大鼠，雄性，7周齡，250～270 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2019-0008，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(京)2020-0013。將大鼠置于動(dòng)物房中，控制條件為（25±2）℃，相對(duì)濕度為（60±5）%，光照-黑暗周期為12/12 h，不禁水食。本研究通過動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：2021-00920）。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 注射用AP（批號(hào)：20220318，250 mg/瓶，天津賽諾制藥有限公司）；弗氏完全佐劑（批號(hào)：F-5881）、豬心肌肌球蛋白（批號(hào)：M0630）（美國Sigma公司）；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑（批號(hào)：P0018A）、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒（批號(hào)：C0105）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白檢測試劑盒（批號(hào)：P0012S）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；重組高遷移率組蛋白B1（recombinant high mobility histone B1，rHMGB1）（批號(hào)：JN0259）（北京百奧萊博科技有限公司）；白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELLSA試劑盒（批號(hào)：ml064292）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELLSA試劑盒（批號(hào)：ml002859）（上海酶聯(lián)科技公司）；放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation Assay，RIPA）裂解緩沖液（批號(hào)：R0020）、Masson′s染色試劑盒（批號(hào)：G1340-100）（北京索萊寶科技公司）；HMGB1（批號(hào)：ab18256）、RAGE抗體（批號(hào)：ab216329）（美國Abcam公司）。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 Sonos 5500超聲儀（美國菲利普斯公司）；BX51光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.2 方法

1.2.1 EAM大鼠模型的制備及干預(yù) 參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行制備EAM大鼠模型，首先制備抗原佐劑乳化液：將純化的豬心肌肌球蛋白溶解在0.01 md/L磷酸緩沖鹽溶液中，制備濃度為10 mg/mL的溶液，并用添加10 mg/mL結(jié)核分枝桿菌H37RA的等體積弗氏完全佐劑乳化，若豬心肌肌球蛋白完全乳化，則呈乳白色，將其滴入水平面后不會(huì)擴(kuò)散。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組、EAM組、AP組、rHMGB1組、AP+rHMGB1組，每組10只。對(duì)照組大鼠用磷酸緩沖鹽溶液乳化的弗氏完全佐劑（0.1 mL）于實(shí)驗(yàn)第0天及第7天分別給予左、右后足墊皮下注射，同時(shí)每天給予大鼠腹腔及尾部注射生理鹽水，連續(xù)3周；EAM組大鼠用上述抗原佐劑乳化液（0.1 mL）于實(shí)驗(yàn)第0天及第7天分別給予左、右后足墊皮下注射，同時(shí)每天給予大鼠腹腔及尾部注射生理鹽水，連續(xù)3周；AP組大鼠用上述抗原佐劑乳化液（0.1 mL）于實(shí)驗(yàn)第0天及第7天分別給予左、右后足墊皮下注射，同時(shí)每天給予大鼠腹腔注射30 g/kg AP，并進(jìn)行尾部注射生理鹽水，連續(xù)3周[8]；rHMGB1組大鼠用上述抗原佐劑乳化液（0.1 mL）于實(shí)驗(yàn)第0天及第7天分別給予左、右后足墊皮下注射，同時(shí)每天給予大鼠尾部注射rHMGB1，8 μg/kg，并進(jìn)行腹腔注射生理鹽水，連續(xù)3周[9]；AP+rHMGB1組大鼠用上述抗原佐劑乳化液（0.1 mL）于實(shí)驗(yàn)第0天及第7天分別給予左、右后足墊皮下注射，同時(shí)每天給予大鼠尾部注射rHMGB1，8 μg/kg，并進(jìn)行腹腔注射AP，30 g/kg，連續(xù)3周。

1.2.2 心肌功能檢測 麻醉各組大鼠，將導(dǎo)管尖端通過右頸動(dòng)脈引入左心室，使用Sonos 5500超聲儀檢測心率（heart rate，HR）、左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）和舒張末期內(nèi)徑（end-diastolic diameter，LVEDs）。

1.2.3 炎癥因子水平檢測 從大鼠股動(dòng)脈采集血液并制備血清，按照ELISA試劑盒測量炎癥因子（TNF-α、IL-6）水平。

1.2.4 心肌組織病理學(xué)檢測 分離各組大鼠心臟，將左半部分心臟固定在4%中性多聚甲醛中，在逐漸增加的乙醇濃度（70%、96%和100%）中脫水，在二甲苯中清洗，浸入石蠟中，制備5 μm厚的連續(xù)切片，然后經(jīng)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織變化，并對(duì)病理切片進(jìn)行評(píng)分[10]：4分，切片病變區(qū)域≥50%橫切面；3分，切片病變區(qū)域≥10%且＜50%；2分，切片病變區(qū)域≥10%且＜10%；0分，心肌組織正常。

1.2.5 心肌組織纖維化檢測 取“1.2.4中”制備的組織切片，按照Masson′s試劑盒要求進(jìn)行染色，隨機(jī)選取5個(gè)視野于光學(xué)顯微鏡觀察心肌組織纖維化。

1.2.6 Western blotting檢測HMGB1、RAGE蛋白表達(dá) 使用放射免疫沉淀試驗(yàn)裂解緩沖液提取右半球部分心臟組織中總蛋白質(zhì)，利用試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量，使總蛋白通過煮沸變性，通過10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE）分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到膜上，在室溫下封閉1h，將膜與以下一抗一起溫育：HMGB1、RAGE（1：1 000），并在室溫下加入山羊抗兔IgG或山羊抗鼠（1：2 000），持續(xù)孵育2 h，隨后使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑顯色，使用ImageQuant LAS 4000檢測化學(xué)發(fā)光發(fā)射的信號(hào)，并用ImageJ軟件定量分析，結(jié)果以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測心肌組織中HMGB1 mRNA、RAGE mRNA表達(dá) 將部分右半球心臟快速冷凍并儲(chǔ)存在-80 ℃，將組織在總RNA抽提試劑（Trizol）中勻漿，用苯酚-氯仿提取3次，并將總RNA溶解在10 μL無RNA酶的水中，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA。使用SYBR Green Master Mix進(jìn)行實(shí)時(shí)qRT-PCR反應(yīng)，結(jié)果以β-actin為內(nèi)部參考并通過2-ΔΔCT法分析HMGB1 mRNA、RAGE mRNA表達(dá)。引物序列如下：β-actin上游引物為5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下游引物為5'-CTGGAAG GTGGACAGCGAGG-3'；HMGB-1上游引物為5'-GCAGATGACAAGCAGCCTTA-3'，下游引物為5'-TTTGCTGCA TCAGGCTTTCC-3'；RAGE 上游引物為5'-GACTCTTAGCTGGCACTTGGAT-3'，下游引物為5'-GGACTTC ACAGGTCAGGG TTAC-3'。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 27.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AP對(duì)各組大鼠心功能指標(biāo)的影響 與對(duì)照組比較，EAM組HR、LVEDs顯著增加，LVEF顯著下降（P＜0.05）；與EAM組比較，AP組HR、LVEDs顯著降低，LVEF顯著增加（P＜0.05），但rHMGB1組HR、LVEDs顯著增加，LVEF顯著下降（P＜0.05）；與AP組比較，AP+rHMGB1組HR、LVEDs顯著增加，LVEF顯著下降（P＜0.05）；與rHMGB1組比較，AP+rHMGB1組HR、LVEDs顯著降低，LVEF顯著增加（P＜0.05），提示AP可改善EAM大鼠心功能指標(biāo)。（見表1）

表1 各組大鼠HR、LVEF 和LVEDd 比較 （±s）

表1 各組大鼠HR、LVEF 和LVEDd 比較 （±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與EAM組比較，bP＜0.05；與AP組比較，cP＜0.05；與rHMGB1組比較，dP＜0.05。

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2.2 AP對(duì)各組大鼠血清炎癥因子的影響 與對(duì)照組比較，EAM組TNF-α、IL-6水平顯著增加（P＜0.05）；與EAM組比較，AP組TNF-α、IL-6水平顯著降低（P＜0.05），但rHMGB1組TNF-α、IL-6水平顯著增加（P＜0.05）；與AP組比較，AP+rHMGB1組TNF-α、IL-6水平顯著增加（P＜0.05）；與rHMGB1組比較，AP+rHMGB1組TNF-α、IL-6水平顯著降低（P＜0.05），提示AP可抑制EAM大鼠炎癥反應(yīng)的發(fā)展。（見表2）

表2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6 水平比較（±s，pg/mL）

表2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6 水平比較（±s，pg/mL）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與EAM組比較，bP＜0.05；與AP組比較，cP＜0.05；與rHMGB1組比較，dP＜0.05。

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2.3 AP對(duì)各組大鼠心肌組織病理學(xué)的影響 對(duì)照組心肌結(jié)構(gòu)完整，炎癥細(xì)胞浸潤較少，但EAM組心肌結(jié)構(gòu)紊亂，炎癥細(xì)胞浸潤較為嚴(yán)重；AP干預(yù)后，炎癥細(xì)胞浸潤等病理損傷明顯減少，rHMGB1干預(yù)后，病理損傷較EAM組進(jìn)一步加重；但AP與rHMGB1聯(lián)合干預(yù)，病理損傷較AP干預(yù)加重，但較rHMGB1干預(yù)減輕。（見圖1）與對(duì)照組比較，EAM組病理評(píng)分顯著增加（P＜0.05）；與EAM組比較，AP組病理評(píng)分顯著降低（P＜0.05），但rHMGB1組病理評(píng)分顯著增加（P＜0.05）；與AP組比較，AP+rHMGB1組病理評(píng)分顯著增加（P＜0.05）；與rHMGB1組比較，AP+rHMGB1組病理評(píng)分顯著降低（P＜0.05），提示AP可改善EAM大鼠心肌組織病理損傷。（見表3）

圖1 HE 檢測心肌組織病理學(xué)變化 （×200）

表3 各組大鼠病理評(píng)分比較 （±s，分）

表3 各組大鼠病理評(píng)分比較 （±s，分）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與EAM組比較，bP＜0.05；與AP組比較，cP＜0.05；與rHMGB1組比較，dP＜0.05。

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2.4 AP對(duì)各組大鼠心肌纖維化的影響 對(duì)照組無顯著纖維化變性；EAM組纖維化變性較為明顯，有大量膠原纖維顯現(xiàn)；AP組心肌纖維化得到改善，但rHMGB1組纖維化變性較EAM組嚴(yán)重，AP+rHMGB1組纖維化程度與EAM組無明顯差異，提示AP可改善EAM大鼠心肌纖維化。（見圖2）

圖2 Masson′s 染色檢測心肌組織纖維化 （×200）

2.5 AP對(duì)大鼠HMGB1、RAGE蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，EAM組HMGB1、RAGE蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；與EAM組比較，AP組HMGB1、RAGE蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），但rHMGB1組HMGB1、RAGE蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；與AP組比較，AP+rHMGB1組HMGB1、RAGE蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；與rHMGB1組比較，AP+rHMGB1組HMGB1、RAGE蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），提示AP通過抑制HMGB1、RAGE蛋白表達(dá)對(duì)EAM大鼠發(fā)揮保護(hù)作用。（見圖3、表4）

圖3 心肌組織HMGB1、RAGE 蛋白表達(dá)Western blotting 圖

表4 各組大鼠心肌組織中HMGB1、RAGE 蛋白表達(dá)的比較（±s）

表4 各組大鼠心肌組織中HMGB1、RAGE 蛋白表達(dá)的比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與EAM組比較，bP＜0.05；與AP組比較，cP＜0.05；與rHMGB1組比較，dP＜0.05。

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2.6 AP對(duì)大鼠心肌組織HMGB1 mRNA、RAGE mRNA表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，EAM組HMGB1 mRNA、RAGE mRNA表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；與EAM組比較，AP組HMGB1 mRNA、RAGE mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05），但rHMGB1組HMGB1 mRNA、RAGE mRNA表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；與AP組比較，AP+rHMGB1組HMGB1 mRNA、RAGE mRNA表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；與rHMGB1 mRNA組比較，AP+rHMGB1組HMGB1 mRNA、RAGE mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05），提示AP通過抑制HMGB1、RAGE表達(dá)對(duì)EAM大鼠發(fā)揮保護(hù)作用。（見表5）

表5 各組心肌組織中HMGB1、RAGE mRNA表達(dá)的比較 （±s）

表5 各組心肌組織中HMGB1、RAGE mRNA表達(dá)的比較 （±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與EAM組比較，bP＜0.05；與AP組比較，cP＜0.05；與rHMGB1組比較，dP＜0.05。

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3 討論

心肌炎是一種與自身免疫發(fā)展有關(guān)的心肌炎癥性疾病，EAM發(fā)病病理及病理特征多與擴(kuò)張型心肌炎、病毒性心肌炎類似，是研究心肌損傷機(jī)制的有效動(dòng)物模型[10]。本研究通過后足墊皮下注射抗原佐劑乳化液方法建立EAM大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠LVEDs、HR明顯升高，LVEF值下降，提示大鼠心功能惡化，EAM大鼠模型構(gòu)建成功[11]。

天然產(chǎn)品由于其安全性、副作用小，在心血管疾病的治療中越來越受歡迎[12]。AP是黃芪的提取物，具有抗氧化、抗病毒、抗應(yīng)激、免疫平衡和抗炎等作用[13]。研究證明AP能顯著降低糖尿病大鼠的血糖、游離脂肪酸，從而減輕心肌損傷[14]。LIU Y J等[15]研究證明AP可提高心肌抗氧化能力，減緩心肌纖維化發(fā)展，有望參與臨床治療擴(kuò)張型心肌病。結(jié)合以往的研究結(jié)果，筆者推測AP在心肌炎治療方面具有很大潛力。EAM屬于免疫炎癥性疾病，可激活肥大細(xì)胞及T細(xì)胞等分泌TNF-α、IL-6等炎癥因子，引發(fā)心肌炎癥損傷，造成心肌纖維化，損害心功能[16]。HE及Masson′s染色結(jié)果顯示，EAM組心肌結(jié)構(gòu)紊亂，炎癥細(xì)胞浸潤及纖維化較為嚴(yán)重。AP可改善EAM大鼠心肌病理損傷及纖維化。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)AP可降低TNF-α、IL-6水平，提高心功能指標(biāo)，提示AP可通過降低炎癥反應(yīng)，抑制EAM心肌病理損傷及纖維化，防止EAM病情加重。

HMGB1是一種進(jìn)化上保守的染色質(zhì)結(jié)合因子。在創(chuàng)傷或感染刺激時(shí)，細(xì)胞外環(huán)境中就會(huì)被動(dòng)釋放HMGB1，向周圍細(xì)胞發(fā)出危險(xiǎn)信號(hào)，激活細(xì)胞免疫功能，并促進(jìn)組織修復(fù)[17]。RAGE是一種具有黏附分子結(jié)構(gòu)特征的跨膜受體，參與由HMGB1介導(dǎo)的多種病理過程，該通路在多種病理?xiàng)l件下表現(xiàn)出有希望的藥理學(xué)靶點(diǎn)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)EAM大鼠心肌組織中，HMGB1、RAGE蛋白及mRNA表達(dá)顯著增加，提示激活HMGB1-RAGE信號(hào)通路促進(jìn)了EAM進(jìn)展。CHEN Q F等[19]研究證明抑制HMGB1表達(dá)可改善冠狀動(dòng)脈微栓塞引發(fā)的心功能異常及心肌損傷。在EAM期間[20]，阻斷RAGE激活可減少炎癥反應(yīng)，改善心臟功能。本研究結(jié)果顯示，AP干預(yù)后，HMGB1、RAGE蛋白及mRNA表達(dá)下調(diào)，改善了EAM大鼠心肌損傷。AP可能通過抑制HMGB1-RAGE信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)EAM大鼠的心肌保護(hù)作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)推測，本研究以HMGB1激活劑-rHMGB1進(jìn)行回復(fù)驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rHMGB1逆轉(zhuǎn)了AP對(duì)EAM大鼠的保護(hù)作用，表明AP可能通過抑制HMGB1-RAGE信號(hào)通路改善EAM大鼠心肌損傷。

綜上所述，AP可抑制EAM大鼠炎癥反應(yīng)，改善心肌損傷，可能與抑制HMGB1-RAGE信號(hào)通路有關(guān)，但由于機(jī)制復(fù)雜，涉及上下游相關(guān)蛋白較多，后續(xù)將繼續(xù)開展相關(guān)機(jī)制探索。