陳雨昕，胡月芳

（1.賀州學(xué)院 廣西碳酸鈣資源綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 材料與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 賀州 542899；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院，廣西 南寧 530000）

熒光碳點(diǎn)（CDs）主要包含碳量子點(diǎn)（CQDs）、石墨烯量子點(diǎn)（GQDs）以及聚合物點(diǎn)（PDs）等類型［1-2］。CQDs 具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性、優(yōu)異的生物相容性、良好的水溶性及優(yōu)異的光電性能［3-5］，已發(fā)展成為一類深受歡迎的新型碳納米材料，是納米技術(shù)領(lǐng)域中最為活躍的研究課題之一。近年來，CQDs已在環(huán)境監(jiān)測(cè)［6］、光催化［7］、熒光檢測(cè)［8］及生物成像等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。隨著低碳環(huán)保理念的推廣，綠色化學(xué)也成為碳納米材料研究的一個(gè)趨勢(shì)，研究者們?cè)絹碓綗嶂杂诶贸Ｒ姷纳镔|(zhì)資源，基于一些簡(jiǎn)便、綠色、高效的方法合成生物質(zhì)碳量子點(diǎn)（BCQDs）。與其他碳源相比，綠色生態(tài)友好的生物質(zhì)碳源不僅具有價(jià)格低廉、獲取方便及來源廣泛等優(yōu)點(diǎn)，還因含有多種元素，使得制備時(shí)不需添加外部雜原子即可得到各種性能優(yōu)異的氮自摻雜碳量子點(diǎn)（N-CQDs）［9］。此外，采用生物質(zhì)制備碳量子點(diǎn)還可使低價(jià)值的生物質(zhì)廢棄物轉(zhuǎn)化為有價(jià)值的材料，實(shí)現(xiàn)變廢為寶，符合資源再利用的綠色低碳環(huán)保主旨。近年來，各種生物質(zhì)包括枇杷葉［10］、桂花籽皮［11］、綠蘿葉［12］、黃豆［13］、韭菜［14］等已被用作碳源來制備系列生物質(zhì)CQDs。

溫度是生命體最基本的參數(shù)之一，對(duì)活細(xì)胞內(nèi)的酶活性、物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞分裂和能量代謝等生化反應(yīng)具有很大的影響［15］。在一些基于熱效應(yīng)治療腫瘤的方法中，探究細(xì)胞內(nèi)的溫度分布及胞內(nèi)區(qū)域溫度變化，是評(píng)估腫瘤治療效果的重要生理參數(shù)指標(biāo)［16］。因此，對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)溫度的高分辨率、高靈敏度測(cè)量，是一項(xiàng)非常有意義的研究工作。傳統(tǒng)的溫度測(cè)量方法通常是通過物體某些隨溫度變化的特征進(jìn)行間接測(cè)量，比較常見的檢測(cè)工具有水銀溫度計(jì)、耳溫儀及熱電偶等［17］。但這些檢測(cè)方法響應(yīng)速度慢，不能靈敏反映溫度的變化，且不能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞體內(nèi)的溫度測(cè)量，故在生物領(lǐng)域的應(yīng)用受到限制。據(jù)報(bào)道，碳量子點(diǎn)表面狀態(tài)（缺陷和陷阱）的非輻射通道會(huì)受到溫度的影響，溫度升高會(huì)激活更多的非輻射通道，使更多的激發(fā)態(tài)電子通過非輻射過程返回到基態(tài)，導(dǎo)致碳量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度減弱，故碳量子點(diǎn)具有作為溫度傳感器的極大潛能［18］。

本研究以西紅柿為碳源和氮源，采用微波合成法在最佳合成條件下制備得到N-CQDs，對(duì)其形貌、結(jié)構(gòu)、光電性能和溫敏性能進(jìn)行分析，考察了所合成N-CQDs 的毒性和生物相容性，并將其作為熒光納米探針應(yīng)用于細(xì)胞溫度傳感的研究，探討了基于其開發(fā)細(xì)胞無損測(cè)量納米溫度計(jì)的可行性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Tecnai G2 F20 S-TWIN 型場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡（TEM，荷蘭Philips公司）；Tecnai G2 F20 S-TWIN型X 射線光電子能譜儀（XPS，荷蘭Philips 公司）；Perkin Elmer Spectrum Two 型傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR，珀金埃爾默企業(yè)管理（上海）有限公司）；LS45 型熒光分光光度計(jì)（美國(guó)Agilent Technologies 公司）；X-5 型紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；CHI660e 型電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司，鉑絲電極為對(duì)電極，飽和銀-氯化銀電極為參比電極，玻碳電極（GCE）為工作電極）；RA8恒溫循環(huán)器（德國(guó)LAUDA公司）；Zeiss LSM710激光掃描共聚焦顯微鏡（德國(guó)Zeiss公司）。

小鼠乳腺癌細(xì)胞（4T1）（上海林克生物科技有限公司）；胎牛血清（FBS）、DMEM 高糖培養(yǎng)基、胰酶、青霉素-鏈霉素和MTT（美國(guó)Sigma 公司）；氯化鈉（NaCl）和殼聚糖（C6H11NO4）n（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；氧化鋁（Al2O3）、葡萄糖（C6H12O6·H2O）（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、十二水合磷酸二氫鈉（NaH2PO4·12H2O）和二水合磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）（西隴化工股份有限公司）。對(duì)照實(shí)驗(yàn)所使用的CQDs為課題組自制。

1.2 N-CQDs的制備

通過對(duì)合成時(shí)間（3、6、8、10、12 min）、合成溫度（高火、中高火、中火）進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳合成時(shí)間為8 min、最佳合成溫度為中高火。具體步驟如下：將新鮮的西紅柿用去離子水洗凈榨汁，取5 g 西紅柿汁（30 mL）置于微波爐中高火加熱8 min，直到紅色液體變?yōu)樽睾谏镔|(zhì)，將該物質(zhì)進(jìn)行研磨，加適量去離子水溶解后離心30 min（4 000 r/min），收集上層棕色混合液。再將收集到的棕色混合物置于透析膜（截留分子量1 000）中在去離子水中透析72 h（每間隔3～4 h 換一次水），可得深黃色N-CQDs 透析液，于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 N-CQDs的表征

N-CQDs的形態(tài)和功能基團(tuán)及其分子結(jié)構(gòu)由TEM、XPS、FT-IR 進(jìn)行表征；光學(xué)性質(zhì)用熒光分光光度計(jì)、紫外分光光度計(jì)和紫外燈進(jìn)行研究。

1.4 熒光量子產(chǎn)率的測(cè)定

以含0.1 mol·L-1H2SO4溶液的硫酸奎寧作為標(biāo)準(zhǔn)參考物［19］，采用公式（1）計(jì)算N-CQDs 溶液的熒光量子產(chǎn)率（Q）。

式中，Q、QR分別為N-CQDs和標(biāo)準(zhǔn)參考物的熒光量子產(chǎn)率；A和AR為兩者在365 nm激發(fā)波長(zhǎng)下的紫外吸光度；I和IR為該激發(fā)波長(zhǎng)下N-CQDs和標(biāo)準(zhǔn)參考物的熒光峰面積；η和ηR為對(duì)應(yīng)的折光系數(shù)。

1.5 N-CQDs穩(wěn)定性研究

實(shí)驗(yàn)考察了NaCl 濃度對(duì)N-CQDs 熒光強(qiáng)度的影響［20］。配制濃度為30、60、90、120、150、180、210 mmol/L 的NaCl 溶液，分別取1 mL NaCl 溶液與1 mL 質(zhì)量濃度為10 μg/mL 的N-CQDs 等體積混合，將混合液置于5 mL比色皿中，在376 nm激發(fā)波長(zhǎng)和440 nm發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)量熒光強(qiáng)度。

同時(shí)考察了不同pH 值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）對(duì)N-CQDs熒光強(qiáng)度的影響［21］。分別取1 mL 質(zhì)量濃度為10 μg/mL 的N-CQDs 與2 mL PBS 緩沖溶液混合，將混合液置于5 mL比色皿中，于376 nm激發(fā)波長(zhǎng)下測(cè)定其熒光強(qiáng)度。

1.6 N-CQDs電化學(xué)性能的研究

用砂紙打磨GCE，去除其表面的氧化膜，先后使用0.3 μm 和0.05 μm 的氧化鋁粉末反復(fù)打磨拋光，并使用乙醇和去離子水超聲清洗，烘干備用。將3 mg CQDs或N-CQDs倒入1 mL殼聚糖溶液（5 mg/L）中制備混合液，取一滴該混合液滴至GCE表面，低溫烘干，制備得到CQDs或N-CQDs修飾的GCE。

將修飾好的CQDs/GCE 和N-CQDs/GCE 置于1 mmol/L K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6（摩爾比1∶1）和0.1 mol/L PBS（pH 7.5）的混合溶液中，進(jìn)行循環(huán)伏安（CV）掃描；置于5 mmol/L K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6（摩爾比1∶1）和0.5 mol/L KNO3的混合溶液中，進(jìn)行電化學(xué)阻抗（EIS）掃描。

1.7 N-CQDs溫敏性能分析

使用恒溫水循環(huán)器連接熒光分光光度計(jì)進(jìn)行樣品溫度控制，通過外接恒溫系統(tǒng)對(duì)N-CQDs 納米顆粒水溶液進(jìn)行加熱，分別測(cè)定其在不同溫度下的熒光光譜。

1.8 細(xì)胞毒性及細(xì)胞傳感性能研究

用MTT 法進(jìn)行N-CQDs 生物毒性研究。在7 個(gè)培養(yǎng)皿中分別添加0、100、150、200、250、300、350 μg/mL 的N-CQDs溶液，隨后加入20 μL 20% MTT 溶液孵育16 h。向各培養(yǎng)皿中加入100 μL二甲亞砜，反應(yīng)15 min。將培養(yǎng)皿置于570 nm 的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定儀中進(jìn)行光學(xué)測(cè)量，考察N-CQDs 的生物毒性。

用胰酶消化4T1 細(xì)胞，然后將細(xì)胞懸浮液接種至4 個(gè)35 mm 的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，并置于CO2含量為5%、溫度37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。隨后將4 個(gè)培養(yǎng)皿中的4T1 細(xì)胞與10 μg/mL N-CQDs 及高糖細(xì)胞培養(yǎng)基在37 ℃下孵育2 h。使用pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液沖洗3次，并通過外接恒溫系統(tǒng)緩慢加熱（注意控制細(xì)胞的原位溫度），使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞形貌。檢測(cè)之前，將設(shè)置溫度點(diǎn)（20、30、40、50、60 ℃）平衡5 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 N-CQDs結(jié)構(gòu)及組成

利用TEM、FT-IR 等手段對(duì)N-CQDs 的粒徑分布、表面成分組成等進(jìn)行研究。從圖1A 可以看出，合成的碳點(diǎn)為較均一的顆粒球形小圓點(diǎn)，分散性良好，平均粒徑約3.4 nm。由FT-IR 可知，1 638 cm-1處為C=C 鍵的伸縮振動(dòng)，1 886 cm-1處為C=O 的彎曲振動(dòng)，3 306 cm-1處為O—H 鍵的彎曲振動(dòng)（圖1B）。該結(jié)果表明N-CQDs表面存在大量的羧基和羥基等親水基團(tuán)，具有良好的水溶性［22］。

采用XPS 考察N-CQDs 的表面元素構(gòu)成，結(jié)果顯示，N-CQDs 全譜圖（圖2A）中531.9、399.9、284.9 eV 處的峰分別對(duì)應(yīng)O1s、N1s和C1s 3 個(gè)特征峰［23］，說明該西紅柿碳量子點(diǎn)的主要組成元素為C、N 和O。元素含量分析結(jié)果表明，該N 自摻雜CQDs 中C、N、O 的相對(duì)元素百分含量分別為65.24%、1.48%和30.28%。圖2B為C1s的XPS高分辨圖譜，其在286.4 eV和284.8 eV處出現(xiàn)的兩個(gè)發(fā)射峰分別歸屬為C—O 和C=C/C—C 鍵［24］；圖2C 為N1s 的XPS 高分辨圖譜，其在399.5 eV 和403.0 eV 處的兩個(gè)發(fā)射峰分別歸屬為C—N—C 和C—N 鍵；O1s 的XPS 高分辨圖譜（圖2D）在531.8 eV 和532.9 eV 處的兩個(gè)擬合峰分別歸屬為O=C 和C—O 鍵［25］。XPS 測(cè)定結(jié)果表明該碳量子點(diǎn)為氮摻雜碳量子點(diǎn)，產(chǎn)率為44.9%，經(jīng)式（1）計(jì)算可得到N—CQDs的量子產(chǎn)率為18.9%。

圖2 N-CQDs的XPS全譜圖（A），C1s分譜（B），N1s分譜（C），O1s分譜（D）Fig.2 XPS full spectrum（A），C1s spectrum（B），N1s spectrum（C），O1s spectrum（D） of N-CQDs

圖3 為N-CQDs 的XRD 圖，其在22.3°處的寬衍射峰為無定形碳結(jié)構(gòu)的（002）晶面［26］，說明所合成的量子點(diǎn)為無定形結(jié)構(gòu)。

圖3 N-CQDs的XRD圖Fig.3 XRD pattern of N-CQDs

2.2 N-CQDs光學(xué)性能分析

N-CQDs 內(nèi)部的π-π*電子躍遷［27］使得其在波長(zhǎng)284 nm 處出現(xiàn)UV-Vis 吸收峰（圖4A）；由圖4B 可知，N-CQDs的最大激發(fā)和發(fā)射峰分別位于380 nm和453 nm。N-CQDs（10 μg/mL）在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的發(fā)射光譜如圖4C所示，結(jié)果表明，隨著激發(fā)波長(zhǎng)由360 nm增加至460 nm，N-CQDs的熒光發(fā)射峰發(fā)生紅移，表現(xiàn)出明顯的激發(fā)波長(zhǎng)依賴性。N-CQDs 的激發(fā)波長(zhǎng)依賴現(xiàn)象，可能因其發(fā)射位置和顆粒大小差異所致［28］。圖4D 為N-CQDs 溶液在自然光和紫外燈光下的照射效果比對(duì)圖，在紫外燈下N-CQDs 溶液發(fā)射出明亮的藍(lán)光。

圖4 N-CQDs的UV-Vis圖（A），N-CQDs的最大激發(fā)和最大發(fā)射波長(zhǎng)圖譜（B），N-CQDs在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光發(fā)射光譜圖（C），N-CQDs在自然光（左）和紫外燈（右）下的發(fā)光圖（D）Fig.4 UV-Vis spectrum（A） and spectra of maximum excitation and maximum emission wavelength（B） of N-CQDs，emission fluorescence spectra of N-CQDs at different excitation wavelengths（C），diagrams of N-CQDs under natural light（left） and ultraviolet lamp（right） exposure（D）

2.3 N-CQDs熒光穩(wěn)定性分析

考察了10 μg/mL 的N-CQDs 在不同NaCl 濃度和pH 值下的熒光強(qiáng)度穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NCQDs 溶液的熒光強(qiáng)度在不同濃度NaCl 溶液和不同pH值的酸堿性溶液中均保持較穩(wěn)定的狀態(tài)，表明N-CQDs具有優(yōu)異的耐鹽性和熒光穩(wěn)定性。

2.4 N-CQDs電化學(xué)性能分析

碳量子點(diǎn)的電化學(xué)性能也會(huì)對(duì)其細(xì)胞溫度熒光傳感性能產(chǎn)生較大的影響，如當(dāng)量子點(diǎn)的電荷狀態(tài)發(fā)生變化時(shí)，其熒光強(qiáng)度、熒光壽命及熒光波長(zhǎng)均將發(fā)生變化，從而影響細(xì)胞溫度熒光傳感的準(zhǔn)確性與精密性。因此，在制備細(xì)胞溫度熒光傳感器時(shí)，也需要對(duì)碳量子點(diǎn)的電化學(xué)性能進(jìn)行優(yōu)化。

采用循環(huán)伏安法和電化學(xué)阻抗法分析N-CQDs的電化學(xué)性能，并以CQDs作為對(duì)照。如圖5A所示，CQDs和N-CQDs修飾的GCE的CV曲線均出現(xiàn)閉合的氧化還原峰。CQDs修飾的GCE的氧化峰和還原峰對(duì)稱性稍差，是準(zhǔn)可逆過程；而N-CQDs修飾的GCE的CV曲線中的還原峰和氧化峰比較對(duì)稱，表明在電極表面發(fā)生了反應(yīng)速率較快的可逆過程。原因可能是，相比CQDs，N-CQDs 表面所含的基團(tuán)較豐富，使得電極表面的電活性面積增大，電流的運(yùn)輸能力提高。CV圖譜結(jié)果表明，N-CQDs具有比CQDs更為優(yōu)異的光電性能。

圖5 CQDs、N-CQDs修飾玻碳電極的CV圖譜（A）及裸電極、CQDs、N-CQDs修飾電極的EIS圖譜（B）Fig.5 CV diagrams of CQDs and N-CQDs modified GCE（A） and EIS diagrams of bare GCE，CQDs and N-CQDs modified GCE（B）

電化學(xué)阻抗法也被用于考察N-CQDs修飾的GCE的電化學(xué)性能，如圖5B所示，裸GCE的電化學(xué)阻抗非常小，修飾CQDs后電化學(xué)阻抗得到明顯增強(qiáng)；而N-CQDs修飾的GCE的電化學(xué)阻抗增強(qiáng)更大，即N-CQDs修飾的GCE電極的電化學(xué)性能更為優(yōu)異。

2.5 N-CQDs溫敏性能分析

考察了溫度（25～65 ℃）對(duì)N-CQDs 熒光強(qiáng)度的影響。如圖6A 所示，隨著溫度的升高，N-CQDs 的熒光強(qiáng)度明顯降低，65 ℃時(shí)N-CQDs 的相對(duì)熒光強(qiáng)度猝滅了51%；當(dāng)溫度從65 ℃降回25 ℃時(shí)，NCQDs 的熒光強(qiáng)度逐漸得到恢復(fù)。在25～65 ℃范圍內(nèi)，N-CQDs 的熒光強(qiáng)度（IF）與溫度（t）呈良好的線性關(guān)系（圖6B），線性方程為IF=1296.54-14.95t，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.998 7。結(jié)果表明，在25～65 ℃范圍內(nèi)，N-CQDs的熒光強(qiáng)度顯示出良好的可逆性，在該范圍內(nèi)的溫度變化不會(huì)對(duì)N-CQDs表面的熒光結(jié)構(gòu)造成永久性破壞。N-CQDs的熒光強(qiáng)度隨著溫度升高而減弱的現(xiàn)象可能是由于溫度升高使N-CQDs發(fā)生聚集引起了明顯的熒光猝滅［28］。N-CQDs 的熒光強(qiáng)度隨溫度的升高呈線性下降，表明N-CQDs 具有優(yōu)異的溫敏性能，有望開發(fā)成溫度傳感器。

圖6 溫度對(duì)N-CQDs熒光強(qiáng)度的影響（A）及N-CQDs熒光強(qiáng)度與溫度的線性關(guān)系（B）Fig.6 Effect of temperature on fluorescence intensity of N-CQDs（A） and linear relationship between fluorescence intensity of N-CQDs and temperature（B）

2.6 N-CQDs細(xì)胞毒性分析

采用MTT 法測(cè)定了不同質(zhì)量濃度的N-CQDs 對(duì)4T1 細(xì)胞的毒性。從圖7 可知，將不同質(zhì)量濃度的NCQDs 與4T1 細(xì)胞共孵育后，后者仍呈現(xiàn)出良好的細(xì)胞活性，當(dāng)N-CQDs為350 μg/mL時(shí)，細(xì)胞活性為原來的94.2%。結(jié)果表明該N-CQDs的細(xì)胞毒性幾乎可以忽略不計(jì)，具有良好的生物相容性，在活細(xì)胞成像領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。

圖7 不同質(zhì)量濃度N-CQDs下細(xì)胞毒性測(cè)試Fig.7 Cytotoxicity test in the presence of N-CQDs at different mass concentrations

2.7 N-CQDs的細(xì)胞溫度傳感性能分析

從圖8A 可以看出，N-CQDs 孵育的4T1 細(xì)胞在紫外光激發(fā)下發(fā)出明亮的藍(lán)光，證明N-CQDs 具有良好的細(xì)胞膜穿透性，可用于細(xì)胞成像。圖8A～E 顯示，當(dāng)從25 ℃緩慢加熱至65 ℃時(shí)，N-CQDs 的熒光強(qiáng)度逐漸減弱。從細(xì)胞明場(chǎng)圖片（圖8F）可以看出，細(xì)胞和N-CQDs 孵育后發(fā)育良好，未出現(xiàn)明顯損傷，說明該N-CQDs 對(duì)細(xì)胞的毒理性低，通過對(duì)比細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，即可得到細(xì)胞的溫度變化信息，所制備的N-CQDs有望用于活細(xì)胞溫度的探測(cè)及成像。

圖8 N-CQDs孵育的4T1細(xì)胞在不同溫度下的共聚焦顯微鏡圖Fig.8 Confocal microscopy imagings of 4T1 cells incubated with N-CQDs at different temperatures

3 結(jié) 論

本研究以生物質(zhì)西紅柿為原材料，通過微波法制備得到熒光強(qiáng)度強(qiáng)、水溶性穩(wěn)定的氮自摻雜碳量子點(diǎn)N-CQDs。TEM、UV-Vis、FT-IR、XPS、熒光、電化學(xué)分析結(jié)果顯示，N-CQDs 表面富含羥基、羧基等親水基團(tuán)，有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，光學(xué)性能優(yōu)良，電化學(xué)性能優(yōu)異，具有良好的溫度傳感性能及生物相容性，可應(yīng)用于活細(xì)胞的溫度探測(cè)及成像，在溫度響應(yīng)的熒光傳感生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。