唐亞新，胡巧云，唐小明，王衛(wèi)國，彭 志，謝怡靈，張 坤，王昌建，魯杏華，范仲鑫，黎滿香

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410128；2. 湖南省動物疫病預(yù)防控制中心，湖南長沙 410014）

豬瘟（classical swine fever，CSF）、豬偽狂犬?。╬seudorabies，PR）、豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）均為高度接觸性傳染病，感染后嚴重影響豬群健康，給養(yǎng)殖場帶來巨大經(jīng)濟損失[1]。PR 是由偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）引起的，豬只感染后通常表現(xiàn)呼吸困難、神經(jīng)癥狀以及母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎等臨床癥狀。PR 流行具有一定規(guī)律性，目前大規(guī)模流行已得到有效控制，主要為零星散發(fā)[2-3]。CSF 是由豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病，發(fā)病率和死亡率均較高。CSF 流行沒有季節(jié)性特點，過去以暴發(fā)性流行為主，近年來轉(zhuǎn)變?yōu)榈貐^(qū)性散發(fā)流行，且具有一定周期性（一般為3～4 年）[3]。PRRS 的致病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV），1996 年中國大陸首次分離到PRRSV，2006 年暴發(fā)了以高熱、高發(fā)病率、高死亡率為特征的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征（HP-PRRS），給養(yǎng)豬行業(yè)造成巨大損失[4-5]。2012年，與美國NADC30 毒株基因組結(jié)構(gòu)類似的PRRSV開始在我國出現(xiàn)，臨床被命名為類NADC30 毒株[6]，其極易與其他毒株重組，且重組機制復(fù)雜，現(xiàn)己成為威脅我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要毒株類型之一。2017 年我國首次報道并分離到類NADC34 毒株，該毒株有發(fā)展為優(yōu)勢毒株的趨勢[7]，目前市場上所用的商品化疫苗對該毒株不能形成較好的交叉保護力，這給PRRS 綜合防控帶來了一定困難[8]。

為了解湖南省2021—2023 年無害化處理場病死豬CSFV、PRV、PRRSV 污染情況，對1 825 份組織樣品進行了CSFV、PRV、PRRSV 檢測，并對2022 年衡南縣陽性樣品進行了分型及Nsp2基因測序，以期為養(yǎng)殖場疫病防控與診斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采集湖南省14 個市州無害化處理場病死豬淋巴結(jié)、脾臟與耳尖等組織共1 825 份（每頭豬采集其中1 種樣品）。其中，2021 年從10 個市州共采集樣品386 份，衡陽市選取2 個場采集樣品80份，其余市州各選取1個場采集樣品20～40份，全年采樣1 次；2022 年從8 個市州共采集樣品352份，從衡南縣無害化處理場每月采集樣本約20 份，共采集257 份，其余市州各選取1 個場采集樣品10～15 份，全年采樣1 次；2023 年從14 個市州共采集樣品1 087 份，每個市州選取1～2 個場，每個場每月采集樣品10 份。樣品信息見表1。

表1 14 個市州無害化處理場采集樣品種類及數(shù)量 單位：份

1.1.2 主要試劑 病毒DNA/RNA 提取試劑盒，購自西安天隆科技有限公司；非洲豬瘟病毒（ASFV）、PRV、CSFV、PRRSV 四通道RT-qPCR 檢測試劑盒（TG119），NA-PRRSV、HP-PRRSV、類NADC30 毒株三通道RT-qPCR 檢測試劑盒（TG120），購自湖南國測生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix，購自北京天根生化科技有限公司；2×TransStart Fast Pfu PCR SuperMix，購自北京全式金生物有限公司；6×Loading Buffer、DL 2 000 DNA Marker，購自廣州東盛生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 取組織樣品0.2 g 置于2 mL 離心管中，加入1.0 mL 生理鹽水，置于組織研磨儀中震蕩30 s，8 000g離心3 min 后取上清，按病毒DNA/RNA 提取試劑盒說明書提取總RNA/DNA。

1.2.2 病原檢測 將提取的RNA/DNA 模板用ASFV、PRV、CSFV、PRRSV 四通道RT-qPCR 檢測試劑盒進行CSFV、PRV、PRRSV 檢測，操作步驟與反應(yīng)條件參考試劑盒說明書進行，每次檢測均設(shè)置陰性與陽性對照。結(jié)果判定：Ct ≤37 為陽性，Ct ≥40 為陰性，37 ＜Ct ＜40 為可疑，需重提核酸復(fù)核，若與之前結(jié)果一致則判為陽性。

1.2.3 PRRSV 分型檢測 對衡南縣無害化處理場PRRSV 陽性樣品用NA-PRRSV、HP-PRRSV、類NADC30 毒株三通道RT-qPCR 檢測試劑盒進行分型檢測。

1.2.4 PRRSVNsp2基因PCR 擴增 參照文獻[9]合成PRRSVNsp2基因引物，對20 份衡南縣無害化處理場PRRSV 陽性樣品進行Nsp2基因擴增。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR 反應(yīng)體系：2×TransStart Fast Pfu PCR SuperMix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，cDNA 模板3.0 μL，DEPC 水7.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。擴增的目的片段分別為經(jīng)典株1 067 bp、HP-PRRSV 967 bp、類NADC30 毒株670 bp。將擴增產(chǎn)物送至北京擎科生物（長沙）有限公司測序。

1.2.5 PRRSVNsp2基因遺傳進化分析 用MEGA 5 軟件對2022 年衡南縣無害化處理場PRRSV 陽性樣品Nsp2基因序列進行遺傳進化分析。

2 結(jié)果

2.1 CSFV、PRV、PRRSV 污染情況

2.1.1 單重污染 結(jié)果（表2）顯示：1 825 份無害化處理場病死豬樣品的CSFV、PRV、PRRSV陽性檢出率分別為3.01%、1.81%、30.14%。CSFV 檢出率較低，其中2023 年檢出率略高，為3.58%；PRRSV 檢出率遠高于CSFV 和PRV，檢出率逐年升高，2023 年檢出率達到38.45%。

表2 CSFV、PRV、PRRSV 陽性檢出率 單位：%

2.1.2 雙重及三重污染 結(jié)果（表3）顯示：2021—2022 年未檢出三重混合污染，2023 年檢出1 例三重混合污染，三重污染率為0.05%；2021—2023 年分別檢出2 例、5 例、39 例雙重污染，呈逐年上升趨勢，平均雙重污染率為2.52%（46/1 825），且大多是PRRSV 與其他2 種病原的混合污染。

表3 雙重及三重污染率 單位：%

2.2 衡南縣無害化處理場檢測

2.2.1 PRRSV 檢測 對2022 年衡南縣無害化處理場采集的257 份組織樣本進行PRRSV 檢測。結(jié)果顯示，陽性檢出率為24.12%（62/257），以春、冬季陽性率較高，分別為38.71%（24/62）、24.19%（15/62），夏季為20.97%（13/62），秋季為16.12%（10/62）。

2.2.2 PRRSV 分型 對衡南縣無害化處理場62 份陽性樣品進行NA-PRRSV、HP-PRRSV、類NADC30 毒株分型檢測，發(fā)現(xiàn)NA-PRRSV、類NADC30 毒株、HP-PRRSV 陽性檢出率分別為98.39%（61/62）、43.55%（27/62）、20.97%（13/62）。

2.2.3 PRRSVNsp2基因擴增 以20 份衡南縣無害化處理場PRRSV 陽性樣品為模板，進行Nsp2基因擴增。結(jié)果（圖1）顯示，分別在967、670 bp 處得到與預(yù)期大小一致的目的片段。經(jīng)MegAlign 軟件比對分析，1 條序列存在“1+29”個不連續(xù)氨基酸缺失，與HP-PRRSV 特征一致；17 條序列存在“111+1+19”個不連續(xù)氨基酸缺失，與類NADC30 毒株特征一致。

M. DL 2 000 Marker；1. 陰性對照；6、18、23、24、29、30、31. 陽性樣本。圖1 PRRSV-Nsp2 基因擴增結(jié)果

2.2.4 PRRSVNsp2基因遺傳進化分析 結(jié)果（圖2）顯示：6 號樣本與HP-PRRSV 代表株HUN4、JXA1 聚為1 個分支；17 條序列與類NADC30 毒株聚為1 個大分支，在該大分支內(nèi)又分別聚為4 個小分支，且46 號樣本單獨聚為1 個分支，2 號樣本與WUH5 親緣關(guān)系較近。

●為樣本序列。圖2 PRRSV-Nsp2 遺傳進化樹

3 分析與討論

本試驗對2021—2023 年湖南省無害化處理場病死豬進行采樣檢測，發(fā)現(xiàn)CSFV、PRV、PRRSV的陽性檢出率分別為3.01%、1.81%、30.14%。CSFV 與PRV 均維持在較低污染水平，且CSFV的Ct 值均較高，不排除檢測到CSFV 弱毒疫苗的情況，說明湖南省近3 年CSF 與PR 防控效果較好，免疫接種工作成效顯著，使豬群獲得了較好的免疫保護力。PRRSV 的污染率較高，說明豬群的PRRSV感染較為嚴重，且PRRS為免疫抑制性疫病，易與其他病原發(fā)生混合感染，這增加了PRRS 的防控難度，需引起足夠重視。

近年來，CSFV、PRV、PRRSV的臨床感染情況越來越復(fù)雜[3]，豬只易發(fā)生繼發(fā)或混合感染。李志賢等[10]報道了賀州市2018—2019 年“PRRSV+CSFV”陽性率為0.57%，“PRRSV+PRV”陽性率為0.28%，“PRV+CSFV”陽性率為0；宋玉慧[11]報道了河南省7.53%發(fā)病豬群檢出“CSFV+PRRSV”，3.42% 發(fā)病豬群檢出“CSFV+PRV”，6.16% 發(fā)病豬群檢出“PRRSV+PRV”；徐麗華等[12]發(fā)現(xiàn)“PRRSV+CSFV”的雙重污染率最高，其次是“PRRSV+PRV”；向乾裕等[1]報道了2019—2021 年湖南洞口地區(qū)混合污染情況，發(fā)現(xiàn)以雙重、三重污染為主。本研究中2021—2023 年湖南省無害化處理場以雙重污染為主，“PRRSV+CSFV”陽性率為1.92%，“PRRSV+PRV”陽性率為0.55%，“PRV+CSFV”陽性率最低為0.05%，三重污染只在2023 年檢出1 例，與上述報道基本一致。

PRRSV 在3 種病原中檢出率最高，因此對衡南縣無害化處理場的PRRSV 進行了檢測分析。結(jié)果顯示，PRRSV 主要流行毒株為譜系1 類NADC30 毒株。遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)，17 個PRRSV序列與類NADC30 毒株聚為1 個大分支，在該大分支內(nèi)又分別聚為4 個小分支，表現(xiàn)出遺傳多樣性。姚春雷等[13]對2022 年浙江省37 份PRRSV 陽性樣品進行測序發(fā)現(xiàn)，譜系1 占比最高（23/37）；顧文源等[14]對2022 年—2023 年上半年15 株河北省代表性PRRSV 毒株進行序列測定，發(fā)現(xiàn)10 株屬于譜系1；劉強德等[15]研究發(fā)現(xiàn)，類NADC30 毒株已成為新疆北疆豬場主要流行毒株；Zhou 等[16]發(fā)現(xiàn)，我國東部地區(qū)類NADC30 株占比較大，檢出率有所上升，且流行呈現(xiàn)多樣化；Zhao 等[17]發(fā)現(xiàn)，DJY-19 起源于北美NADC30 株，之后與我國的TJ、JXA1 株發(fā)生了重組。由于PRRSV 缺乏RNA 聚合酶校正功能，基因組在復(fù)制過程中易出現(xiàn)堿基突變、插入和缺失等情況，具有高度變異性[18]，因此需持續(xù)加強PRRSV 的遺傳變異監(jiān)測，以掌握其變異情況。

4 結(jié)論

2021—2023 年，湖南省無害化處理場CSFV、PRV 污染率維持在較低水平，說明這兩種疫病的防控效果較好，建議繼續(xù)做好CSF 和PR 的免疫接種及效果評估工作，防止發(fā)生大流行；PRRSV 污染率較高，呈逐年上升趨勢，其中類NADC30 毒株為優(yōu)勢流行毒株，需要持續(xù)加強PRRSV 的遺傳變異監(jiān)測及養(yǎng)殖場的飼養(yǎng)管理和生物安全管理，以保障豬群生產(chǎn)安全。