黃欣悅 龔旭 郭維維 張滋彬 公梓昊 綜述 王忠山 審校

近幾年口腔流行病學(xué)調(diào)查顯示,牙周疾病以高達90%的患病率成為中國人群中最常見疾患之一[1]。牙周疾病不僅會導(dǎo)致牙槽骨的不可逆性吸收,影響咀嚼功能及美觀,降低生活質(zhì)量[2],還和心血管疾病、2型糖尿病(T2DM)等全身系統(tǒng)性疾病相互影響[3-4]。牙周病現(xiàn)有治療包括牙周基礎(chǔ)治療、翻瓣手術(shù)、引導(dǎo)性骨再生,但僅能控制疾病進展,骨修復(fù)能力有限[5]。近年來,牙周組織再生成為牙周病治療研究中的熱點和挑戰(zhàn)。

外泌體是一類來源于核內(nèi)體的小囊泡結(jié)構(gòu),直徑約30～160 nm,由細胞質(zhì)中內(nèi)涵體界膜向內(nèi)凹陷形成管腔狀囊泡,經(jīng)過組裝逐步具備動態(tài)亞細胞結(jié)構(gòu)。當(dāng)其運動至細胞膜后在信號分子指導(dǎo)下以外出芽方式形成顆粒狀小囊泡并釋放到細胞外環(huán)境[6]。Skotland 等[7]發(fā)現(xiàn)外泌體具有脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)。此外還發(fā)現(xiàn)外泌體含多種母細胞源性生物學(xué)信息,既能清除細胞中多余或不必要物質(zhì),維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),又能在細胞之間傳遞親本細胞的特異性物質(zhì)[8]。

1 不同細胞來源外泌體

不同組織細胞來源的外泌體具有不同的生物學(xué)特征[9-10]。當(dāng)組織出現(xiàn)損傷時,外泌體會被吸引到該區(qū)域,并釋放因子促進損傷組織增生分化和自我修復(fù)。

在口腔器官發(fā)育過程中上皮細胞(epithelium cells, ECs)和間充質(zhì)細胞(mesenchyme cells, MSCs)會分泌外泌體,并擴散到基膜使得各細胞群及時進行信息交流,確保發(fā)育有序進行[11]。人脂肪間充質(zhì)干細胞(human adipose mesenchymal stem cells, hASCs)分泌的外泌體(hASCs-Exos)可以調(diào)節(jié)切口創(chuàng)面的collagen type Ⅲ: type I、TGF-β3 : TGF-β1和MMP3∶TIMP1比例,加快皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過程中的細胞外基質(zhì)重建,減輕瘢痕形成[12]。國內(nèi)趙彬等[13]將來源于5 名產(chǎn)婦的人羊膜上皮干細胞(human amniotic epithelial stem cells, hAECs)培養(yǎng)至第三代,通過成骨、成脂誘導(dǎo)分化后分成對照組和不同外泌體濃度的實驗組,發(fā)現(xiàn)100 μg/mL外泌體組大鼠皮膚組織創(chuàng)面膠原纖維排列更整齊。人骨髓源性基質(zhì)細胞(human bone marrow derived stromal cells, hMSCs)是一類存在于哺乳動物骨髓基質(zhì)中并具有極強分裂能力的細胞,可以在一定條件下分化成骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)等組織[14]。hMSCs分泌的外泌體(hMSCs-Exos)可以促進牙周膜細胞的增殖和克隆,并能促進其成骨作用。有學(xué)者將hMSCs和人牙髓干細胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)分泌外泌體(hDPSCs-Exos)分別與基質(zhì)蛋白結(jié)合,來探索不同干細胞來源外泌體在牙髓再生工程中的應(yīng)用效果,發(fā)現(xiàn)不同細胞來源的外泌體具有不同的誘導(dǎo)干細胞特異性分化的潛力,提示在應(yīng)用于牙髓、牙周再生前應(yīng)考慮外泌體供體細胞來源和狀態(tài)的重要性[15]。費棟棟等[16]通過有限稀釋法篩選成骨強的人牙周膜干細胞亞系(human periodontal ligament stem cells, hPDLSCs),其產(chǎn)生的外泌體通過誘導(dǎo)靶細胞組蛋白H3、 H4乙酰化水平的改變進而影響組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達,對靶細胞(hPDLSCs)成骨分化進行調(diào)控。

近年來也有不少研究發(fā)現(xiàn),不同種類干細胞來源外泌體聯(lián)合應(yīng)用可以得到更好的治療效果。 Narayanan等[17]聯(lián)合使用成骨細胞來源外泌體(osteoblasts-derived exosomes, Os-Exos)和脂肪細胞來源外泌體(adipocytes-derived exosomes, Ad-Exos),發(fā)現(xiàn)可以在較早分化時間點開啟譜系特異性基因的表達。

但是,當(dāng)前想要獲得高純度外泌體仍有一定困難,可以參考國際細胞外囊泡協(xié)會提出的指南,結(jié)合新的實驗技術(shù)和方法來獲取外泌體。用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)對牙囊細胞(dental folic cells, DFCs)來源外泌體(DFCs-Exos)進行預(yù)處理,探索不同濃度DFCs-Exos對牙周炎患者成骨能力的影響。最后發(fā)現(xiàn)100 μg/mL DFCs-Exos 組PDLSCs成骨分化能力較強,更有利于促進牙周組織再生[18]。 Yang等[19]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過根尖牙胚細胞培養(yǎng)液(APTG-CM)誘導(dǎo)的PDLSCs可以向牙骨質(zhì)、牙周韌帶樣組織分化。由此說明APTG-CM能夠提供一個成骨水泥的微環(huán)境,并誘導(dǎo)PDLSCs向成骨細胞譜系分化。

目前將外泌體應(yīng)用于牙周再生的相關(guān)報道和可靠數(shù)據(jù)較少,但是聯(lián)合應(yīng)用組織工程技術(shù),將某種具有特定功能的外泌體移植到牙周缺損處,以此促進相關(guān)組織的誘導(dǎo)發(fā)生、成熟和神經(jīng)血管再生,得到了初步的證實。

2 外泌體分泌的活性物質(zhì)

外泌體通過釋放蛋白質(zhì)、RNA等活性物質(zhì),對機體生命活動進行調(diào)節(jié)。Valadi 等[20]發(fā)現(xiàn)肥大細胞系(mast cells-MCs)來源外泌體(MCs-Exos)內(nèi)含有mRNA和microRNA,它們在不同物種細胞之間相互傳遞,并在新位置發(fā)揮功能。劉世宇等研究hMSCs-Exos 對hPDLSCs 增殖和分化功能的影響,分別檢測實驗組(用hMSCs-Exos處理hPDLSCs)和對照組hPDLSCs的成骨相關(guān)基因表達(Runx2、OCN、ALP、BSP、Col-Ⅰ)的增殖速率及其克隆能力,結(jié)果顯示實驗組顯著高于對照組[21]。炎癥會增加PDSLCs的外泌體分泌,并促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vascular endothelial cells, HUVECs)的血管生成,而阻斷外泌體的分泌會導(dǎo)致HUVECs血管生成的退化。外泌體分泌的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)被證明是PDLSCs和HUVECs之間的關(guān)鍵信號分子[22-23]。

隨著研究不斷深入,各種活性物質(zhì)的種類、功能屬性和作用機制將有可能被更好地了解和掌握,未來或許可以實現(xiàn)含有特異性活性物質(zhì)的外泌體的批量生產(chǎn),對病損牙周組織進行個性化修復(fù),造福牙周病患者。

3 工程化外泌體的應(yīng)用

基于外泌體的分子運輸能力以及靶向特性,通過對外泌體表面分子的修飾改造賦予其細胞和組織特異性(靶向修飾),而通過在供體細胞內(nèi)共表達蛋白質(zhì)/RNA轉(zhuǎn)運物也可以將特定的蛋白/RNA分子裝載到外泌體中(目的分子裝載)。工程化外泌體具有高產(chǎn)量、高靶向效率、高目的蛋白/RNA裝載效率等多重作用[24]。

將細胞療法應(yīng)用于牙周炎等炎癥相關(guān)疾病在實驗階段已經(jīng)取得一定進展。Xu等[25]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)P2X7受體(P2X7R)基因修飾的干細胞來源外泌體分泌miR-3679-5p、 miR-6515-5p、 miR-6747-5p,這些物質(zhì)與GREM-1蛋白結(jié)合,逆轉(zhuǎn)炎癥介導(dǎo)的PDLSCs損傷?？梢圆捎脭D壓方法從hMSCs中積累外泌體模擬物(exosome mimetics, EMs),與hMSCs來源的外泌體相比,收集到的EMs產(chǎn)量顯著提高。通過轉(zhuǎn)染noggin shRNA進一步下調(diào)天然骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP2)拮抗劑noggin的表達以增強EMs的成骨特性[26]。Exo-181b通過抑制PRKCD和激活p-AKT顯著增強M2型巨噬細胞極化,抑制炎癥及增強骨整合。此外,還證實了增強的M2型巨噬細胞極化可通過體外分泌VEGF和BMP-2間接促進骨遷移和成骨分化[27]。

外泌體的工程化改造是賦予其新特性的便捷方法,隨著研究的不斷進展,相信將來可以攻克這一難關(guān)。

4 外泌體與復(fù)合支架材料的聯(lián)合應(yīng)用

研究者發(fā)現(xiàn),單獨將外泌體定植在病損牙周組織,新生細胞會受到生長空間和生存環(huán)境限制,修復(fù)效果欠佳。生物相容性復(fù)合材料可以作為支架有效引導(dǎo)修復(fù)組織在空間合理分布,并提供生理性牙周環(huán)境,有利于細胞增殖。將牙釉質(zhì)基質(zhì)蛋白衍生物和骨生長素分別與膠原海綿(absorbable collagen sponge, ACS)聯(lián)合使用,發(fā)現(xiàn)兩組都形成新的結(jié)締組織附著和新骨,說明ACS可作為牙周愈合實驗理想支架材料[28]。ACS具有放射透明性、相對惰性和可吸收性。在大鼠牙周缺損模型中,植入帶有間充質(zhì)基質(zhì)細胞(mesenchymal stromal cells, MSCs)培養(yǎng)基(MSC-CM)的ACS,發(fā)現(xiàn)缺損處骨和血管生成相關(guān)基因的表達水平顯著上調(diào)[29]。此外, Li 等[30]將hASCs-Exos固定在聚多巴胺涂層的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA/pDA)支架上,構(gòu)建出一種新型無細胞組織工程骨,來誘導(dǎo)成骨作用。后發(fā)現(xiàn)外泌體從PLGA/pDA支架緩慢釋放,顯著增加了骨再生效率。上述無細胞系統(tǒng)為如何治療缺失牙槽骨提供了新的思路。 Shen等[31]發(fā)現(xiàn)將hDPSCs-Exos和殼聚糖水凝膠(chitosan hydrogel, CS)結(jié)合形成的(hDPSCs-Exos/CS)可以促進小鼠牙周炎區(qū)域的巨噬細胞由促炎表型向抗炎表型轉(zhuǎn)化。提示或許可以利用CS結(jié)合外泌體來抑制牙周炎癥和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答,改善牙周損傷。值得重視的是, Liu等[32]首次系統(tǒng)綜述了干細胞、 3D打印、基因治療和分層生物結(jié)構(gòu)技術(shù),應(yīng)用于牙周(牙槽骨-牙周韌帶-牙骨質(zhì)復(fù)合體)再生方面的新進展。實驗先通過細胞歸巢避免倫理問題和防止免疫排斥反應(yīng);其次, 3D打印可以使牙周膜纖維具有定制的仿生結(jié)構(gòu)和生物活性成分;基因治療還可以精準(zhǔn)靶向調(diào)控缺損微環(huán)境,具有分別促進牙骨質(zhì)、牙周韌帶纖維、牙槽骨再生的功能;最后通過分層設(shè)計材料實現(xiàn)牙周組織完整、同步再生。除了細胞歸巢、基因治療和層狀材料用于牙周再生的研究仍處于實驗室研究階段,其他的治療材料已經(jīng)被批準(zhǔn)用于臨床治療。這個實驗為如何同步恢復(fù)喪失的牙周組織提供了極好的設(shè)想。在巨噬細胞模擬的炎癥環(huán)境中,用Ag離子和MSCs-Exos修飾PCL支架,發(fā)現(xiàn)該支架顯著降低了促炎基因的表達和減少了IL-6、 TNF-α的分泌,并促進hBMSCs成骨分化[33]。近年來,負載有外泌體的β-TCP復(fù)合支架也在逐漸推廣。

這些研究成果為外泌體和生物相容性復(fù)合支架材料聯(lián)合應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

5 外泌體在牙周再生治療中的新功能展望

基因療法有望從分子層面更精準(zhǔn)有效地直接治療疾病。在這里我們綜述了在基因水平對外泌體進行操作,進而運用于臨床中牙周再生治療的可能性。

基因治療可以將干細胞及其衍生物變成靶向基因的載體,引導(dǎo)人體疾患朝著糾正、組織修復(fù)和再生的目標(biāo)發(fā)展[34]。規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列/規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列相關(guān)蛋白系統(tǒng)(CRISPR/Cas)是存在于細菌與古菌的一種防御機制,目前在基因組研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[35-36]。 Lin等[37]研制出一種外泌體脂質(zhì)體雜交納米顆粒,用于傳遞CRISPR/Cas系統(tǒng)。負載的混合外泌體可以被MSCs內(nèi)吞并釋放該系統(tǒng),從而調(diào)控MSCs中靶向基因的表達。在未來,我們是否可以利用外泌體,將攜帶糾正牙周炎癥相關(guān)基因的CRISPR/Cas系統(tǒng)導(dǎo)入干細胞用以介導(dǎo)牙周組織修復(fù),值得探索。

大量研究表明,在炎癥微環(huán)境中PDLSCs的免疫調(diào)節(jié)能力和再生潛能會受到損傷[38],進而降低移植干細胞治療效果[39]。P2X7R表達于大多數(shù)干細胞,在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮廣泛的生理和病理作用[40]。 Xu等[41]通過實驗發(fā)現(xiàn)炎癥條件會降低PDLSCs中P2X7R表達,而通過BzATP激活P2X7R或通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)過表達P2X7R,可以逆轉(zhuǎn)炎癥介導(dǎo)的牙槽骨進行性吸收;此外,該團隊又發(fā)現(xiàn)PI3K-AKT-mTOR通路與牙槽骨成骨過程相關(guān)。當(dāng)干細胞及其衍生物移植到牙周炎區(qū)域,它們功能會受到影響,導(dǎo)致干細胞療法用于牙周再生的臨床應(yīng)用進展緩慢;為了探究P2X7R基因?qū)χ車h(huán)境的影響,將經(jīng)過P2X7R基因修飾的干細胞條件培養(yǎng)基(CM-Ad-P2X7)與外泌體(ex-ad-p2x7)聯(lián)合用于孵育PDLSCs。發(fā)現(xiàn)在炎癥微環(huán)境下, ex-ad-p2x7通過修改不利的局部微環(huán)境使PDLSCs脫離功能障礙。在牙周再生過程中使用ex-ad-p2x7,不僅提高干細胞治療的安全性和有效性,還不會引起副作用,為牙周炎的臨床治療提供了一種可行而有前景的方法。當(dāng)然,還需要更多的體內(nèi)實驗來驗證P2X7R對組織再生的積極影響及其安全性[25]。

簡而言之,將來可以將基因分子技術(shù)和外泌體相結(jié)合,在未來有望使牙周炎得到更精準(zhǔn)有效的治療。

綜上所述,越來越多證據(jù)表明外泌體在牙周再生中發(fā)揮著十分重要的作用。近年來,外泌體對牙周炎等口腔疾病的治療作用也受到較高關(guān)注,這也提供了更全面的研究資料[42]。此外,含有多種生物活性分子的外泌體顯示出巨大的潛力,這些分子不僅可以用于臨床治療,還可用于協(xié)助臨床診斷和評估預(yù)后等整個疾病的全過程。本文基于不同細胞來源的外泌體及其種類、其所分泌的活性物質(zhì)、應(yīng)用的新技術(shù)和新方法和未來研究方向等作了相關(guān)的討論。目前基于外泌體用于牙周再生的研究水平仍然不夠成熟,距離將理論轉(zhuǎn)化為實際運用于臨床還有很漫長的路要走。值得注意的是,外泌體的優(yōu)勢已日益顯著。在未來的牙周再生領(lǐng)域,將外泌體與基因分子技術(shù)結(jié)合,是一個新的趨勢。