梁建英，唐 爍*，劉麗君，謝瑞龍，高玉杰，胡 雪，李翠枝，呂志勇

（1.內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.國家市場監(jiān)管重點實驗室（乳及乳制品檢測與監(jiān)控技術(shù)），上海 200127）

氨基甲酸乙酯（ehthy carbamate，EC）屬于食品發(fā)酵產(chǎn)生的副產(chǎn)物[1-2]，來源于食品的發(fā)酵過程，發(fā)酵食品中基本含有氰化物和氨基甲?；衔?，即尿素、氨基甲酰磷酸鹽、瓜氨酸和氰化氫[3]。這些主要前體化合物在食品加工和儲存過程中在一定條件下與發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇發(fā)生醇解反應可導致氨基甲酸乙酯的形成[4-6]。動物研究表明，EC會導致包括肺、肝和血管在內(nèi)的多個組織部位的腫瘤發(fā)病率增加。因此，2007年EC已被列入可能的致癌物質(zhì)（2A組）[7-9]。

眾所周知，在乳品企業(yè)中奶酪制品是企業(yè)的重要品類之一，近年來已成為乳品企業(yè)效益增長的主力軍，奶酪行業(yè)目前正處于高速擴張時期，未來仍然會持續(xù)較高的景氣度[10-11]，國內(nèi)乳品企業(yè)都很重視奶酪市場。奶酪又名干酪，是一種發(fā)酵的牛奶制品，因此奶酪中氨基甲酸乙酯的風險防控對于乳品企業(yè)意義重大。

目前奶酪中氨基甲酸乙酯含量的檢測尚未有國家標準，但已有一些文章對發(fā)酵乳中氨基甲酸乙酯的檢測進行了報道[12-14]，如趙艷菊等[15]對發(fā)酵乳制品中氨基甲酸乙酯檢測進行了研究，其采用的是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀內(nèi)標法，前處理用有機溶劑二氯甲烷直接提取后上機檢測。袁小美等[16]對發(fā)酵乳中氨基甲酸乙酯檢測進行了研究，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀內(nèi)標法，但其前處理為鹽酸溶液沉淀去除蛋白，然后離心得到提取液，經(jīng)固相萃取小柱凈化后檢測?？梢?，針對發(fā)酵乳品，多數(shù)檢測方法采用的是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用內(nèi)標法[17-19]，但在驗證中發(fā)現(xiàn)，對于稍微復雜的基質(zhì)，因氨基甲酸乙酯分子質(zhì)量小，該方法存在著基質(zhì)干擾大[20-22]，無法定性的問題[23-24]。目前，針對奶酪基質(zhì)中氨基甲酸乙酯檢測報道甚少，鑒于此，本研究選取兒童奶酪棒為代表性基質(zhì)，參考已有氨基甲酸乙酯含量檢測的標準及文獻方法，按照六西格瑪?shù)亩x-測量-分析-改善-控制（Define-Measure-Analyze-Improve-Control，DMAIC）項目改善路線進行檢測過程影響因子的分析，實驗數(shù)據(jù)采用Mintab軟件（16.1.0版）進行統(tǒng)計學分析，并對該檢測方法進行方法學考察。采用氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatographytriple quadrupole tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）[25-26]、外標定量法建立了奶酪中氨基甲酸乙酯含量的測定方法，為企業(yè)奶酪高質(zhì)量安全發(fā)展保駕護航。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

奶酪樣品：內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司。

乙腈（色譜純）、正己烷（分析純）、氨基甲酸乙酯標準品（純度99.8%）：上海安譜實驗科技股份有限公司；二氯甲烷（分析純）：成都諾爾施科技有限責任公司；無水硫酸鈉、甲醇（均為分析純）：天津市光復科技發(fā)展有限公司；超純?nèi)ルx子水：實驗室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

TQS9000氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀、Biofuge Stratos低溫高速離心機：美國賽默飛世爾科技有限公司；ME204分析天平（感量為0.0001 g）：瑞士梅特勒托利多公司；TurboVapLV全自動氮吹儀：瑞典Biotage公司；KS501渦旋振蕩器：德國IKA公司；堿性硅藻土固相萃取柱（2 g/10 mL）：上海安譜實驗科技股份有限公司；TG-WAXMS聚乙二醇毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國賽默飛世爾科技有限公司；弗羅里硅土固相萃取柱（0.5 g/3 mL）：天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品提取

準確稱取1.0 g奶酪代表性試樣，置于15 mL的塑料離心管中，然后加入2 mL純水，1 mL乙腈，將其渦旋混勻?；旌? min后，于0 ℃、轉(zhuǎn)速6 000 r/min條件下離心8 min，收集提取液，殘渣再加入1 mL乙腈重復提取一次，合并兩次提取液，待凈化。

1.3.2 樣品凈化

將樣品提取液全部加入堿性硅藻土固相萃取柱上，當樣品溶液完全滲入柱中后，將其靜置保持10 min。凈化時，首先量取10 mL正己烷，用其淋洗上樣后的固相萃取柱，量取20 mL二氯甲烷，用其洗脫萃取柱，將洗脫液全部收集，置于裝有2 g無水硫酸鈉的氮吹管中，洗脫液經(jīng)脫水后，于30 ℃緩緩氮吹，直至管中液體約0.5 mL，然后加入甲醇至1 mL，混勻后上機測定。

1.3.3 標準工作溶液配制

加入特定體積的氨基甲酸乙酯標準中間液（500ng/mL），然后用甲醇稀釋到1 mL，配制得到質(zhì)量濃度分別為5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL的氨基甲酸乙酯標準工作溶液，供氣相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀測定。

1.3.4 氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜檢測條件

氣相色譜條件：TG-WAXMS聚乙二醇毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。升溫程序：50 ℃下保持1 min；以8 ℃/min的速率升溫至180 ℃；以10 ℃/min的速率升溫至240 ℃，然后保持5 min。載氣為高純氦氣（He），流速為1.0 mL/min，進樣量為1 μL。進樣方式為不分流進樣。

2.2.2 混合對照品溶液 分別精密量取“2.2.1”項下單一對照品貯備液各適量，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得含淫羊藿屬苷A、朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、寶藿苷Ⅰ質(zhì)量濃度分別為 19.50、28.20、50.50、66.90、89.60、160.00、26.80、27.24 μg/mL的混合對照品溶液。

質(zhì)譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度280 ℃。

采用選擇反應監(jiān)測（selective reaction monitoring，SRM）模式；氨基甲酸乙酯的碰撞電壓、定性離子對、定量離子對和保留時間參見表1。

表1 氨基甲酸乙酯的保留時間及質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention time and mass spectral parameters of ethyl carbamate

氨基甲酸乙酯含量的計算公式如下：

式中：X為氨基甲酸乙酯含量，mg/kg；C為依據(jù)標準曲線測得的目標物質(zhì)量濃度，ng/mL；V為樣品溶液的定容體積，mL；m為試樣質(zhì)量，g；1 000為換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品預處理條件的優(yōu)化

2.1.1 不同提取溶劑的選擇

基于氨基甲酸乙酯化合物極性較強，奶酪基質(zhì)蛋白含量高的特點，本試驗選用二氯甲烷[15]、乙腈、乙腈水溶液（乙腈與水體積比1∶2）[24]及乙酸鉛溶液（質(zhì)量濃度5 g/100 mL）[27]4種不同試劑進行提取效率對比實驗。分別按照樣品的提取及凈化方法，添加氨基甲酸乙酯標準溶液（質(zhì)量濃度為0.01 mg/kg），檢測奶酪樣品中氨基甲酸乙酯的回收率，每個條件進行6次平行實驗，收集樣品回收率數(shù)據(jù)，采用Mintab軟件進行單因子方差分析，結(jié)果見圖1。由圖1可知，在95%的置信度下，4種不同提取試劑條件下氨基甲酸乙酯的回收率之間有顯著差異（P＜0.05）。二氯甲烷提取條件下，氨基甲酸乙酯平均回收率為37.46%，標準差2.47%；乙腈提取條件下，氨基甲酸乙酯平均回收率為76.46%，標準差12.46%；乙腈水溶液提取條件下，氨基甲酸乙酯平均回收率為78.22%，標準差5.58%；乙酸鉛提取條件下，氨基甲酸乙酯平均回收率為68.73%，標準差17.01%?？梢?，乙腈水溶液的回收率平均值最高且變異波動較小。因此，本研究中優(yōu)選乙腈水溶液（乙腈與水體積比1∶2）作為提取溶劑。

圖1 不同提取試劑條件下氨基甲酸乙酯回收率比較Fig. 1 Comparison of ethyl carbamate recovery rates with different extraction reagents

2.1.2 提取溶劑中乙腈水比例選擇

通過上述不同提取試劑的優(yōu)化對比得出乙腈水溶液為最佳的前處理提取試劑，其中乙腈可以沉淀蛋白，水溶液可以有效溶解奶酪中的氨基甲酸乙酯。為了得到最佳的乙腈和水的比例，借助Mintab軟件進行正交試驗設(shè)計，對試驗測定的回收率數(shù)據(jù)進行分析。首先對提取試劑中乙腈用量和去離子水用量進行2因子2水平加中心點的正交試驗驗，即低水平（乙腈1.0 mL＋去離子水2.0 mL）、中心點（乙腈1.5 mL＋去離子水3.5 mL）、高水平（乙腈2.0 mL＋去離子水5.0 mL），對正交試驗結(jié)果通過Mintab軟件進行方差分析，結(jié)果顯示P＜0.05，說明中心點顯著，需要增加軸點進行響應曲面設(shè)計。在上述的2因子2水平加中心點試驗的基礎(chǔ)上增加了軸點（乙腈1.0 mL＋去離子水3.5 mL、乙腈2.0 mL＋去離子水3.5 mL、乙腈1.5 mL＋去離子水2.0 mL、乙腈1.5 mL+去離子水5.0 mL）實施響應曲面試驗，對試驗結(jié)果通過Mintab軟件進行響應優(yōu)化器分析，分析結(jié)果表明：回收率最大時提取溶劑比例為乙腈1 mL、去離子水2 mL。因此，提取試劑乙腈水比例的最優(yōu)條件為乙腈1.0 mL＋去離子水2.0 mL。

2.1.3 固相萃取柱的選擇

奶酪試樣提取后，提取液需經(jīng)固相萃取柱凈化，從而將樣品中的雜質(zhì)干擾成分與目標物分離，選擇弗羅里硅土固相萃取柱和堿性硅藻土固相萃取柱進行對比。分別按照樣品的提取及凈化方法，添加質(zhì)量濃度為0.01 mg/kg的氨基甲酸乙酯標準溶液，測定化合物回收率，每個條件進行至少6次平行實驗，數(shù)據(jù)通過Mintab軟件進行回歸分析，結(jié)果見圖2。由圖2可知，兩種固相萃取柱條件下，回收率均在60%～120%，但是弗羅里硅土柱條件下回收率變異系數(shù)為32.1%，不滿足GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》中變異系數(shù)≤15%的要求，而堿性硅藻土柱條件下變異系數(shù)為10.4%，滿足要求。同時，經(jīng)查閱文獻，發(fā)現(xiàn)針對氨基甲酸乙酯，堿性硅藻土固相萃取柱具有吸附性強、高保留、易洗脫的特性[28]，與實驗結(jié)論相符。因此，優(yōu)選堿性硅藻土柱凈化。

圖2 兩種固相萃取柱條件下氨基甲酸乙酯回收率比較Fig. 2 Comparison of ethyl carbamate recovery rates with two solid phase extraction columns

2.1.4 洗脫劑二氯甲烷用量的選擇

奶酪試樣提取后，提取液經(jīng)堿性硅藻土固相萃取柱凈化過程中，首先樣品中的氨基甲酸乙酯被固相萃取小柱吸附；然后使用弱極性的正己烷溶劑淋洗小柱，可以很好的除去樣品中含有的雜質(zhì)，而目標物氨基甲酸乙酯保留在堿性硅藻土固相萃取小柱上；之后需用洗脫試劑二氯甲烷將目標物從固相萃取小柱解吸附，收集洗脫液，濃縮后上機測試。實驗中對二氯甲烷的不同用量10 mL、15 mL、20 mL進行對比，按照相同的實驗操作，添加質(zhì)量濃度為0.01 mg/kg的氨基甲酸乙酯標準溶液，測定目標化合物回收率，每個條件進行6次平行實驗，數(shù)據(jù)通過Mintab軟件進行回歸分析，結(jié)果見圖3。由圖3可知，洗脫劑二氯甲烷用量與目標化合物回收率呈現(xiàn)線性關(guān)系，隨著洗脫試劑用量的增加，目標物回收率增大。結(jié)合實驗成本、環(huán)境污染、綠色化學等因素，本研究優(yōu)選洗脫劑二氯甲烷用量為20 mL。

圖3 洗脫劑二氯甲烷用量對氨基甲酸乙酯回收率的影響Fig. 3 Effect of eluent dichloromethane addition on the recovery rates of ethyl carbamate

2.2 標準曲線回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

本實驗是外標方法定量，以氨基甲酸乙酯標準溶液的定量離子對峰面積（Y）為縱坐標，標準溶液質(zhì)量濃度（X）為橫坐標，繪制標準曲線。實驗結(jié)果表明：奶酪基質(zhì)中氨基甲酸乙酯含量在5～200 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，標準曲線回歸方程Y=2 012X-3 306、相關(guān)系數(shù)R2=0.998 9，＞0.99，線性相關(guān)滿足檢測要求。本研究奶酪基質(zhì)中氨基甲酸乙酯含量的定量限是0.01 mg/kg，信噪比（signal to noise ratio，S/N）滿足不小于10的要求，檢出限是0.005 mg/kg，信噪比（S/N）滿足不小于3的要求，方法靈敏度高。

2.3 方法回收率和精密度試驗

本實驗中選用空白兒童奶酪棒樣品進行低水平（0.01 mg/kg）、中水平（0.02 mg/kg）、高水平（0.10 mg/kg）3個添加水平的加標回收率測定試驗，每個添加水平進行6平行試驗?；厥章屎途芏鹊臏y定結(jié)果見表2。由表2可知，加標回收率范圍為69.1%～91.2%，精密度試驗結(jié)果相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為4.2%～11.1%，結(jié)果滿足GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》中方法回收率和精密度檢測要求，適用于奶酪中氨基甲酸乙酯含量的測定。

表2 加標回收率和精密度試驗結(jié)果（n=6）Table 2 Results of standard recovery rates and precision tests (n=6)

2.4 實際樣品檢測

隨機的抽取5種奶酪產(chǎn)品進行檢測，分別為雙層奶酪棒（混合水果味）、可以吸的奶酪（草莓味）、芝士片（經(jīng)典原味）、馬蘇里拉芝士碎、馬蘇里拉奶酪，按照方法操作步驟對上述產(chǎn)品進行氨基甲酸乙酯含量測試，檢測結(jié)果顯示未檢出。

3 結(jié)論

參考現(xiàn)有食品安全國家標準中氨基甲酸乙酯含量的檢測方法，本研究按照精益六西格瑪DMAIC項目改善思路，挖掘出針對奶酪基質(zhì)，影響其氨基甲酸乙酯含量檢測結(jié)果準確性前處理過程提取試劑、固相萃取小柱、洗脫試劑用量等，并對這些因子進行了重點優(yōu)化試驗設(shè)計，試驗數(shù)據(jù)采用Mintab軟件進行統(tǒng)計學分析，最終建立了一種奶酪中氨基甲酸乙酯含量的氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。該方法在5～200 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)標準曲線線性相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)＞0.99。方法定量限為0.01 mg/kg，檢出限為0.005 mg/kg，在0.01～0.10 mg/kg含量范圍的加標回收率試驗中，樣品回收率為69.1%～90.7%，精密度試驗結(jié)果RSD為4.2%～11.1%。該方法操作簡便，結(jié)果準確，可以為奶酪食品的質(zhì)量安全提供保障。