蔡書(shū)祺 鄭璐璐 張大偉

摘要：改良了一種微流控芯片，可用于對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行三維培養(yǎng)并實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光成像。在結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)植入內(nèi)源性的紅色熒光蛋白，使用激光共聚焦顯微鏡對(duì)芯片中三維培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行成像。通過(guò)細(xì)胞內(nèi)部紅色熒光蛋白的表達(dá)，可以觀測(cè)到細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和高分辨率熒光成像。同時(shí)，通過(guò)免疫熒光染色來(lái)表征反映細(xì)胞活性的特征蛋白，其熒光強(qiáng)度和蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。研究結(jié)果提示，細(xì)胞活性相關(guān)蛋白的表達(dá)受到微環(huán)境的影響，其在芯片三維培養(yǎng)中的活性強(qiáng)于二維培養(yǎng)，表明芯片內(nèi)環(huán)境更加接近真實(shí)的人體微環(huán)境。該方法為進(jìn)一步探究腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移機(jī)制及相關(guān)藥物的篩選研究提供了一種新的技術(shù)手段及實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

關(guān)鍵詞：微流控芯片；三維培養(yǎng)；熒光成像；熒光蛋白

中圖分類號(hào)：TB39文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Investigation of fluorescence imaging in microfluidic chip for three-dimensional cultivation of colon cancer cells

CAI Shuqi，ZHENG Lulu，ZHANG Dawei

（School of Optical-Electrical and Computer Engineering， University of Shanghai for Science and Technology， Shanghai200093， China）

Abstract： This article presents an improved method for the three-dimensional cultivation of colon cancer cells and the realization of real-time fluorescence imaging using a microfluidic chip. By incorporating endogenous red fluorescent protein into the colon cancer cells， we employed laser confocal microscopy to visualize the cells cultivated within the chip in three dimensions. The expression of intracellular red fluorescent protein allowed for the observation of cell growth status，facilitating real-time monitoring and high-resolution fluorescence imaging. Moreover，immunofluorescence staining was employed to characterize feature proteins indicative of cellular activity， with their fluorescence intensity demonstrating a positive correlation with protein expression. The research findings indicate that the expression of activity-related proteins is influenced by the microenvironment， exhibiting stronger activity in the three-dimensional cultivation on the chip compared to the two-dimensional approach. This suggests that the microenvironment within the chip more closely resembles the actual microenvironment within the human body. This method provides a novel technical approach and experimental platform for further exploration of tumor metastasis mechanisms and the screening of related drugs.

Keywords： microfluidic chip； three-dimensional cultiviation； fluorescence imaging；fluorescent protein

引 言

二維培養(yǎng)在生物醫(yī)學(xué)研究中已經(jīng)具有一個(gè)比較成熟的方案，它為人們提供了一種簡(jiǎn)單、快速和經(jīng)濟(jì)的實(shí)驗(yàn)方法。然而，哺乳動(dòng)物細(xì)胞通常生長(zhǎng)在一個(gè)復(fù)雜的三維微環(huán)境中，細(xì)胞與細(xì)胞以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）之間相互作用，形成了一個(gè)通信網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)用以維持相關(guān)細(xì)胞組織的生理特征[1]。研究中常使用以水凝膠代表親水交聯(lián)聚合物的三維網(wǎng)絡(luò)，其與軟組織力學(xué)性質(zhì)相似，用于模擬 ECM，以支持細(xì)胞代謝物和所需養(yǎng)分的運(yùn)輸及細(xì)胞的粘附[2]。微流體、光流體及類器官培養(yǎng)等新興技術(shù)促進(jìn)了疾病及藥物的相關(guān)研究的新發(fā)展。在這些新技術(shù)中，微流體芯片技術(shù)因具有降低實(shí)驗(yàn)成本，縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間的潛力，獲得了巨大的發(fā)展。研究表明，在癌癥研究中，利用芯片中的三維結(jié)構(gòu)可以更真實(shí)地模擬人體內(nèi)微環(huán)境，有利于人們對(duì)細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移等情況的觀察[3]。在微流控芯片中，通道的微小尺寸可以引導(dǎo)和控制流體的運(yùn)動(dòng)[4]，不僅減少了試劑的使用量，而且通過(guò)控制微流體可模擬微生理環(huán)境，從而增強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)的代謝水平[5]。目前，微流控芯片的三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)仍存在一些局限性：大部分的微流控芯片采用的微通道相對(duì)簡(jiǎn)單，和人體血管結(jié)構(gòu)相差較大，難以模擬實(shí)際血管與周圍細(xì)胞組織之間的物質(zhì)交換，難以還原人體內(nèi)微環(huán)境，需要更好地改良芯片內(nèi)微環(huán)境，以保持細(xì)胞的活性和狀態(tài) 。因此，利用微流控芯片構(gòu)建血管網(wǎng)絡(luò)，實(shí)現(xiàn)組織與血管網(wǎng)絡(luò)交互，更加真實(shí)地模擬人體微環(huán)境，具有很大的研究?jī)r(jià)值。

本文設(shè)計(jì)了微流控芯片平臺(tái)來(lái)實(shí)現(xiàn)人結(jié)腸癌細(xì)胞 HT-29的三維培養(yǎng) [6]。利用細(xì)胞內(nèi)植入的紅色熒光蛋白，進(jìn)一步研究了微流控芯片內(nèi)三維培養(yǎng)細(xì)胞的熒光特性。通過(guò)外源性的綠色熒光蛋白表征了三維培養(yǎng)和二維培養(yǎng)的細(xì)胞之間的活性差異。

結(jié)果顯示，微流控芯片中細(xì)胞的熒光成像效果較好，該研究在疾病研究領(lǐng)域擁有廣泛的應(yīng)用前景。

1

微流控芯片中三維細(xì)胞培養(yǎng)的特性

微流控芯片的微結(jié)構(gòu)可以控制細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。相比于傳統(tǒng)的二維細(xì)胞培養(yǎng)，微流控芯片中的三維細(xì)胞培養(yǎng)能夠提高細(xì)胞存活率，從而提高細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的成功率[7]。芯片中的三維細(xì)胞培養(yǎng)能夠模擬組織和器官的部分結(jié)構(gòu)和形態(tài)，包括細(xì)胞密度、細(xì)胞排列方式等，從而能夠更真實(shí)地模擬體內(nèi)生理狀態(tài)，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞聚集和形成組織結(jié)構(gòu)，可以使其在芯片內(nèi)的三維培養(yǎng)對(duì)比其他三維培養(yǎng)，例如在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)更加具有優(yōu)勢(shì)[8-9]。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡等顯微成像的方式能很容易地獲得微流控芯片內(nèi)的細(xì)胞三維狀態(tài)，可以提供更真實(shí)的細(xì)胞形態(tài)的高分辨率圖像[10]。熒光生物成像作為一種細(xì)胞生物學(xué)中先進(jìn)的成像技術(shù)[11]，被用作疾病的診斷工具[12]，常用在二維細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物模型和人體組織的高分辨率成像[13]。但二維樣品存在一些實(shí)時(shí)成像的問(wèn)題，如成像過(guò)程中的細(xì)胞活力衰減。微流控芯片中的三維細(xì)胞培養(yǎng)可以提高熒光成像的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，它可以通過(guò)調(diào)節(jié)流體的流速、壓力和結(jié)構(gòu)，控制細(xì)胞的位置，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的精確控制，使得三維培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)更加穩(wěn)定[14-15]。

2

實(shí)驗(yàn)部分

2.1

試劑和儀器

磷酸鹽緩沖鹽溶液（phosphate buffer solution，PBS）、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、Triton 溶液購(gòu)于賽默飛公司，牛纖維蛋白原和凝血酶購(gòu)于索萊寶公司，UQCRC1抗體、用激發(fā)波長(zhǎng)488nm 的異硫氰酸熒光素結(jié)合的二級(jí)抗體（FITC488）、4′，6–二脒基–2–苯基吲哚（DAPI）購(gòu)于艾博抗公司。所用化學(xué)試劑均為分析純。

使用的儀器主要有：SUSS MrcroTec MJB4紫外曝光機(jī)，SC-1B 勻膠機(jī)，PDC-FMG-2離子機(jī)清洗機(jī)，CarlZeiss LSM900激光共聚焦顯微鏡。

2.2

微流控芯片的制備

通過(guò) AutoCAD 軟件進(jìn)行微流控芯片的設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)完成后，進(jìn)行軟光刻的掩膜板制造。隨后，使用光刻機(jī)通過(guò)光掩膜對(duì)硅晶片進(jìn)行曝光，形成具有110μm 高度的集成硅晶片，然后進(jìn)行適當(dāng)?shù)娘@影（如圖1）。制作好的硅晶片需要在密封箱中，用三甲基氯硅烷蒸氣熏30min，以便于后續(xù)脫膜。將聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）預(yù)聚物溶液（PDMS 與固化劑10∶1的質(zhì)量比充分混合），在真空箱中脫氣后，澆筑到已經(jīng)預(yù)處理好的硅晶片上，并再次在真空箱中脫氣，80℃，固化1.5h。剝離和切割整個(gè)葉脈網(wǎng)絡(luò)的 PDMS 層，使用異丙醇溶液浸泡 PDMS 層，除去殘余的三甲基氯硅烷，然后用去離子水洗滌，在灌注孔入口和出口處使用0.6mm 的針進(jìn)行打孔，再用氧等離子體將腔室層與玻璃基板接合（如圖2（b））。

2.3

水凝膠的制備

水凝膠法是構(gòu)建三維細(xì)胞體系最常用的方法之一。本實(shí)驗(yàn)采用人工提取的纖維蛋白和來(lái)自哺乳動(dòng)物血液的凝血酶來(lái)構(gòu)建水凝膠結(jié)構(gòu)。纖維蛋白由3對(duì)肽鏈組成，在形成水凝膠的過(guò)程中，凝血酶在 Ca2+作用下激活纖維蛋白穩(wěn)定因子，生成轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，使纖維蛋白原單體間的非共價(jià)鍵轉(zhuǎn)變成共價(jià)鍵，將纖維末端相連，形成穩(wěn)定的、交聯(lián)的纖維蛋白凝膠。用生理鹽水配制1000U/mL 的凝血酶溶液。

2.4

細(xì)胞試驗(yàn)

人結(jié)腸癌細(xì)胞 HT-29購(gòu)于中科院細(xì)胞庫(kù)。在此 HT-29細(xì)胞系上，制得紅色熒光蛋白轉(zhuǎn)染的 HT-29細(xì)胞系。2種細(xì)胞均在添加了10% 胎牛血清、1% 青霉素和1% 鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境為：溫度37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)5%，濕度95%。為觀察三維培養(yǎng)細(xì)胞的熒光成像情況，將 HT-29細(xì)胞懸浮在6U/mL凝血酶與3mg/mL 纖維蛋白原1∶1配置而成的混合溶液中，快速將制備好的混合溶液注入到微流控芯片中，于37℃ 培養(yǎng)箱中孵育1h，使纖維蛋白原交聯(lián)，形成水凝膠。隨后灌注培養(yǎng)基，在37℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，同時(shí)以常規(guī)二維平面培養(yǎng)方式在微流控芯片內(nèi)培養(yǎng) HT-29細(xì)胞。

2.5

免疫熒光實(shí)驗(yàn)

用免疫熒光的方法表征了 HT-29三維細(xì)胞培養(yǎng)的相關(guān)標(biāo)記物 UQCRC1蛋白。首先用 PBS洗滌去除殘余培養(yǎng)基，用0.1% 的 PBS Triton溶液滲透10min，用5% 的牛血清白蛋白封閉1h，在4℃ 冰箱內(nèi)，使用單克隆抗體 UQCRC1孵 育 過(guò) 夜 。 然 后 用 PBS 洗 滌 細(xì) 胞 ， 再 使 用FITC488結(jié)合的二抗孵育2h。孵育后，用 PBS洗滌細(xì)胞并使用 DAPI 對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，之后用共焦顯微鏡成像。將相關(guān)蛋白質(zhì)的強(qiáng)度比標(biāo)準(zhǔn)化，并使用 ImageJ 軟件分析熒光強(qiáng)度。

3

結(jié)果與討論

3.1

微流控芯片的設(shè)計(jì)

微流控芯片的通道形狀和尺寸會(huì)直接影響流體的流動(dòng)以及芯片內(nèi)細(xì)胞的狀態(tài)，所以在設(shè)計(jì)通道時(shí)需要考慮流體性質(zhì)、操作流程、檢測(cè)方式等因素，以優(yōu)化通道的幾何形狀和尺寸。受自然復(fù)合血管網(wǎng)絡(luò)的啟發(fā)，由于動(dòng)物和植物通過(guò)該網(wǎng)絡(luò)可以有效地遠(yuǎn)距離運(yùn)輸流體并遵守默里定律[9]，因此在芯片設(shè)計(jì)中，左右2個(gè)腔室用來(lái)接種水凝膠三維培養(yǎng) HT-29細(xì)胞，周圍的血管狀結(jié)構(gòu)用來(lái)為細(xì)胞供給養(yǎng)分（如圖2（b））。

3.2

芯片中三維培養(yǎng)細(xì)胞的高分辨熒光成像

為了實(shí)現(xiàn)對(duì)微流控芯片中三維培養(yǎng)細(xì)胞的高分辨成像，使用了2種不同的熒光蛋白來(lái)對(duì) HT-29細(xì)胞進(jìn)行熒光表征。一種是采取基因組編輯方法，使用慢病毒轉(zhuǎn)染的方式，生產(chǎn)表達(dá)紅色熒光蛋白（red fluorescence protein，RFP）標(biāo)簽的轉(zhuǎn)基因 HT-29細(xì)胞系。RFP 可由波長(zhǎng)為532nm 的激光激發(fā)，并在582nm 處進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò) RFP 可以對(duì) HT-29細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)狀態(tài)監(jiān)測(cè)。另一種是通過(guò)二抗結(jié)合的 FITC488來(lái)表征芯片中三維培養(yǎng)環(huán)境的細(xì)胞活性相關(guān)蛋白，以驗(yàn)證芯片中細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。FITC488可由波長(zhǎng)為488nm 的激光激發(fā)，并在528nm 處進(jìn)行檢測(cè)。采用激光共聚焦顯微鏡對(duì)三維培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行透射成像。激光共聚焦顯微鏡使用的激光束經(jīng)過(guò)聚焦后，能夠在焦點(diǎn)處獲得高強(qiáng)度的激光，可實(shí)現(xiàn)成像的高分辨率，甚至可以達(dá)到亞細(xì)胞水平的分辨率。在獲取三維細(xì)胞圖像時(shí)，使用的掃描方式有點(diǎn)掃描和線掃描2種。由于需要獲取整個(gè)微流控芯片內(nèi)部的三維細(xì)胞圖像，傳統(tǒng)點(diǎn)掃描方式使用一個(gè)非常小的點(diǎn)對(duì)樣品進(jìn)行掃描，成像面積小，成像時(shí)間長(zhǎng)。而線掃描方式則使用一條細(xì)的光線對(duì)樣品進(jìn)行掃描，可以直接得到連續(xù)的二維圖像，成像面積大，成像時(shí)間短。其還可以通過(guò)沿 z 軸方向掃描，獲取樣品垂直方向100μm 的圖像，而每1μm中包括100張平面中的熒光信息圖片，用于3D 圖像重建（如圖3）。

3.3

微流控芯片中三維細(xì)胞的熒光特性

RFP 基因被轉(zhuǎn)錄進(jìn) HT-29細(xì)胞后，表達(dá)的RFP 蛋白屬于內(nèi)源性熒光團(tuán)，是已經(jīng)存在于樣品中的熒光生物分子，有助于細(xì)胞的自發(fā)熒光，且具有優(yōu)異的熒光性能和較低的生物毒性。三維培養(yǎng)下的 HT-29細(xì)胞形成細(xì)胞團(tuán)，形態(tài)在明場(chǎng)圖中清晰可見(jiàn)（如圖4（a））。當(dāng)受到532nm 的激光激發(fā)后，HT-29細(xì)胞在暗場(chǎng)圖中顯示出較強(qiáng)的紅色熒光（如圖4（b））。在疊加圖（如圖4（c））中可以看到，RFP 作為內(nèi)源性熒光團(tuán)的特點(diǎn)是不需要特異性標(biāo)記，由細(xì)胞自身分泌表達(dá)的熒光蛋白。細(xì)胞內(nèi)蛋白分泌量和細(xì)胞的代謝及功能狀態(tài)有關(guān)系，其熒光強(qiáng)度和熒光蛋白表達(dá)的多少成正比[16]，可以提供有關(guān)樣品代謝和功能狀態(tài)的信息，可用于區(qū)分健康細(xì)胞和低活性細(xì)胞。

3.4

三維細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的熒光分析

UQCRC1是一種線粒體蛋白，在線粒體內(nèi)部的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用[17-18]。在三維細(xì)胞培養(yǎng)下，HT-29細(xì)胞中 UQCRC1蛋白表達(dá)增多（如圖5），表明其線粒體功能比二維細(xì)胞培養(yǎng)的有所增加。而 FITC488外源性熒光蛋白解決了內(nèi)源性熒光團(tuán)特異性低的局限性，它可以通過(guò)特定的熒光標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記并檢測(cè)蛋白分子的表達(dá)和分布，這種技術(shù)可以用來(lái)研究蛋白質(zhì)相互作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)定位等問(wèn)題。同時(shí)外源性熒光團(tuán)的壽命范圍以及使用方式具有多樣性，不受到細(xì)胞狀態(tài)的影響。

4

結(jié) 論

簡(jiǎn)單高效地構(gòu)建了具有良好的透光性和細(xì)胞兼容性的類血管結(jié)構(gòu)的微流控芯片，其制造過(guò)程簡(jiǎn)單，成本低且穩(wěn)定性高。類血管結(jié)構(gòu)保證了細(xì)胞在微流控芯片中的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，維持了細(xì)胞在芯片內(nèi)的高活力。同時(shí)通過(guò)在 HT-29細(xì)胞內(nèi)植入內(nèi)源性的 RFP 蛋白，利用微流控芯片進(jìn)行三維細(xì)胞培養(yǎng)，使用共聚焦顯微鏡對(duì)微流控芯片內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行成像，驗(yàn)證紅色熒光蛋白已經(jīng)在細(xì)胞內(nèi)充分表達(dá)，可以在不進(jìn)行細(xì)胞死活染色的情況下區(qū)分細(xì)胞的死活狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)的監(jiān)測(cè)。該方法可以用于基于微流控芯片的藥物開(kāi)發(fā)，以評(píng)估潛在的藥物化合物的毒性。通過(guò)基于細(xì)胞的熒光成像進(jìn)一步驗(yàn)證了三維培養(yǎng)下的 HT-29細(xì)胞與二維培養(yǎng)下的細(xì)胞活性的差別。經(jīng)過(guò)免疫熒光處理的三維細(xì)胞具有了外源性的綠色熒光蛋白，在激發(fā)條件下，三維培養(yǎng)的 HT-29細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于二維培養(yǎng)細(xì)胞的，驗(yàn)證了微流控芯片三維培養(yǎng)環(huán)境下 HT-29細(xì)胞中 UQCRC1蛋白的表達(dá)量提高，顯示出在微流控芯片三維培養(yǎng)環(huán)境下能更好地模擬體內(nèi)的真實(shí)環(huán)境。常規(guī)二維培養(yǎng)中發(fā)生的細(xì)胞扁平化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞骨架、基因表達(dá)、核形狀、細(xì)胞增殖和分化、藥物治療易感性等發(fā)生異常。微流控芯片平臺(tái)體外細(xì)胞培養(yǎng)可以更好地模擬真實(shí)的體內(nèi)組織，較二維細(xì)胞模型更適合用于癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移機(jī)制及藥物篩選的研究。

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（編輯：李曉莉）