于飛 李佳鑫

摘? 要：水解單寧（hydrolyzed tannin）是橡子內主要的單寧酸類型，對以橡子為主要食物來源的鼠類的生存繁衍有重要影響.為探究長期取食水解單寧對鼠類的生殖激素與生殖器官產生的影響.選擇72只（雌雄個體各36只）4周齡的健康昆明小鼠，隨機分為4組，分別為對照組（水解單寧比例為0）、低單寧組（水解單寧比例為2%）、中單寧組（水解單寧比例為7%）和高單寧組（水解單寧比例為12%），用不同水解單寧含量的飼料飼喂42 d后解剖取樣.結果顯示，高含量水解單寧顯著降低了雄鼠存活率；中、高含量水解單寧對生殖激素的穩(wěn)定產生負面效應；高含量水解單寧造成生殖器官損傷，導致小鼠卵巢與睪丸生理結構改變，降低了正常卵泡數(shù)量和精子的發(fā)生.試驗驗證了長期攝入高含量水解單寧打破了鼠類的生殖激素平衡且造成了生殖器官的損傷.

關鍵詞：精子質量；昆明小鼠；水解單寧；生殖毒性；生殖激素

中圖分類號：Q14????? 文獻標志碼：A文章編號：1000-2367（2024）03-0131-08

在我國多數(shù)林區(qū)，櫟樹的種子（橡子）是森林生態(tài)系統(tǒng)中鼠類的主要食物來源，食物對動物的生存和繁殖有重要影響，因此橡子的豐度和種類對鼠類種群的波動具有直接作用［1-2］.林區(qū)中數(shù)量龐大的鼠類，是喬木種子主要的捕食者與擴散者，但鼠類對種子的過度取食也會抑制種子的擴散［2］.同時，種子作為動物的主要食物來源，其內部的化學物質也影響著動物的行為方式與生理活動［3-4］.許多植物為了促進自身再生和擴大生存空間，進化出富含糖分或脂質的果實以及較大的種子［4-5］.此外，植物也進化出了一系列防止或減少動物過度取食的特性，如大年結實（間接防御）［5］、種子的硬殼（物理防御）［5］或高含量的單寧酸（化學防御）［5］.研究發(fā)現(xiàn)，大量攝入含有單寧酸的植物種子將導致鼠類體質量下降、生理異常甚至死亡［6］.

單寧酸是植物體內主要的次生代謝產物之一，廣泛分布于植物的根、莖、葉及種子中［7］.它還是植物的重要化學防御武器，用以防御病蟲害、抵御病原微生物和減少動物取食［7-8］.橡子中的單寧酸主要類型為水解單寧.研究表明水解單寧具有卓越的抗菌能力，適量攝入能改善動物腸道菌群的生態(tài)，對維持動物腸道的健康起著重要作用［9］；水解單寧還是抗生素的理想替代物，在食物中添加水解單寧對哺乳動物的腹瀉、寄生蟲等疾病有治療作用［10-12］.此外，水解單寧還具有抗腫瘤特性，有研究指出水解單寧通過減少炎癥和增加細胞凋亡的機制，在大鼠體內發(fā)揮抗腫瘤作用［13］.

目前水解單寧對動物生殖影響的研究主要集中在生殖激素調節(jié)、精子質量、體外胚胎生產與生殖能力等方面［14-16］.MANZOOR等［14］發(fā)現(xiàn)，水解單寧可以通過調節(jié)生殖激素，有效調節(jié)卵巢卵泡的健康和發(fā)育.YIN等［17］指出，豬卵母細胞體外成熟期間，用10 μg/mL水解單寧處理可提高卵母細胞的胞漿成熟度，而100 μg/mL水解單寧處理降低了卵母細胞的核成熟度.目前，相關研究較多關注短期試驗（試驗時長小于30 d），且是針對單一性別的研究，關于水解單寧對同種動物的雌雄個體的長期效應研究不足.因此本試驗采用ELISA

收稿日期：2023-03-10;修回日期：2023-03-28.

基金項目：國家自然科學基金（U1904105）；河南省高?？萍紕?chuàng)新人才項目（22HASTIT033）.

作者簡介（通信作者）：于飛（1986-），男，山西晉中人，河南師范大學副教授，博士生導師，研究方向為森林生態(tài)學，E-mail：yufei@htu.cn.

引用本文：于飛，李佳鑫.長期攝入水解單寧對鼠類生殖的影響［J］.河南師范大學學報（自然科學版），2024，52（3）：131-138.（Yu Fei，Li Jiaxin.Effects of long-term consumption of hydrolyzed tannin on the reproductive of rodents［J］.Journal of Henan Normal University（Natural Science Edition），2024，52（3）：131-138.DOI：10.16366/j.cnki.1000-2367.）

與石蠟切片的方法，對昆明小鼠的血清生殖激素濃度與生殖器官的生理結構進行研究，旨在研究水解單寧長期飼喂鼠類對雌雄兩性的生殖激素（雌二醇、促黃體生成素、促卵泡素及睪酮）與生殖器官（卵巢與睪丸）的影響.因野外條件下鼠類個體差異（年齡、體質量、遺傳背景、生存經歷等）較大［18］，采用野生鼠類研究其生理特征常有一定的局限性，若不了解個體差異或無大量樣本進行試驗，則得出的結論不具有普遍性.因此本研究擬在環(huán)境可控且穩(wěn)定的動物試驗室中進行，選擇昆明小鼠為試驗對象，并對試驗樣本的生理指標（年齡、體質量、行為指標等）進行嚴格篩選，以減少試驗結果的誤差.

1? 材料與方法

1.1? 試驗動物

2022年6月于河南斯克貝斯生物科技股份有限公司購買4周齡SPF級昆明小鼠，選擇72只（36只雌性，36只雄性）初始體質量在22～28 g之間的小鼠，試驗室內適應性飼養(yǎng)7 d后開始干預試驗，個體單獨置于長、寬、高分別為290 mm、180 mm、160 mm的聚丙烯飼養(yǎng)籠內飼養(yǎng)，采用玉米芯墊料，溫度設定為（25±2） ℃，相對濕度設定為（50±5）%，光周期12 h：12 h（8：00開始光照，20：00關閉光照），自由飲水、取食.所有飼養(yǎng)及解剖試驗操作均依照河南師范大學科研試驗動物倫理指導方法進行.

1.2? 試驗飼料

人工飼料需模擬橡子的水解單寧含量，因此收集橡子進行水解單寧含量的測定.2020年8至10月于濟源市愚公林場收集到栓皮櫟、銳齒槲櫟和蒙古櫟3種橡子，采用分光光度法檢測收集橡子的水解單寧含量，3種橡子水解單寧比例分別為（7.27±1.55）%、（8.42±1.38）%和（11.55±1.39）%.（如表1）.

表1? 種子水解單寧含量

Tab. 1? Hydrolyzed tannins content of seeds

種子種類水解單寧含量/%

栓皮櫟（7.27±1.55）a種子種類水解單寧含量/%銳齒槲櫟（8.42±1.38）a種子種類水解單寧含量/%蒙古櫟（11.55±1.39）b

注：數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，不同種類種子標有相同字母表示沒有顯著差異（p＞0.05），不同種類種子間標有不同字母表示存在顯著差異（p＜0.05）.

經文獻查閱，發(fā)現(xiàn)有些橡子的水解單寧含量較低（0～2%）［19］，因此本試驗將人工飼料的水解單寧含量設計為0、2%、7%與12%.使用試驗鼠生長繁殖飼料（粉料）（購自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司）作為對照組飼料的原料.分別在粉料中加入水解單寧（購自天津市致遠化學試劑有限公司），配置成0、2%、7%、12%水解單寧含量的人工飼料，加入蒸餾水壓制成顆粒，60 ℃低溫烘干制成對照組、低單寧組、中單寧組、高單寧組飼料.

1.3? 籠養(yǎng)試驗與取樣

2022年6月16日至8月30日，在小鼠適應性飼養(yǎng)均無異常情況后進行干預試驗.隨機分為4組，每組18只（9只雌性，9只雄性）獨籠飼養(yǎng)，分別用0、2%、7%、12%水解單寧含量的飼料飼養(yǎng)42 d，自由取食并供給充足飲水.期間每天早上8：00記錄各組小鼠的存活率，將存活小鼠于飼養(yǎng)第42 d解剖取樣.

解剖取樣前，將小鼠在不禁止飲水的情況下禁食12 h，用質量分數(shù)2%戊巴比妥鈉腹腔注射0.3 mL/100 g進行麻醉，麻醉后用進行心臟取血，血液保存于離心管并豎直靜置于4 ℃冰箱8 h.靜置后的血液在微型高速冷凍離心機4 ℃，3 000 r/min的條件下，離心10 min，吸取上層血清于新的離心管，保存于超低溫冰箱（-80 ℃）.脫頸處死小鼠后解剖，迅速取雌鼠卵巢和雄鼠睪丸.將卵巢與睪丸完全浸泡于盛有質量分數(shù)4%多聚甲醛溶液的離心管內固定，以便制作組織切片.

1.4? 數(shù)據(jù)測定及統(tǒng)計分析

為適應檢測范圍，提高檢測的靈敏度和準確性，將小鼠血清稀釋5倍后用ELISA法測定血清中雌二醇、促黃體生成素、促卵泡生成素和睪酮的濃度.將卵巢和睪丸用石蠟切片法制作組織切片，HE染色后電子顯微鏡觀察組織結構.使用單因素方差分析（One-way ANOVAs）分析小鼠存活率和生殖激素濃度.所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21進行分析，數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，用Origin 8.0軟件進行作圖.

2? 結果與分析

2.1? 水解單寧對存活率的影響

試驗進行42 d后，對照組、低單寧組和中單寧組的存活率為100.0%，高單寧組出現(xiàn)了小鼠死亡現(xiàn)象，雌性高單寧組的存活率為88.9%，雄性高單寧組的存活率為45.5%（圖1），水解單寧含量對雌性小鼠存活率無顯著影響（p=0.751），對雄性小鼠存活率具有顯著影響（p=0.037）.這說明中、低含量水解單寧（2%和7%）的食物對小鼠沒有致死性，而高含量水解單寧（12%）的食物對其則有致死作用，且雄鼠較雌鼠對水解單寧含量的變化更敏感.

2.2? 水解單寧對生殖激素的影響

2.2.1? 雌二醇（E2）

水解單寧含量對小鼠血清中E2稀釋5倍后濃度存在顯著影響（p＜0.001）.稀釋5倍后雌鼠E2濃度最高的是對照組，其濃度為7.918 nmol/L，最低的是低單寧組，其濃度為5.039 nmol/L，中單寧組和高單寧組的E2濃度分別為5.472 nmol/L和5.681 nmol/L.雌鼠對照組與低單寧組（p＜0.001）、中單寧組（p＜0.001）和高單寧組（p＜0.001）間存在顯著差異（圖2）.稀釋5倍后雄鼠E2濃度最低的是對照組，其濃度為4.002 nmol/L，最高的是低單寧組，其濃度為7.260 nmol/L，中單寧組和高單寧組的E2濃度分別為4.805 nmol/L和4.362 nmol/L.雄鼠低單寧組與對照組（p＜0.001）、中單寧組（p＜0.001）和高單寧組（p＜0.001）間存在顯著差異（圖2）.結果表明水解單寧對雌鼠的E2分泌有顯著負效應，但低含量水解單寧能促進雄鼠E2的分泌.

2.2.2? 促黃體生成素（LH）

水解單寧含量對雌鼠血清中LH稀釋5倍后濃度存在顯著影響（p=0.006）.稀釋5倍后雌鼠LH濃度最高的是低單寧組，其濃度為1.025 nmol/L，最低的是對照組，其濃度為0.589 nmol/L，而中單寧組和高單寧組LH濃度分別為0.709 nmol/L和0.769 nmol/L.雌鼠低單寧組與對照組（p=0.001）、中單寧組（p=0.008）和高單寧組（p=0.016）間存在顯著差異（圖3）.水解單寧含量對雄鼠LH稀釋5倍后濃度不存在顯著影響（p=0.857）（圖3），稀釋5倍后雄鼠LH濃度最高的是高單寧組，其濃度為0.838 nmol/L，最低的是中單寧組，其濃度為0.774 nmol/L，而對照組和低單寧組的LH濃度分別為0.825 nmol/L和0.810 nmol/L.結果表明水解單寧對雄鼠LH濃度則無顯著干擾，僅在低含量時促進雌鼠LH的分泌.

2.2.3? 促卵泡生成素（FSH）

水解單寧含量對雌鼠血清中FSH稀釋5倍后的濃度不存在顯著影響（p=0.054）（圖4）.稀釋5倍后雌鼠FSH濃度最高的是低單寧組，其濃度為9.094 nmol/L，最低的是對照組，其濃度為6.176 nmol/L，中單寧組和高單寧組的FSH濃度居分別為7.405 nmol/L和7.439 nmol/L.水解單寧含量對稀釋5倍后雄鼠血清中FSH的濃度存在顯著影響（p=0.039），稀釋5倍后雄鼠FSH濃度最高的是低單寧組，其濃度為9.112 nmol/L，最低的是對照組，其濃度為5.995 nmol/L，中單寧組和高單寧組的FSH濃度分別為7.677 nmol/L和7.358 nmol/L，雄鼠對照組與低單寧組間存在顯著差異（p=0.006）（圖4）.試驗結果表明，水解單寧對雌鼠的FSH分泌無顯著影響，但對雄鼠FSH的分泌有顯著正效應.

2.2.4? 睪酮（T）

水解單寧含量對小鼠血清中T稀釋5倍后濃度存在顯著影響（雌性p=0.028，雄性p＜0.001）.稀釋5倍后雌鼠T濃度最高的是低單寧組，其濃度為3.228 nmol/L，最低的是對照組，其濃度為2.244 nmol/L，中單寧組和高單寧組的T濃度分別為2.649 nmol/L和2.482 nmol/L.雌鼠低單寧組與對照組（p=0.004）和高單寧組（p=0.015）間存在顯著差異（圖5）.稀釋5倍后雄鼠T濃度最高的是對照組，其濃度為3.285 nmol/L，最低的是低單寧組，其濃度為2.088 nmol/L，中單寧組和高單寧組的T濃度分別為3.089 nmol/L和2.661 nmol/L.雄鼠對照組與低單寧組（p=0.006）和高單寧組（p=0.033）間存在顯著差異，低單寧組與中單寧組（p=0.001）和高單寧組（p=0.025）間存在顯著差異（圖5）.結果顯示，低含量的水解單寧促進雌鼠T的分泌，但水解單寧會降低雄鼠T的分泌.

2.3? 水解單寧對生殖器官的影響

觀察小鼠卵巢切片，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，低單寧組卵巢中健康生長的卵泡數(shù)量無明顯差異，且能觀察到初級和次級卵泡（圖6（a，b）），中、高單寧組初級卵泡數(shù)量、健康的生長卵泡數(shù)量減少，高單寧組閉鎖卵泡數(shù)量增多且卵巢呈現(xiàn)萎縮狀態(tài)（圖6（c，d））.

觀察小鼠睪丸切片，發(fā)現(xiàn)對照組與低單寧組生精小管狀態(tài)相似（圖7（a，b）），中、高單寧組觀察到觀察到多數(shù)生精小管呈空心管狀，生精細胞層與腔內精細胞數(shù)量減少，且生精細胞排列雜亂（圖7（c，d））.

3? 討? 論

3.1? 水解單寧與存活率

研究結果發(fā)現(xiàn)，食物中水解單寧含量的升高會降低小鼠的存活率，這與先前的研究結果一致［20］.本研究新發(fā)現(xiàn)雄鼠相較于雌鼠對水解單寧的變化更加敏感，攝入高含量的水解單寧，雄鼠的死亡率更高.分析原因之一可能是由于雌性在生理周期時體內各激素水平變化，對雌性動物起到保護作用［21］，另一種原因可能是單寧酸作為一種植物雌激素的衍生物，具有雌激素或抗雌激素活性［22］，更易參與雌性生理調節(jié)過程.

3.2 ?水解單寧與生殖激素

E2是一種雌激素，具有促進卵泡發(fā)育和排卵，促進精子的產生，調節(jié)性激素的平衡及維持生殖器官的健康等作用［23］.本研究結果顯示雌鼠血清中的E2濃度隨著食物中水解單寧含量的升高顯著降低，而雄鼠的E2濃度僅在低單寧組表現(xiàn)為顯著升高，其他組別無顯著變化.E2在雌性體內主要由顆粒細胞和卵泡壁細胞分泌，在雄性體內主要由睪丸間質細胞分泌［24］，且E2的代謝過程需要肝臟、腎臟、膽管與腸道參與［24］.分析認為，雌鼠體內E2濃度降低主要由于高含量水解單寧造成卵巢的損傷導致的（圖6），卵巢內正常發(fā)育的卵泡細胞減少直接導致E2的分泌量下降.而低含量水解單寧則促進了雄鼠睪丸的發(fā)育與睪丸間質細胞的生長［25］，因此對雄鼠E2的分泌產生正效應.

LH和FSH都是由垂體前葉分泌的激素，二者共同作用，在雌鼠體內具有促進卵泡發(fā)育和排卵，促進雌激素的合成，以及生成和維持黃體等作用［26］，在雄鼠體內具有促進睪丸間質細胞合成，促進睪酮合成，以及促進睪丸中精子發(fā)生的作用［27］，二者經常聯(lián)合檢測以鑒別生殖疾病的類型.研究結果表明低含量水解單寧對小鼠LH或FSH分泌影響顯著，而高含量水解單寧對小鼠體內二者分泌影響不顯著（圖3，圖4）.兩種激素的分泌調控機制復雜，受到下丘腦-垂體-性腺軸控制，并通過負反饋機制進行調節(jié)，此外一些神經調節(jié)物質和激素也可以影響LH和FSH的分泌［28］，因此水解單寧對小鼠LH和FSH的調節(jié)機制需結合生殖器官狀態(tài)進一步分析.本研究發(fā)現(xiàn)，低含量水解單寧促進雌鼠T的分泌，但抑制了雄鼠T的分泌，伴隨單寧含量的增加，雄鼠T濃度呈現(xiàn)不規(guī)則波動.

3.3? 水解單寧與生殖器官

研究發(fā)現(xiàn)，高含量水解單寧對小鼠生殖器官產生了負面影響.具體而言，高含量水解單寧導致雌鼠卵巢萎縮，健康卵泡數(shù)量減少，閉鎖卵泡數(shù)量增多，導致雄鼠生精小管呈現(xiàn)空心管狀，生精細胞層與腔內精細胞數(shù)量減少，生精細胞排列雜亂.分析認為，當飲食中含有低含量的水解單寧時，鼠類可以通過調節(jié)體內生殖激素水平來維持其生殖器官的正常發(fā)育［29-30］；當飲食中含有中等含量的水解單寧時，水解單寧的負面作用更加明顯且鼠類的激素調節(jié)能力減弱，導致生殖器官與生殖細胞的正常發(fā)育受到抑制；當飲食中含有高含量的水解單寧時會表現(xiàn)出明顯的抗營養(yǎng)效應，從而影響蛋白質的吸收率［31］，此外，水解單寧易于吸收，高含量的水解單寧攝入會導致胃黏膜損傷和肝臟解毒負擔，并對其他器官造成損傷，引起多器官衰竭.因此，低含量的水解單寧對生殖器官無明顯影響；中等含量的水解單寧會抑制雌鼠卵泡和雄鼠精子的生長發(fā)育；高含量的水解單寧可能導致生殖器官早衰甚至萎縮，從而降低雌鼠受孕能力和雄鼠精子數(shù)量.

4? 結論及展望

研究結果表明高含量水解單寧降低了鼠類存活率且具有性別差異，雄鼠的死亡率更高，進一步分析發(fā)現(xiàn)水解單寧干擾了生殖激素的互補性和綜合作用，并對卵巢和睪丸造成損傷，下一步將針對雄鼠的精子質量及胚胎的生長發(fā)育進行深入研究.本研究仍存在一些不足之處，如水解單寧對野外鼠類與小鼠影響的差異性，子代的出生率與存活率對鼠類數(shù)量的影響等尚未探究.未來可探索更大時空尺度上橡子單寧酸含量的年際變化和鼠類種群數(shù)量波動規(guī)律，在水解單寧與子代性別比例、生殖毒性、乳汁營養(yǎng)和長期效應的影響方面仍然需要大量研究.

參? 考? 文? 獻

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Effects of long-term consumption of hydrolyzed tannin on the reproductive of rodents

Yu Fei， Li Jiaxin

（College of Life Sciences， Henan Normal University， Xinxiang 453007， China）

Abstract： Hydrolyzed tannin， the predominant type of tannic acid in acorns， has a significant impact on the survival and reproduction of rodents that primarily feed on acorns. The aim of this experiment was to explore the impact of long-term hydrolyzed tannin consumption on the reproductive hormones and reproductive organs of rodents. 72 four-week-old healthy Kunming mice（36 males and 36 females） and randomly divided them into four groups：control group（with 0% hydrolyzable tannin content）， low-tannin group（with 2% hydrolyzable tannin content）， medium-tannin group（with 7% hydrolyzable tannin content）， and high-tannin group（with 12% hydrolyzable tannin content）. After being fed with different levels of hydrolyzable tannin-containing diets for 42 days， the mice were dissected for sampling. The results showed that：High levels of hydrolyzed tannin significantly reduced the survival rate of male mice. Moderate to high levels of hydrolyzed tannin had a negative impact on the stable production of reproductive hormones. High levels of hydrolyzed tannin caused damage to the reproductive organs， leading to changes in the physiological structure of the ovaries and testes in mice， and a reduction in the number of normal follicles and spermatogenesis. The experiment confirmed that long-term intake of high levels of hydrolyzed tannins disrupted the hormonal balance of rodents and caused damage to their reproductive organs.

Keywords： sperm quality; Kunming mice; hydrolyzed tannin; reproductive toxicity; reproductive hormones

［責任編校? 劉洋? 楊浦］