王利元， 劉紅， 李晶， 白夢(mèng)婷， 吳悠

（武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，湖北武漢 430030）

糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD）是糖尿病最重要的微血管并發(fā)癥之一，是終末期腎?。‥SRD）的主要病因，伴有尿微量白蛋白分泌逐漸增加和腎小球硬化，是公認(rèn)的心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。盡管糖尿病患者血糖、血脂、血壓控制較好，但進(jìn)展至ESRD 時(shí)，除腎臟替代治療外，目前DKD仍缺乏有效的治療手段[2]。因此，探索DKD 新的藥物或治療方法具有重要意義?；辫近S顆粒是由槐耳菌質(zhì)、枸杞子、黃精配制的中成藥，既往臨床觀察發(fā)現(xiàn)，其可有效改善DKD 患者尿蛋白水平[3]。前期藥理研究表明槐杞黃顆粒可通過(guò)保護(hù)腎小球足細(xì)胞、抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖、抗腎間質(zhì)纖維化、減輕腎臟炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、調(diào)控腎臟細(xì)胞凋亡及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能等多種機(jī)制干預(yù)慢性腎臟病的進(jìn)展[4]；但其具體作用機(jī)制尚不完全明確。因此，本研究構(gòu)建DKD 大鼠模型以及對(duì)體外高糖暴露的腎細(xì)胞HK2 模型，進(jìn)一步觀察槐杞黃顆粒的腎保護(hù)作用機(jī)制，以期為槐杞黃顆粒臨床應(yīng)用于DKD 的治療提供理論依據(jù)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF 級(jí)4～5 周齡雄性SD 大鼠，體質(zhì)量110 ～150 g，購(gòu)自于北京卓凱生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SYXK（京）2021-0025。所有動(dòng)物飼養(yǎng)在SPF 房間，溫度為（25 ±1）℃，相對(duì)濕度55% ～60%，光照/黑暗循環(huán)12 h，均可自由獲得食物和飲用水。所有涉及動(dòng)物的程序均嚴(yán)格按照武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的指導(dǎo)方針和方案進(jìn)行（批準(zhǔn)號(hào)：20230015）。高脂肪飼料（40 kJ/kg，脂肪含量占20%）購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。

1.2 細(xì)胞株人近端腎小管上皮細(xì)胞（HK2），購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。以添加100 U/mL青霉素/鏈霉素混合物和10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)。

1.3 藥物、試劑與儀器槐杞黃顆粒（啟東蓋天力藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字B20020074）；氯沙坦（美國(guó)MCE 公司，CAS：114798-26-4，純度：99.67%）。RPMI-1640 培養(yǎng)基（上海哈靈生物科技有限公司）；胎牛血清（德國(guó)Capricorn Scientific GmbH 公司）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美國(guó)Sigma公司）；尿微量白蛋白酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；空腹血糖、血清肌酐、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇等檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）；纖維連接蛋白（FN）抗體、Ⅳ型膠原蛋白（Col Ⅳ）抗體（美國(guó)Abcam 公司）；NOD 樣受體蛋白3（NLRP3）抗體（美國(guó)Epitomics公司）；裂解型半胱天冬酶3（cleaved-Caspase-3）抗體、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）抗體和β-actin 抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology 公司）；二抗包括過(guò)氧化物酶偶聯(lián)山羊抗兔和抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）（美國(guó)Jackson ImmunoResearch Laboratory 公司）；2’，7’-二氫二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）（Beyotime 公司）；聚偏氟乙烯（PVDF）膜（美國(guó)Millipore 公司）。ACCU-CHEK血糖測(cè)定儀（瑞士Roche公司）。

1.4 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1.4.1 分組、造模與給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為2組：正常組（10只）、造模組（63只）。造模組大鼠采用高脂肪飼料喂養(yǎng)結(jié)合STZ腹腔注射法構(gòu)建DKD模型[5]。方法：造模組大鼠飼喂高脂肪飼料（40 kJ/kg，脂肪含量占20%）4 周，同期正常組大鼠飼喂正常顆粒飼料（20 kJ/kg，脂肪含量占5%），然后造模組大鼠單次腹腔注射30 mg/kg STZ[溶解于冰冷的檸檬酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH 4.4）]，正常組大鼠注射等體積的檸檬酸鈉緩沖液。STZ 注射后第3 天，采用血糖測(cè)定儀測(cè)定大鼠尾尖空腹血糖，若血糖＞16.7 mmol/L，再結(jié)合腎組織病理結(jié)果，則判斷DKD 模型構(gòu)建成功。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為5 組，即模型組，槐杞黃顆粒低、中、高劑量組及氯沙坦組，每組10 只?；辫近S顆粒低、中、高劑量組大鼠分別給予25、50、100 mg·kg-1·d-1槐杞黃顆粒生理鹽水混懸液灌胃，氯沙坦組以20 mg·kg-1·d-1氯沙坦生理鹽水混懸液灌胃，模型組和正常組給予等體積生理鹽水灌胃。療程均為12 周。動(dòng)物劑量按成人與大鼠的體表面積換算。每2周測(cè)定一次體質(zhì)量和空腹血糖。干預(yù)結(jié)束后，測(cè)定尿微量白蛋白，然后稱體質(zhì)量，麻醉處死，快速采集血液、腎臟等樣本。

1.4.2 血清與尿液生化指標(biāo)分析 干預(yù)結(jié)束后，收集24 h 尿液，采用ELISA 法測(cè)定尿微量白蛋白水平。采用葡萄糖氧化酶（GOD）/過(guò)氧化物酶（POD）法測(cè)定空腹血糖，采用肌氨酸氧化酶（SOX）法測(cè)定血清肌酐，甘油磷酸氧化酶（GPO）-PAP法測(cè)定血清總膽固醇，雙試劑直接法檢測(cè)血清低密度脂蛋白膽固醇。

1.4.3 腎指數(shù) 稱體質(zhì)量、腎臟質(zhì)量，計(jì)算腎指數(shù)，公式：腎指數(shù)（mg/g）=腎質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

1.4.4 腎組織病理學(xué)觀察 取腎臟組織，在4%多聚甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋，4μm 切片。采用蘇木素-伊紅（HE）染色法進(jìn)行一般病理形態(tài)學(xué)分析，采用高碘酸希夫（PAS）染色法進(jìn)行腎小球硬化評(píng)估，采用馬松（Masson）染色法進(jìn)行膠原沉積和間質(zhì)病變?cè)u(píng)估。每組隨機(jī)選取20 個(gè)腎小球，用ImageJ軟件（National Institute of Health，美國(guó)）評(píng)估腎小球中PAS陽(yáng)性面積的百分比，記為系膜指數(shù)。

1.5 體外實(shí)驗(yàn)

1.5.1 采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法測(cè)定細(xì)胞增殖能力 將細(xì)胞以4 000 個(gè)/孔接種于96 孔板中，每組設(shè)6 個(gè)平行孔。將細(xì)胞暴露于正常葡萄糖（5 mmol/L）或高糖（30 mmol/L）[6]中，每孔分別加入終濃度為10、20、40、80μmol/L 的槐杞黃顆粒培養(yǎng)48、72 h。加入MTT 溶液（0.5 mg/mL），37 ℃孵育4 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀于570 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（OD）值。

1.5.2 細(xì)胞內(nèi)ROS 生成和線粒體ROS 生成的檢測(cè) 將細(xì)胞以4 000 個(gè)/孔接種于96 孔板中，每組設(shè)6 個(gè)平行孔，暴露于正常葡萄糖（5 mmol/L）或高糖（30 mmol/L）中，每孔分別加入5、10、20 μmol/L 槐杞黃顆粒孵育24 h。加入10μmol/L 的ROS 熒光探針DCFH-DA 避光培養(yǎng)20 min 后，應(yīng)用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)。

為了觀察線粒體ROS 生成情況，將細(xì)胞以1×105個(gè)/mL 的密度接種于直徑35 mm 培養(yǎng)皿的蓋玻片上。貼壁后，將細(xì)胞暴露于正常葡萄糖（5 mmol/L）或高糖（30 mmol/L）中，同時(shí)用或不用20μmol/L 槐杞黃顆粒處理24 h。同時(shí)段，甘露醇組不加槐杞黃顆粒以排除滲透壓影響：5 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L甘露醇。進(jìn)行MitoSOX（呈紅色）/Hoechst 33342（呈藍(lán)色）染色。所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程均在避光條件下進(jìn)行，應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡對(duì)樣品進(jìn)行觀察。

1.5.3 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)炎癥小體相關(guān)蛋白NLRP3、cleaved-Caspase-3 和IL-1β及腎纖維化相關(guān)蛋白FN 和Col Ⅳ的表達(dá) 將細(xì)胞以8×104個(gè)/孔接種在6 孔板，每組設(shè)3 個(gè)平行孔。細(xì)胞貼壁后，暴露于正常葡萄糖（5 mmol/L）或高糖（30 mmol/L）下，每孔中加入槐杞黃顆粒，最終濃度分別為5、10、20 μmol/L，培養(yǎng)72 h。同時(shí)段，不加槐杞黃顆粒的甘露醇組（5 mmol/L 葡萄糖+25 mmol/L 甘露醇）排除滲透影響。然后收集細(xì)胞，裂解、提取蛋白，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。3%牛血清白蛋白封閉，加入一抗和二抗孵育，顯色，顯影。采用ImageJ 軟件進(jìn)行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法采用GraphPad Prism 6 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。至少3 個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （±s）表示。2 組間比較采用Studentt檢驗(yàn)（雙尾），多組間的比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 槐杞黃顆粒對(duì)DKD 大鼠尿微量白蛋白排泄、血清肌酐水平，高血糖和脂質(zhì)代謝紊亂及腎臟組織病理病變的影響在槐杞黃顆粒給藥12 周結(jié)束時(shí)，檢測(cè)反映腎損傷的24 h 尿微量白蛋白排泄量和反映腎功能的血清肌酐水平。如圖1-A～B 結(jié)果所示：與正常組比較，模型組尿微量白蛋白和血清肌酐水平顯著升高（P＜0.05）；而與模型組比較，50、100 mg/kg 槐杞黃顆粒組的尿微量白蛋白和血清肌酐水平顯著降低（P＜0.05）。測(cè)定空腹血糖以評(píng)價(jià)槐杞黃顆粒對(duì)糖代謝的影響，如圖1-C 結(jié)果所示：與模型組比較，25、50 mg/kg槐杞黃顆粒組大鼠空腹血糖水平顯著降低（P＜0.05）。觀察槐杞黃顆粒對(duì)脂質(zhì)代謝紊亂的調(diào)節(jié)作用，如圖1-D～E結(jié)果所示：與正常組比較，模型組低密度脂蛋白膽固醇和總膽固醇的水平顯著升高（P＜0.05）；50、100 mg/kg槐杞黃顆粒組的低密度脂蛋白膽固醇和總膽固醇水平水平顯著低于模型組（P＜0.05）。此外，與正常組比較，模型組腎指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，50、100 mg/kg 槐杞黃顆粒組腎指數(shù)顯著下降（P＜0.05）。槐杞黃顆粒各劑量組以上各指標(biāo)與氯沙坦組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖1-F。

圖1 各組大鼠24 h尿微量白蛋白、血清肌酐、血糖、血脂及腎指數(shù)水平比較Figure 1 Comparison of 24-hour urinary albumin，serum creatinine，blood glucose，blood lipids and renal index levels in rats among various groups

腎組織切片分別進(jìn)行HE、PAS 和Masson 染色，結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠出現(xiàn)腎臟病理改變， 包括HE 染色可見(jiàn)系膜基質(zhì)增加，PAS 染色可見(jiàn)明顯的節(jié)段性腎小球硬化。由于DKD 動(dòng)物模型的局限性，所有DKD 大鼠Masson 染色均未見(jiàn)間質(zhì)病變。與模型組比較，槐杞黃顆粒各劑量組腎臟病變明顯減輕，特別是100 mg/kg 槐杞黃顆粒。見(jiàn)圖2。各組PAS 染色量化腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張情況見(jiàn)圖3，結(jié)果顯示：模型組腎小球系膜指數(shù)顯著高于正常組（P＜0.05），50、100 mg/kg槐杞黃顆粒組腎小球系膜指數(shù)顯著低于模型組（P＜0.05），且與氯沙坦組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明槐杞黃顆?？梢种艱KD 大鼠的細(xì)胞外基質(zhì)積累和系膜基質(zhì)擴(kuò)張，減輕腎纖維化。

圖2 各組大鼠腎臟組織病理病變比較（×400）Figure 2 Comparison of features of renal histopathological lesions in rats among various groups（×400）

圖3 各組PAS染色量化腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張比較Figure 3 Comparison of PAS staining quantitative glomerular mesangial matrix expansion among various groups

2.2 槐杞黃顆粒對(duì)高糖誘導(dǎo)HK2細(xì)胞增殖活力的影響采用MTT 法檢測(cè)槐杞黃顆粒對(duì)HK2 細(xì)胞增殖的影響，如圖4所示：與正常糖組比較，高糖暴露48、72 h 后HK2 細(xì)胞增殖活力增加（P＜0.05）。與不含槐杞黃顆粒的高糖組比較，高于20μmol/L槐杞黃顆粒處理48 h 和72 h 后細(xì)胞增殖活力顯著降低（P＜0.05）。

圖4 槐杞黃顆粒對(duì)高糖誘導(dǎo)人腎近端小管上皮細(xì)胞（HK2）48、72 h增殖情況的影響（n=6）Figure 4 Effect of Huaiqihuang Granules on the proliferation of human renal proximal tubular epithelial cells（HK2）induced by high glucose for 48 and 72 hours（n=6）

2.3 槐杞黃顆粒對(duì)高糖誘導(dǎo)HK2細(xì)胞內(nèi)ROS生成和線粒體ROS生成的影響采用熒光探針DCFHDA 法和MitoSOX/Hoechst 33342 染色法分別檢測(cè)HK2 細(xì)胞胞內(nèi)ROS 生成和線粒體ROS 生成。結(jié)果如圖5-A 所示：與正常糖組比較，高糖組細(xì)胞內(nèi)ROS 水平顯著升高（P＜0.05）；與高糖組比較，槐杞黃顆粒處理后ROS 水平呈濃度依賴性降低，特別是10μmol/L和20μmol/L濃度的槐杞黃顆粒處理組HK2 細(xì)胞中ROS 的產(chǎn)生顯著減少（P＜0.05）。如圖5-B 所示，在高糖組中觀察到線粒體ROS 生成增加，但被20μmol/L 的槐杞黃顆粒處理后顯著抑制。此外，正常糖組和甘露醇組線粒體ROS 生成無(wú)明顯差異。這2個(gè)ROS檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了槐杞黃顆?？稍鰪?qiáng)高糖誘導(dǎo)腎細(xì)胞的抗氧化能力。

圖5 槐杞黃顆粒對(duì)高糖誘導(dǎo)HK2細(xì)胞內(nèi)ROS生成和線粒體ROS生成的影響Figure 5 Effects of Huaiqihuang Granules on intracellular ROS generation and mitochondrial ROS generation in HK2 cells induced by high glucose

2.4 槐杞黃顆粒對(duì)高糖誘導(dǎo)HK2細(xì)胞NLRP3炎癥小體活化的影響如圖6 所示：與正常糖組比較，高糖組的NLRP3、cleaved-Caspase-1和IL-1β 的蛋白表達(dá)水平顯著提高；而與高糖組比較，槐杞黃顆粒組的NLRP3、cleaved-Caspase-1和IL-1β 的蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。

圖6 槐杞黃顆粒對(duì)高糖誘導(dǎo)HK2細(xì)胞NLRP3炎癥小體活化的影響Figure 6 Effect of Huaiqihuang Granules on NLRP3 inflammasome activation in HK2 cells induced by high glucose

2.5 槐杞黃顆粒對(duì)高糖誘導(dǎo)HK2 細(xì)胞腎纖維化相關(guān)蛋白FN、Col Ⅳ表達(dá)的影響如圖7 所示：HK2 細(xì)胞中FN、Col Ⅳ的蛋白表達(dá)水平在高糖作用下升高，但在槐杞黃顆粒處理后逐漸降低。高糖組HK2 細(xì)胞中FN、Col Ⅳ的蛋白表達(dá)水平顯著高于正常糖組（P＜0.05）；10、20μmol·L-1槐杞黃顆粒組細(xì)胞中FN、Col Ⅳ的蛋白表達(dá)水平顯著低于高糖組（P＜0.05）。

圖7 槐杞黃顆粒對(duì)高糖誘導(dǎo)HK2細(xì)胞纖維連接蛋白（FN）和Ⅳ型膠原蛋白（Col Ⅳ）表達(dá)的影響Figure 7 Effects of Huaiqihuang Granules on the expression of fibronectin（FN）and collagen Ⅳ（Col Ⅳ）in HK2 cells induced by high glucose

3 討論

糖尿病腎病（DKD）屬中醫(yī)消渴病并發(fā)癥，其病因歸同消渴病。糖尿病腎病的基本病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，氣陰兩虛是發(fā)病根本，病變初期以陰虛為主，遷延日久陰傷及氣，終致氣陰兩虛，貫穿始終，其他變證均由氣陰兩虛所致，只有氣陰兩虛得到有效控制，疾病才能有所緩解[6]?；辫近S顆粒正具有益氣養(yǎng)陰功效。本研究結(jié)果表明，槐杞黃顆粒可顯著改善DKD 大鼠的尿微量白蛋白排泄、血清肌酐水平，高血糖及脂質(zhì)代謝紊亂，并可通過(guò)抑制細(xì)胞外基質(zhì)積聚和系膜基質(zhì)擴(kuò)張而減輕腎臟纖維化，從而減輕DKD 大鼠的腎損害，提示槐杞黃顆?？赡艹蔀橹委烡KD的一種新藥物。

氧化應(yīng)激和慢性低度炎癥在DKD 中起著至關(guān)重要的作用[7]。高糖不僅促進(jìn)ROS的生成和NLRP3炎癥小體的激活[8]，也會(huì)刺激包括纖維連接蛋白（FN）和Ⅳ型膠原蛋白（Col Ⅳ）在內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白在DKD 中的積累增加，從而導(dǎo)致腎小球硬化和小管間質(zhì)纖維化[9]。在經(jīng)典DKD發(fā)病機(jī)制的初始激活和核心事件中，ROS 的產(chǎn)生可以通過(guò)PI3K 途徑激活炎癥介質(zhì)，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞中Caspase-1 的激活和IL-1β 的分泌[10-11]。高血糖或高糖誘導(dǎo)的NLRP3 炎癥介質(zhì)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP），與NLRP3 共同構(gòu)成細(xì)胞應(yīng)激傳感器，識(shí)別過(guò)度氧化應(yīng)激或危險(xiǎn)信號(hào)，觸發(fā)炎癥反應(yīng)。ROS 刺激后，氧化的硫氧還蛋白（Trx）釋放出硫氧還蛋白相互作用蛋白，直接結(jié)合NLRP3的LRR 結(jié)構(gòu)域，介導(dǎo)炎癥小體的組裝[12]。ROS 還可以引起核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）和p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信號(hào)激活NLRP3 炎癥小體[13]。激活的NLRP3 炎癥小體刺激促炎細(xì)胞因子的分泌，隨后Caspase-1 激活，引發(fā)慢性低度炎癥。此外，ROS 通過(guò)促進(jìn)腎臟炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，加速細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度積累。本研究結(jié)果表明，高糖刺激誘導(dǎo)HK2 細(xì)胞增殖，過(guò)量的ROS 生成，激活NLRP3炎癥小體和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)。槐杞黃顆粒抑制高糖誘導(dǎo)的HK2 細(xì)胞增殖、細(xì)胞內(nèi)和線粒體ROS 過(guò)量生成，顯著降低高糖誘導(dǎo)的HK2 細(xì)胞腎纖維化標(biāo)志蛋白FN、Col Ⅳ，NLRP3炎癥小體活化及cleaved-Caspase-1 和IL-1β表達(dá)。

綜上所述，槐杞黃顆粒可以降低DKD 大鼠的尿微量白蛋白排泄、血清肌酐水平，改善糖脂代謝紊亂，減輕腎臟組織病理?yè)p害?；辫近S顆?？赡芡ㄟ^(guò)抑制高糖誘導(dǎo)HK2 細(xì)胞ROS 生成、減輕NLRP3 炎癥小體的激活和腎纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)揮腎保護(hù)作用。