孫樂(lè)常， 孫小舒， 林端權(quán)， 陳玉磊，翁 凌， 繆 松,4， 曹敏杰*

(1. 集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2. 集美大學(xué)，水產(chǎn)品深加工技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 廈門 361021；3. 大連工業(yè)大學(xué)，海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034；4. 愛(ài)爾蘭農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)與食品發(fā)展局Teagasc 食品研究中心，愛(ài)爾蘭 科克 999014)

嬰幼兒輔助食品(輔食)是除母乳外，為滿足嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)與生長(zhǎng)發(fā)育需要而添加的其他食物[1]。大米作為谷物類輔食——嬰幼兒米粉的主要原料，富含淀粉、蛋白質(zhì)及維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是嬰幼兒首選添加的輔食[2]。然而大米淀粉經(jīng)烹飪糊化后易迅速老化，老化淀粉不僅會(huì)使食品質(zhì)地和味道變差，降低產(chǎn)品質(zhì)量，還會(huì)降低其消化吸收率，這可能為嬰幼兒脆弱的消化系統(tǒng)帶來(lái)負(fù)擔(dān)[3]。國(guó)內(nèi)外研究顯示，通過(guò)向淀粉中添加蛋白質(zhì)或蛋白水解物，可以一定程度上延緩或抑制淀粉的老化行為，從而可能減少嬰幼兒米粉類食品的品質(zhì)劣化。肖瑜等[4]研究了不同蛋白質(zhì)對(duì)大黃米淀粉老化的抑制機(jī)制，發(fā)現(xiàn)淀粉-蛋白質(zhì)能夠由氫鍵作用而緊密相連，而且蛋白質(zhì)的加入可以降低體系老化焓，抑制大黃米淀粉重結(jié)晶，從而延緩其老化。Niu 等[5]發(fā)現(xiàn)豬血漿蛋白水解物可以與直鏈淀粉相互作用，減少玉米淀粉間的氫鍵結(jié)合，對(duì)抑制淀粉短期老化具有重要作用。Niu 等[6]使用復(fù)合蛋白酶制備米糠蛋白水解物，發(fā)現(xiàn)其能夠分散于糊化大米淀粉分子之間，阻止氫鍵形成，具有抑制大米淀粉短期和長(zhǎng)期老化的作用。

海洋魚(yú)類蛋白具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、易消化等優(yōu)點(diǎn)，是理想的優(yōu)質(zhì)蛋白資源。將魚(yú)類蛋白應(yīng)用于嬰幼兒米粉類產(chǎn)品中，不僅能賦予產(chǎn)品更豐富的風(fēng)味，還能提高產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，滿足嬰幼兒對(duì)優(yōu)質(zhì)蛋白攝入的營(yíng)養(yǎng)要求。為了進(jìn)一步提高魚(yú)類蛋白的可應(yīng)用性，國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者通過(guò)等電點(diǎn)沉淀法制備分離蛋白，不僅有效回收魚(yú)肌肉中的優(yōu)質(zhì)蛋白，還可去除脂肪、骨刺等雜質(zhì)[7]。然而，制備獲得的魚(yú)類分離蛋白經(jīng)干燥后溶解性差，直接添加進(jìn)米粉，容易發(fā)生絮凝、分層等現(xiàn)象，必須進(jìn)行一定的改性以提高溶解性。針對(duì)這一問(wèn)題，目前國(guó)內(nèi)外主要采用單酶或多酶酶解的方法進(jìn)行改性。Alahmad 等[8]使用無(wú)花果蛋白酶對(duì)鳙(Hypophthalmichthys nobilis)蛋白酶解改性，發(fā)現(xiàn)改性后其溶解度在所有水解度和pH 范圍內(nèi)可達(dá)到84.88%～95.48%，極大提高了鳙蛋白的可應(yīng)用性。Hemker 等[9]對(duì)尼羅羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)副產(chǎn)物分離蛋白進(jìn)行壓力輔助酶解改性，顯著改善了酶解產(chǎn)物的溶解性、乳化性和抗氧化活性。Yathisha 等[10]使用堿性蛋白酶酶解沙帶魚(yú)(Lepturacanthus savala)蛋白，發(fā)現(xiàn)酶解能夠顯著影響蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而提高酶解產(chǎn)物的溶解性、持油力、ACE-Ⅰ抑制和DPPH 自由基清除活性。藍(lán)圓鲹(Decapterus maruadsi)又稱巴浪魚(yú)，是我國(guó)重要的低值海洋經(jīng)濟(jì)魚(yú)類之一。2022 年藍(lán)圓鲹全國(guó)捕撈總量達(dá)39.5 萬(wàn)t，其中福建省捕撈量19.0 萬(wàn)t，居全國(guó)首位[11]。前期研究發(fā)現(xiàn)利用酶解可有效提高藍(lán)圓鲹分離蛋白的溶解性、乳化性、起泡性等功能特性，且溶解度隨酶解程度的增加而增加[12]。

本實(shí)驗(yàn)以藍(lán)圓鲹分離蛋白為對(duì)象，以可溶性蛋白回收率(氮溶指數(shù))為酶解改性的評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝參數(shù)，將得到的酶解產(chǎn)物按不同添加量添加于大米淀粉中，以研究酶解產(chǎn)物對(duì)大米淀粉短期老化行為的影響，旨在為水產(chǎn)蛋白在食品配料蛋白中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冰鮮藍(lán)圓鲹(每條約重150 g)購(gòu)于廈門市高崎水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)。大米淀粉購(gòu)于無(wú)錫金農(nóng)生物科技有限公司。木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶，廣西南寧龐博生物工程有限公司?？捡R斯亮藍(lán)R-250，興隆達(dá)公司。色譜級(jí)甲醇、乙腈，美國(guó)Fisher Chemical 公司；標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白(BSA)，美國(guó)Sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti J-26S XP 大型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman 公司。759 s 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司。GF-1260 高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent 公司。Mini-PROTEAN 蛋白質(zhì)電泳裝置，美國(guó)Bio-Rad 公司。Alpha 1-4 LDplus 冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Christ 公司。Phenom Pro 臺(tái)式掃描電子顯微鏡，荷蘭Phenom-World Pr 公司。DHR-2流變儀、Q2000 差示掃描量熱儀，美國(guó)TA 儀器公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

提取藍(lán)圓鲹分離蛋白 參考孫樂(lè)常等[8]的方法，采用堿溶解-等電點(diǎn)沉淀法制備藍(lán)圓鲹分離蛋白。所有操作均在4 ℃進(jìn)行。取藍(lán)圓鲹背部肌肉，加入8 倍體積冰水組織搗碎，調(diào)節(jié)pH 至11.0，攪拌后離心回收上清液，繼續(xù)調(diào)節(jié)pH 至5.5，離心回收沉淀。得到的沉淀加入一定量NaHCO3調(diào)節(jié)pH 至中性，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)過(guò)程中操作人員嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理規(guī)范，并按照集美大學(xué)科技倫理委員會(huì)制定的規(guī)章制度執(zhí)行。

藍(lán)圓鲹分離蛋白酶解物的制備 將藍(lán)圓鲹分離蛋白與一定體積超純水混合并均質(zhì)，蛋白懸濁液在酶解溫度下預(yù)熱20 min，在不同酶解條件下進(jìn)行反應(yīng)。酶解結(jié)束后沸水加熱10 min 滅酶，離心回收藍(lán)圓鲹分離蛋白酶解上清液(BPIH)，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

氮溶指數(shù)(NSI)的測(cè)定 參考Sukkhown等[13]的方法，并做一定修改，具體：取100 μL 分離蛋白懸濁液，加入2 倍體積蛋白溶解液[20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，含8 mol/L 尿 素，2%SDS] ，完全溶解后得到總蛋白樣品。將酶解上清液和總蛋白樣品稀釋一定倍數(shù)后，參考Lowry 等[14]的方法測(cè)定蛋白含量，以牛血清蛋白(BSA)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。NSI (%)計(jì)算公式：

式中，m1為酶解上清液樣品的蛋白含量(mg/mL)；m2為酶解前樣品的總蛋白含量(mg/mL)。

水解度的測(cè)定 響應(yīng)面優(yōu)化后酶解產(chǎn)物的水解度(DH，%)參考Nielsen 等[15]的OPA 法進(jìn)行測(cè)定，并略作修改。以0.1 mg/mLL-絲氨酸溶液為標(biāo)準(zhǔn)品，取400 μL 待測(cè)樣品與3 mL OPA 試劑混勻，室溫下避光反應(yīng)2 min 后測(cè)量其在340 nm下的吸光度，以去離子水為空白對(duì)照。

式中，Asample、Astandard和Ablank分別表示酶解上清液樣品、標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品和空白對(duì)照在340 nm 的吸光值；V表示樣品體積(L)；N表示稀釋倍數(shù)；X表示樣品質(zhì)量(g)；P表示樣品中所含蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；β查表得0.40；α查表得1.00；h表示每克蛋白質(zhì)中斷裂的肽鍵數(shù)(mmol/g)；htot表示原料總肽鍵數(shù)，查表得8.6 mmol/g。

篩選最適用酶 本實(shí)驗(yàn)共選用4 種蛋白酶(木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶)，以酪蛋白為底物測(cè)定蛋白酶活性。此步驟固定酶解反應(yīng)條件為酶底比5 000∶1 (U/g)、反應(yīng)時(shí)間4 h、料液比1∶4，酶解溫度和pH 均控制為蛋白酶最適條件(表1)。以酶解上清液氮溶指數(shù)評(píng)價(jià)不同酶的酶解效果，篩選出最合適的酶進(jìn)行酶解工藝優(yōu)化。

表1 4 種蛋白酶的活性及最適酶解條件Tab. 1 Enzymatic activities of the four proteases and their optimal hydrolysis conditions

單因素試驗(yàn) 設(shè)置試驗(yàn)初始酶解條件為酶底比5 000∶1 (U/g)、料液比1∶4、酶解溫度50 ℃、酶解pH 6.0、酶解時(shí)間4 h。依次以酶底比(1 000∶1、3 000∶1、5 000∶1、7 000∶1、9 000∶1、11 000∶1 U/g)、料液比(1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6)、酶 解 溫 度(35、40、45、50、55、60、65 ℃)、酶解pH (5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)和酶解時(shí)間(1、2、3、4、5、6 h)為單一變量，考察不同條件對(duì)酶解物NSI 值的影響。

響應(yīng)面法優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇料液比(A)、酶解溫度(B)和酶解pH (C)為響應(yīng)因素，酶解物NSI 值(Y)為響應(yīng)值，以Box-Benhnken 設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素和水平見(jiàn)表2。運(yùn)用Design Expert 12 軟件擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，分析回歸方程從而預(yù)測(cè)最優(yōu)工藝參數(shù)。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)表Tab. 2 Response surface experiment factor and levels

酶解物分子質(zhì)量分析 采用高效凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布，參考Wu等[16]的方法，并作適當(dāng)修改。使用TSK gel G2000 SWXL (φ7.8 mm×300 mm)色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，流速設(shè)定為0.5 mL/min，柱溫為25 ℃，上樣量10 μL。結(jié)果利用GPC offline 軟件進(jìn)行分析，計(jì)算得到酶解物不同分子質(zhì)量分布比例。

Tricine-SDS-PAGE 參考Sch?gger[17]的方法進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE 分析。將未酶解和酶解后樣品的蛋白含量稀釋至1 mg/mL，經(jīng)SDS 化后上樣進(jìn)行電泳。

酶解物冷凍干燥 以響應(yīng)面法優(yōu)化條件酶解藍(lán)圓鲹分離蛋白，離心后回收酶解上清液。上清液預(yù)凍后真空冷凍干燥48 h，粉末樣品于低溫干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

淀粉糊凝沉性測(cè)定 參照趙小梅等[18]的方法并做適當(dāng)修改，取0.3 g 大米淀粉(RS)懸浮在30 mL 超純水中，而后將3%、6%和9%的BPIH(以淀粉干基計(jì)，質(zhì)量分?jǐn)?shù))添加至淀粉懸濁液中，沸水加熱20 min 糊化。將淀粉糊轉(zhuǎn)移至40 mL 黑蓋玻璃瓶中，30 ℃下靜置，每隔1 h 記錄上層清液高度(H1)和淀粉糊總高度(H0)，共記錄8 h。用上清液的體積分?jǐn)?shù)隨時(shí)間的變化來(lái)繪制曲線，從而表示淀粉糊的凝沉性，公式：

式中，H1為每小時(shí)上清液高度(cm)；H0為黑蓋玻璃瓶中淀粉糊總高度(cm)。

淀粉糊動(dòng)態(tài)黏彈性測(cè)定 參考Niu 等[5]的方法并做改進(jìn)，使用40 mm 平行鋁板進(jìn)行掃描，間隙為1.0 mm。制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的RS 懸濁液，分別加入淀粉干基重量的3%、6%和9%BPIH，漩渦振蕩5 min 后，立即轉(zhuǎn)移至流變儀帕爾貼板，樣品邊緣用硅油液封以防止水分蒸發(fā)。測(cè)量開(kāi)始前，設(shè)置帕爾貼板溫度為95 ℃，加熱20 min 使淀粉懸濁液充分糊化，之后立即將溫度降至4 ℃。在4 ℃條件下，將儲(chǔ)能模量(G′)、損耗模量(G″)和損耗角正切(tanδ)作為時(shí)間的函數(shù)記錄3 h。恒定應(yīng)變和恒定頻率分別設(shè)置為5%和1 Hz (線性黏彈區(qū)范圍)。

熱力學(xué)性質(zhì)測(cè)定 利用差示掃描量熱儀(DSC)，在超高純氮?dú)猸h(huán)境下分析RS 和RS-BPIH的熱轉(zhuǎn)變溫度進(jìn)行掃描。參考Niu 等[5]的方法，具體操作：稱取3 mg RS 于鋁坩堝中，加入不同濃度BPIH 溶液6 μL，使BPIHs 終濃度為3%、6%和9% (淀粉干基，質(zhì)量分?jǐn)?shù))。所有鋁坩堝在室溫下密封12 h 以充分水合。在30～90 ℃，以10 ℃/min的恒定加熱速率進(jìn)行熱掃描，執(zhí)行糊化過(guò)程，記錄熱轉(zhuǎn)變溫度(T0、Tp、Tc)和糊化焓(ΔHg)。糊化后的樣品在4 ℃下儲(chǔ)存5 h，以加速淀粉老化。然后，10 ℃/min 的恒定速率從30～90 °C 再次掃描老化樣品，記錄熱轉(zhuǎn)變溫度和老化焓(ΔHr)。

老化淀粉的SEM (scanning electron microscope)分析 參考董慧娜等[19]的方法并作適當(dāng)修改。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%的RS 懸濁液，分別加入淀粉干基重量的3%、6%和9% BPIH，糊化后于4 ℃放置10 h，然后取出進(jìn)行真空冷凍干燥。取凍干的老化淀粉樣品，真空條件下噴金75 s 后，于電鏡中放大1 000 倍觀察微觀結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)采用Design-Expert 12 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析，采用Excel 和Origin 2021 軟件繪圖，采用SPSS 17.0 軟件的Duncan 氏檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析(P＜0.05 為顯著差異)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果

2.1 最適用酶的篩選

經(jīng)風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解后，其產(chǎn)物NSI 值分別為51.50%±0.81%、66.71%±1.20%、65.11%±0.68%和69.37%±0.36%，其中木瓜蛋白酶為最高值，堿性蛋白酶和中性蛋白酶次之，風(fēng)味蛋白酶最低 (圖1-a)。與未酶解的對(duì)照組相比，酶解4 h 后，木瓜蛋白酶酶解的蛋白剩余量最少(圖1-b)，表明酶解最充分，與圖1-a 結(jié)果一致。綜合以上結(jié)果，選擇木瓜蛋白酶進(jìn)行后續(xù)的工藝優(yōu)化。

圖1 不同酶酶解的NSI (a)與酶解樣品(b)1. 對(duì)照組，2. 風(fēng)味蛋白酶，3. 堿性蛋白酶，4. 中性蛋白酶，5. 木瓜蛋白酶。不同字母表示差異顯著(P＜0.05)，NSI. 氮溶指數(shù)，下同。Fig. 1 The NSI (a) and enzymolysis samples (b) hydrolysed by different proteases 1. control group, 2. flavourzyme, 3. alcalase, 4. neutral protease, 5. papain. Different letters indicate significant differences (P＜0.05), NSI. nitrogen solution index; the same below.

2.2 單因素試驗(yàn)

對(duì)酶底比、料液比、溫度、酶解時(shí)間和pH進(jìn)行單因素試驗(yàn)。如圖2-a 所示，NSI 值隨著加酶量的增加而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但在酶底比為5 000∶1 (U/g)之后，NSI 值則基本保持穩(wěn)定。為了控制成本，酶底比選擇5 000∶1 (U/g)。

圖2 不同因素對(duì)NSI 的影響(a) 酶底比，1. 1 000∶1，2. 3 000∶1，3. 5 000∶1，4. 7 000∶1，5. 9 000∶1；(b) 料液比；(c) 酶解溫度；(d) 酶解pH；(e) 酶解時(shí)間。不同字母表示差異顯著(P＜0.05)。Fig. 2 Influence of different factors on NSI(a) enzyme substrate ratio, 1. 1 000∶1, 2. 3 000∶1, 3. 5 000∶1, 4. 7 000∶1, 5. 9 000∶1; (b) solid-liquid ratio, (c) enzymolysis temperature, (d)enzymolysis pH, (e) enzymolysis time. Different letters indicate significant differences (P＜0.05).

隨著料液比的增加，NSI 值緩慢增加并趨于平緩(圖2-b)。在料液比1∶4 時(shí)達(dá)到NSI 值拐點(diǎn)，考慮到經(jīng)濟(jì)成本，確定料液比為1∶4。

酶解溫度對(duì)NSI 值的影響如圖2-c 所示，NSI 值隨溫度的增加而先增加后略微降低，在50 ℃時(shí)達(dá)到最大值71.57%。因此，確定最佳酶解溫度為50 ℃。

pH 6.0 時(shí)酶解產(chǎn)物的NSI 值達(dá)到最大值72.04% (圖2-d)，顯著高于其他條件(P＜0.05)，所以選擇pH 6.0 為最適酶解pH。

酶解時(shí)間結(jié)果顯示，NSI 值隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加并趨于平穩(wěn)，在3 h 時(shí)達(dá)到最大值70.97%，所以選擇最佳酶解時(shí)間為3 h (圖2-e)。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 響應(yīng)面試驗(yàn)遵循Box-Benhnken 設(shè)計(jì)原則，在酶底比為5 000∶1 (U/g)、酶解時(shí)間3 h 的條件下，考察料液比(A)、溫度(B)和pH (C)對(duì)藍(lán)圓鲹分離蛋白酶解物NSI (Y)的影響，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3 所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab. 3 Response surface experimental design and results

回歸模型擬合 運(yùn)用Design Expert 12 軟件對(duì)表3 結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，建立NSI (Y)對(duì)料液比(A)、酶解溫度(B)、酶解pH (C)和酶解時(shí)間(D)的多元二次回歸方程：

方差分析 回歸模型方差分析如表4 所示，模型F值為136.51，F(xiàn)值由于噪聲而引起的可能性僅為0.01%，回歸模型P＜0.000 1，二者表明該模型是顯著的。模型失擬項(xiàng)F值為1.64，意味著樣本之間的變化相對(duì)于純誤差并不顯著；失擬項(xiàng)P=0.315 2＞0.05 為不顯著，對(duì)模型是有利的。R2接近1 時(shí)，模型可以更好地?cái)M合實(shí)際實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。本研究模型決定系數(shù)R2為0.994 3，這表明99.43%的行為變化可由擬合模型解釋，擬合度較高。預(yù)測(cè)R2=0.946 1 與調(diào)整R2=0.987 1 差異小于0.2，二者合理一致。信噪比為34.01，大于臨界值4.0，表明信號(hào)充足，模型合理、可用。

表4 響應(yīng)面模型方差分析Tab. 4 Response surface model analysis of variance

自變量影響顯著性 根據(jù)表4 可知，A、B、C 對(duì)NSI 值有極顯著影響(P＜0.01)，且由F值可以確定，三個(gè)因素對(duì)模型的影響顯著性順序?yàn)闇囟?B)＞ pH (C)＞料液比(A)。交互項(xiàng)中，僅有溫度/pH (BC)交互作用極顯著(P＜0.01)，其余均無(wú)顯著影響(P＞0.05)。

因素交互作用分析 圖3 為根據(jù)上述的多元二次回歸方程及模型方差分析得到的擬合模型響應(yīng)曲面圖和等高線圖，其形狀可反映交互作用的強(qiáng)弱，橢圓表示交互作用顯著，圓形則表示不顯著[20]。由圖可知，溫度和pH 的交互作用對(duì)NSI 有顯著影響，而料液比與溫度、料液比與pH的交互作用對(duì)NSI 值的影響不顯著，與表4 結(jié)果一致。

圖3 料液比、溫度和pH 交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig. 3 Response surface and contour lines of the interactions between solid-liquid ratio, temperature and pH

響應(yīng)面優(yōu)化工藝參數(shù)及驗(yàn)證 由回歸模型預(yù)測(cè)的藍(lán)圓鲹分離蛋白最優(yōu)酶解工藝參數(shù)為料液比1.00∶3.81、酶解溫度46.36 ℃、酶解pH 6.30，模型得到的NSI 預(yù)測(cè)值為86.37%?？紤]到實(shí)際操作的可實(shí)施性，在酶底比為5 000∶1(U/g)、酶解時(shí)間3 h、料液比1.00∶3.80、酶解溫度46.40 ℃、酶解pH 6.30 條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，通過(guò)3 組平行試驗(yàn)，得到BPIH 的NSI 平均值為85.41%±0.82%，與預(yù)測(cè)值接近，表明擬合模型可靠。在此酶解條件下得到的BPIH 水解度為21.62%。

2.4 分子質(zhì)量分析

利用高效液相色譜法和Tricine-SDS-PAGE 分析BPIH 的分子質(zhì)量分布，由圖4-a 可見(jiàn)，BPIH的出峰時(shí)間主要集中在14～30 min。BPIH 為分子質(zhì)量小于3 000 u 的短肽，其中小于1 000 u 的肽占79.94%，小于500 u 的肽占56.44% (表5)，說(shuō)明在響應(yīng)面優(yōu)化的酶解條件下，藍(lán)圓鲹分離蛋白被充分酶解為小分子的低聚寡肽，這與圖4-b 的Tricine-SDS-PAGE 的結(jié)果一致。

圖4 BPIH 分子質(zhì)量分析(a) BPIH 的高效液相色譜圖；(b) 藍(lán)圓鲹分離蛋白及BPIH 的Tricine-SDS-PAGE 分析，M.標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，1.未酶解，2.酶解后。Fig. 4 Molecular weight analysis of BPIH(a) HPLC of BPIH; (b) Tricine-SDS-PAGE analysis of the blue round scad protein isolate and BPIH, M. standard protein Marker, 1. unenzymatic digestion, 2. after enzymatic digestion.

表5 BPIH 分子質(zhì)量分布比例Tab. 5 Molecular weight distribution ratio of BPIH

2.5 淀粉糊凝沉性

淀粉糊隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸凝沉，在2～5 h 時(shí)凝沉速率較快，5 h 后逐漸趨于平穩(wěn)，在凝沉8 h 后，所有樣品上清液體積比均達(dá)到50%以上(圖5)。RS-BPIH 樣品上清液體積分?jǐn)?shù)在所有時(shí)間下均低于RS 樣品，并且隨著B(niǎo)PIH 濃度的增加，上清液體積分?jǐn)?shù)逐漸降低。

圖5 不同濃度BPIH 對(duì)大米淀粉糊凝沉性的影響(a) 淀粉糊凝沉性隨時(shí)間的變化；(b) 淀粉糊靜置0 h 和8 h 的凝沉情況，1～4 依次表示RS、RS-3% BPIH、RS-6% BPIH、RS-9% BPIH。Fig. 5 Effects of different concentrations of BPIH on the retrogradation of rice starch paste(a) changes in the retrogradation of starch pastes over time; (b) retrogradation of starch paste after standing for 0 h and 8 h, 1-4 indicates RS, RS-3%BPIH, RS-6% BPIH, RS-9% BPIH, respectively.

2.6 淀粉糊動(dòng)態(tài)黏彈性測(cè)定

淀粉糊化后立即降溫至4 ℃進(jìn)行動(dòng)態(tài)時(shí)間掃描，以分析淀粉糊在3 h 短期老化過(guò)程中的黏彈性變化。RS 的G′在3 h 內(nèi)持續(xù)增長(zhǎng)，其中最初1 h 內(nèi)快速上升，而后增速逐漸減慢并趨于平穩(wěn)(圖6-a)。與RS 相比，RS-BPIH 的G′增長(zhǎng)趨勢(shì)與RS 相似，但均小于RS，且初始G′隨著B(niǎo)PIH 添加量的增加而逐漸降低，G′的增長(zhǎng)斜率逐漸變得平緩。RS 和RS-BPIH 的tanδ＜1，隨時(shí)間的增加而降低后逐步趨于平穩(wěn)(圖6-b)，說(shuō)明G′＞G″，樣品彈性占主導(dǎo)[21]。另外，RS-BPIH 的tanδ 值高于RS，并且隨著B(niǎo)PIHs 添加量的增加而增加，說(shuō)明RSBPIH 中的彈性組分較RS 更少，與G′的變化規(guī)律一致。

圖6 不同濃度BPIH 對(duì)老化淀粉G′(a)和tanδ(b)的影響Fig. 6 Effects of different concentrations of BPIH on G′ (a) and tanδ (b) of retrograded starch

2.7 DSC 分析

所有樣品在70～80 ℃均可觀察到明顯的吸熱峰，隨著B(niǎo)PIH 濃度的增加，峰值溫度(Tp)逐漸升高，糊化焓值(ΔHg)逐漸降低(圖7-a)。在加入9% BPIH 時(shí)，峰值溫度從RS 的(69.99±0.26) ℃提高到(74.43±0.39) ℃，而糊化焓從(4.05±0.05) J/g降低至(3.11±0.11) J/g (表6)。

圖7 不同濃度BPIH 對(duì)糊化淀粉(a)和老化淀粉(b)熱分析圖譜的影響Fig. 7 Effects of different concentrations of BPIH on the thermal analysis patterns of gelatinized starch (a) and retrograded starch (b)

表6 不同濃度BPIH 對(duì)糊化淀粉和老化淀粉轉(zhuǎn)變溫度和轉(zhuǎn)化焓的影響Tab. 6 Effects of different concentrations of BPIH on the transformation temperature and enthalpy of gelatinized starch and retrograded starch

將糊化后的淀粉樣品在4 ℃下保存5 h 后，再次執(zhí)行DSC 升溫程序，與糊化過(guò)程的趨勢(shì)不同，老化淀粉中只觀察到一個(gè)輕微的吸熱峰(圖7-b)。對(duì)照組RS 吸熱峰出現(xiàn)在37.73～67.30 ℃，峰值溫度為(57.15±0.27) ℃，老化焓為(1.16±0.08) J/g (表6)。添加BPIH 后顯著增加了老化RS 的T0，降低了Tp、Tc和老化焓(P＜0.05)。

2.8 老化淀粉SEM 分析

圖版為掃描電鏡觀察的RS 與RS-BPIH 經(jīng)4 ℃10 h 短期老化的微觀結(jié)構(gòu)。老化的RS 與RSBPIH 具有清晰的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)(圖版)。其中對(duì)照組RS 孔洞細(xì)小，明顯形成了更加致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)，出現(xiàn)老化的典型狀態(tài)(圖版-1)；而加入BPIH后，凝膠網(wǎng)絡(luò)的孔隙隨著B(niǎo)PIHs 添加量的增加而增加(圖版-2～4)。

圖版 大米淀粉-藍(lán)圓鲹分離蛋白酶解粉復(fù)合物短期老化掃描電鏡圖1～4 依次表示短期老化的RS、RS-3% BPIH、RS-6% BPIH、RS-9% BPIH。Plate Image of short-term retrogradation of RS and RS-BPIH 1-4 in order indicates RS, RS-3% BPIH, RS-6% BPIH, RS-9% BPIH for short-term retrogradation.

3 討論

3.1 篩選最適用酶

NSI 是通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)在溶液中的含量來(lái)評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)溶解度的方法，在酶解反應(yīng)中具有與水解度相同的變化趨勢(shì)[13]。經(jīng)過(guò)4 種不同蛋白酶酶解后，產(chǎn)物NSI 值出現(xiàn)顯著差異(P＜0.05)，說(shuō)明不同酶對(duì)藍(lán)圓鲹分離蛋白酶解效果不同。高NSI的蛋白質(zhì)或肽顯示出良好的溶解性，因此木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物具有相對(duì)更好的溶解性，即為4 種蛋白酶中最適合酶解藍(lán)圓鲹分離蛋白的一種[13]。

不同蛋白酶酶解效果的差異可能歸因于蛋白底物的氨基酸組成和不同蛋白酶酶切位點(diǎn)的差異[22]。風(fēng)味蛋白酶是一種來(lái)自米曲霉發(fā)酵的內(nèi)切蛋白酶和外肽酶混合物，主要從多肽鏈末端切割氨基酸，酶解可用的-NH2端數(shù)量有限，所以可能造成酶解速率相對(duì)緩慢[23]。堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶均屬于內(nèi)切酶，具有廣泛的催化活性，其中堿性蛋白酶對(duì)羧基端為芳香族或強(qiáng)疏水性氨基酸殘基的肽鍵有著更高的水解優(yōu)先性，而木瓜蛋白酶的酶解位點(diǎn)主要為賴氨酸、精氨酸和甘氨酸的-COOH 端[24-25]。孫樂(lè)常等[7]通過(guò)比較不同方法制備的藍(lán)圓鲹分離蛋白的性質(zhì)差異，并對(duì)分離蛋白氨基酸組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)堿溶解-等電點(diǎn)沉淀法提取的分離蛋白中賴氨酸、精氨酸和甘氨酸具有較高含量，因此相比之下，木瓜蛋白酶更適合酶解藍(lán)圓鲹分離蛋白，故選擇其進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化。

3.2 單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)中，木瓜蛋白酶添加量和料液比是工藝成本的可控因素。加酶量較小時(shí)，蛋白底物相對(duì)過(guò)量，隨著加酶量增加，更多底物被酶解為可溶性短肽，NSI 值隨之增加。當(dāng)繼續(xù)提高加酶量，底物中可酶解位點(diǎn)便趨于飽和，NSI 值增速降低[26]。由圖2-a 可知，本實(shí)驗(yàn)?zāi)竟系鞍酌缸钸m酶底比為5 000∶1 (U/g)。料液比方面，當(dāng)料液比較低時(shí)，體系中蛋白底物濃度過(guò)高，較少的液體含量限制了酶與蛋白質(zhì)的相互作用，導(dǎo)致酶解不充分[27]。隨著水量增加，反應(yīng)體系流動(dòng)性提高，但水量的持續(xù)增加并不會(huì)對(duì)NSI 值帶來(lái)持續(xù)的積極影響。因此，為了節(jié)約成本，選擇最佳料液比為1∶4 (圖2-b)。酶解溫度過(guò)低及過(guò)高均會(huì)影響蛋白酶的作用效果，當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)，木瓜蛋白酶達(dá)到最適作用溫度(圖2-c)。pH 變化可能會(huì)導(dǎo)致蛋白酶空間構(gòu)象的變化，從而降低酶活性，并影響酶與底物的結(jié)合狀態(tài)，因此過(guò)酸或過(guò)堿的條件均不利于酶解反應(yīng)進(jìn)行[28]。本實(shí)驗(yàn)中選擇pH 6.0 為木瓜蛋白酶的最適pH (圖2-d)。當(dāng)酶解反應(yīng)時(shí)間為1～3 h 時(shí)，反應(yīng)速率與時(shí)間正相關(guān)，NSI 值隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加；之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，NSI 值增勢(shì)漸近穩(wěn)定，3～6 h 內(nèi)無(wú)顯著增加(P＞0.05)，所以酶解時(shí)間選擇3 h (圖2-e)。

考慮到實(shí)際應(yīng)用中的經(jīng)濟(jì)成本，本研究固定酶底比為5 000∶1 (U/g)，酶解時(shí)間3 h，使用Design Expert 12 軟件分析料液比、溫度和pH 的因素交互作用。軟件擬合的回歸模型P＜0.000 1，表明該模型顯著；失擬項(xiàng)P=0.315 2＞0.05 為不顯著，可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析[29]。分別將回歸模型料液比(A)、溫度(B)、pH (C)因素中的一個(gè)固定在0 水平，可以得到另外兩個(gè)因素的交互作用對(duì)模型的影響關(guān)系[26]。由響應(yīng)曲面圖和等高線圖可見(jiàn)，將料液比固定于1∶4 的條件下，溫度取任意水平時(shí)，NSI 值隨著pH 的升高而逐漸增大。當(dāng)pH 不變時(shí)，NSI 值隨著溫度的降低而增加，二者交互作用顯著(圖3)。料液比與溫度、料液比與pH 的交互作用對(duì)NSI值的影響不顯著，與表4 結(jié)果一致。響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)的最優(yōu)工藝參數(shù)為料液比1.00∶3.81、酶解溫度46.36 ℃、酶解pH 6.30，在該條件下得到的BPIH 實(shí)際NSI 值為85.41%±0.82%，與預(yù)測(cè)值接近。

3.3 BPIH 的抗淀粉老化特性

在以上結(jié)果的基礎(chǔ)上，將冷凍干燥后的BPIH與大米淀粉按不同比例混合，考察其對(duì)大米淀粉短期老化的影響。淀粉老化是指經(jīng)過(guò)糊化的淀粉在室溫或低于室溫放置后，出現(xiàn)的不透明甚至凝結(jié)而沉淀的現(xiàn)象[30]。這是由于直鏈淀粉分子間依靠氫鍵作用形成較大的顆?；蚴鵂罱Y(jié)構(gòu)，當(dāng)體積增大到一定程度時(shí)，就形成了沉降[18]。這種淀粉分子鏈間的相互吸引與排列，重新聚集成致密、高度結(jié)晶化、不溶性的淀粉分子微晶束的過(guò)程，即為淀粉的老化過(guò)程[17,31-35]。加入BPIH 能明顯減少糊化RS 上清液析出(圖5)，凝沉性減弱，表明淀粉穩(wěn)定性有所提高，即添加BPIH 可以有效抑制淀粉的老化現(xiàn)象[31]。

動(dòng)態(tài)黏彈性測(cè)定中，儲(chǔ)能模量(G′)代表糊化淀粉分子網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的彈性特性，是監(jiān)測(cè)淀粉老化進(jìn)程的重要指標(biāo)[33]。損耗模量(G″)表示淀粉糊老化過(guò)程中的黏性行為變化。損耗因子(tanδ)為G″與G′的比值，表示物質(zhì)變形所損失能量的比例，是反映樣品黏彈性行為的重要指標(biāo)[21]。RS 與RSBPIH 在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)G′持續(xù)上升(圖6-a)，tanδ均小于1 且大幅降低(圖6-b)，表明所有樣品均發(fā)生了淀粉老化。Niu 等[5]在研究豬血漿蛋白水解物時(shí)也得出了相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這一現(xiàn)象與直鏈淀粉的聚集密切相關(guān)。在淀粉老化的初期，主要發(fā)生的是和直鏈淀粉有關(guān)的短期老化，由直鏈淀粉的快速重結(jié)晶引發(fā)一系列重排，聚集在一起的分子形成了能讓淀粉凝膠彈性更強(qiáng)的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[4-5,19]。Dun 等[34]還提出，G′隨時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)增加，表明交聯(lián)直鏈淀粉網(wǎng)絡(luò)的形成是冷卻后淀粉老化的典型特征。加入BPIH 后，大米淀粉的初始G′隨著B(niǎo)PIH 添加量增加而逐漸降低，G′增長(zhǎng)斜率也逐漸變得平緩(圖6-a)；tanδ隨著B(niǎo)PIHs 添加量的增加而增加(圖6-b)。這些結(jié)果表明，添加BPIH 抑制了直鏈淀粉的重結(jié)晶，延緩了直鏈淀粉凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，證明BPIH 具有抑制大米淀粉短期老化的作用，且該作用存在劑量相關(guān)性[5]。

DSC 分析中，加入BPIH 改變了RS 的糊化性質(zhì)，糊化峰值溫度(Tp)升高，焓值(ΔHg)降低(圖7-a)。這一現(xiàn)象可能是淀粉的不完全糊化所導(dǎo)致。淀粉的水分含量對(duì)其糊化過(guò)程有重要影響，含水量越多，淀粉越易糊化[35]。藍(lán)圓鲹分離蛋白經(jīng)充分酶解后，蛋白分子鏈斷裂、伸展，被掩埋的親水側(cè)鏈得以暴露。當(dāng)把酶解產(chǎn)物加入淀粉中時(shí)，這些親水側(cè)鏈與淀粉競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合水分，減少了淀粉的糊化水量，限制了淀粉與水的相互作用，從而導(dǎo)致淀粉的不完全糊化，因此吸熱峰值溫度向更高溫度方向移動(dòng)[5,35-36]。淀粉的不完全糊化改變了微晶與非晶態(tài)基體之間的作用力，熔化需要較低的熱能[5]，所以加入BPIH 后糊化焓顯著降低(P＜0.05)。將經(jīng)過(guò)糊化的淀粉樣品在4 ℃下短期老化5 h，再次進(jìn)行DSC 分析，發(fā)現(xiàn)添加BPIH 后增加了老化RS 的T0，降低了Tp、Tc和老化焓(ΔHr) (圖7-b)。淀粉老化形成重結(jié)晶，此時(shí)須外加能量，才能熔化淀粉分子微晶，因此老化后的淀粉在DSC 中會(huì)出現(xiàn)吸熱峰，且淀粉老化程度越大，吸熱峰越大，熔融焓也越高[32,37]。因此Tp和ΔHr 的降低表明BPIH 抑制了RS 在4 ℃儲(chǔ)存期間微晶結(jié)構(gòu)的形成，阻礙RS 的短期老化行為，且BPIH 濃度越高，抑制作用越明顯。BPIH 能夠抑制RS 短期老化可能是由于其具有活性多羥基，它們可能與直鏈淀粉形成氫鍵，從而阻斷了淀粉分子間及與水分子間的氫鍵作用，抑制重結(jié)晶[6,32]。此外，ΔHr 的降低還可能歸因于RS 不完全糊化，導(dǎo)致淀粉鏈的流動(dòng)性受限[5]。淀粉老化過(guò)程需要水分參與，水分不僅為淀粉老化提供液體環(huán)境，而且參與淀粉分子重結(jié)晶[37]。添加BPIH 會(huì)與RS競(jìng)爭(zhēng)吸附水分[35]，降低淀粉鏈的流動(dòng)性，從而阻礙RS 的短期老化。

使用SEM 觀察淀粉短期老化后的微觀結(jié)構(gòu)，淀粉凝膠網(wǎng)絡(luò)的孔隙隨著B(niǎo)PIH 添加量的增加而增加(圖版)。淀粉老化后吸水能力下降，水分析出散失[32]。孔洞的形成是冷凍干燥過(guò)程將水分凍結(jié)為冰晶升華所致，因此凍干前淀粉樣品持水能力越強(qiáng)，則凍干后樣品孔洞越多[19]。加入BPIH后凝膠網(wǎng)絡(luò)孔隙增加，說(shuō)明BPIH 提升了糊化淀粉保留內(nèi)部水分的能力，同時(shí)BPIH 還可能限制了淀粉分子間的聚集，抑制了凝膠網(wǎng)絡(luò)形成，一定程度上延緩了大米淀粉的短期老化。

綜上所述，利用響應(yīng)面法優(yōu)化木瓜蛋白酶酶解藍(lán)圓鲹分離蛋白的工藝參數(shù)，制備得到的BPIH 具有抗淀粉老化特性，能夠顯著抑制或延緩RS 的短期老化，且該作用存在劑量正相關(guān)性。這可能是由于BPIH 抑制了淀粉分子內(nèi)和分子間氫鍵的形成，限制淀粉分子聚集，阻礙了直鏈淀粉的重結(jié)晶。因此，藍(lán)圓鲹分離蛋白酶解物與大米淀粉的復(fù)配組合，既豐富了大米淀粉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，又使其具備了抗淀粉老化能力。本研究可為藍(lán)圓鲹分離蛋白酶解物作為食品蛋白配料提供理論參考。

（作者聲明本文無(wú)實(shí)際或潛在的利益沖突）