孫秀秀　王春梅　陳加利　夏騰飛　馮依欣　鄭道君

摘要 ［目的］分析DNA、引物，dNTPs、Taq DNA聚合酶4種因素對雷公筍SCoT-PCR擴增結(jié)果的影響，通過最優(yōu)的SCoT-PCR反應(yīng)體系篩選多態(tài)性引物，為雷公筍種質(zhì)資源分子標記研究提供條件。［方法］以海南雷公筍為材料，采用單因素試驗和正交試驗方法。［結(jié)果］Taq酶對雷公筍SCoT-PCR擴增的影響最大，其次是模板DNA和dNTPs，最后是引物；最優(yōu)反應(yīng)體系為20 μL體系中40 ng DNA，0.30 μmol/L 引物，0.25 mmol/L dNTPs，3.00 U Taq酶。經(jīng)驗證，該體系獲得的擴增產(chǎn)物清晰穩(wěn)定；應(yīng)用該體系從40條SCoT引物篩選出8條多態(tài)性好，且適合雷公筍擴增的引物，多態(tài)性條帶占62.64%。［結(jié)論］該研究為使用SCoT分子標記技術(shù)對雷公筍開展深入研究提供了重要的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞 雷公筍；SCoT；反應(yīng)體系優(yōu)化；有效性引物

中圖分類號 S647文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2024）08-0095-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.08.022

Optimization of SCoT-PCR System and Screening of Effective Primers for Costus speciosus of Hainan

SUN Xiu-xiu1，2，WANG Chun-mei1，2，CHEN Jia-li1，2 et al

（1.Sanya Institute，Hainan Academy of Agricultural Sciences，Sanya，Hainan 572025; 2.The Key Laboratory of Tropic Special Economic Plant Innovation and Utilization/National Germplasm Resource Chengmai Observation and Experiment Station/Institute of Tropical Horticulture Research，Hainan Academy of Agricultural Sciences，Haikou，Hainan 571100）

Abstract ［Objective］In order to analyze the effects of DNA，primers，dNTPs and Taq DNA polymerase on the SCoT-PCR amplification results，the polymorphic primers were selected through the optimal SCoT-PCR reaction system to provide conditions for the study of molecular markers of the Costus speciosus resources.［Method］Unifactor test and orthogonal test methods were used.［Result］Taq had the greatest effect on SCoT-PCR amplification，followed by template DNA and dNTPs，and the last was primer.The optimal reaction system was 40 ng DNA，0.30 μmol/L primer，0.25 mmol/L dNTPs，3.00 U Taq enzyme in the 20 system.The amplification products obtained by this system were clear and stable.8 primers with good polymorphism were selected from 40 SCoT primers，and the polymorphism bands accounted for 62.64%.［Conclusion］This study provided an important theoretical basis and technical support for further study of Costus speciosus with SCoT molecular marker technology.

Key words Costus speciosus;SCoT;Reaction system optimization;Effectiveness primers

雷公筍，學(xué)名閉鞘姜（Costus speciosus），屬于姜科閉鞘姜屬植物，是海南特有的野生草本植物，具有消炎利尿、散瘀消腫和解毒止癢等功效［1-2］。雷公筍還可提取合成甾體激素藥物的重要原料甾體皂苷［3］。此外，雷公筍營養(yǎng)成分種類齊全，含有豐富的膳食纖維、氨基酸和維生素等物質(zhì)［4］，作為海南的常見野菜深受消費者喜愛。雷公筍在海南島各地都有分布，但大多數(shù)為野生資源。近些年，隨著人們對綠色食品的喜愛，市場需求量增加，雷公筍野生資源遭受前所未有的破壞。因此，對海南雷公筍野生資源進行遺傳學(xué)研究，更好地評估和保護雷公筍資源顯得尤為迫切和重要。然而，目前對雷公筍的研究僅限于化學(xué)成分和藥用分析［5-7］，對雷公筍資源的分布與儲量、資源類型、生境等知之甚少。由于分子標記技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的研究人員開始使用分子標記手段對植物的遺傳多樣性進行研究。目標起始密碼子多態(tài)性 （SCoT，start codon targeted polymorphism） 標記［8］是一種新型分子標記技術(shù)，利用基因翻譯起始點（ATG）的側(cè)翼序列的保守性和一致性，設(shè)計引物擴增目的基因，具有引物設(shè)計簡單，試驗操作方便，成本低，多態(tài)性高，遺傳信息豐富等優(yōu)點［9-11］。SCoT分子標記在果樹［10］、蔬菜［12］、花卉［13］和中草藥［14-15］等方面有較強的通用性，但在閉鞘姜屬植物中研究鮮見報道。鑒于此，筆者以海南雷公筍為試材，建立一個最優(yōu)且穩(wěn)定的SCoT-PCR反應(yīng)體系，篩選了合適的SCoT引物，不僅有助于解析雷公筍種質(zhì)資源的遺傳多樣性，還可為其親緣關(guān)系和分子輔助育種等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用試材取自海南省?？诃偵絽^(qū)茂山村，定安縣龍湖鎮(zhèn)云頭村和屯昌縣屯城鎮(zhèn)下坡村雷公筍野生居群，材料編號依次為MS、YT和XP。取健康、干凈葉片用硅膠保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器

試劑：Taq DNA聚合酶、dNTPs、10×Taq Buffer（含Mg2+）均由南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司提供，100 bp DNA Ladder Marker由北京中科瑞泰集團公司提供，SCoT引物由北京諾塞基因組研究中心有限公司合成。儀器：振蕩儀、電熱恒溫水浴鍋、離心機、紫外分光光度計、移液槍、PCR儀、電冰箱、水平電泳儀、Gel Doc XR 型凝膠成像系統(tǒng)等。

1.3 基因組DNA提取

利用FOREGENE試劑盒提取雷公筍的葉片DNA，用0.8%～1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗基因組DNA的質(zhì)量，用紫外分光光度計檢驗DNA的純度和濃度，最后將獲得的基因組DNA樣品加無菌水稀釋到20 ng/μL，存放于-20 ℃冰箱中備用。

1.4 SCoT-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化與建立

1.4.1 單因素試驗設(shè)計。

采用MS基因組DNA作為模板，選用引物SCoT3（CAACAATGGCTACCACCG）｛16｝，初始體系中總體系20 μL：2.0 μL 2×PCR buffer，0.2 μL 1 U Taq DNA聚合酶，0.6 μL 0.3 mmol/L dNTPs ，1.6 μL 0.8 μmol/L 引物和1.0 μL 40 ng DNA，純凈水14.6 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。維持其他3種因素恒定，改變1個因素的濃度進行擴增（表1），篩選后的濃度范圍用作正交試驗。

1.4.2 雷公筍SCoT-PCR反應(yīng)體系的建立。

對模板DNA、引物、dNTPs和Taq 酶進行4因素4水平L16正交試驗，確立最優(yōu)反應(yīng)體系。為了更好地評估擴增結(jié)果，參考何正文等［17-18］的直觀分析法，將條帶數(shù)目豐富且清晰的記為16分，最差的為1分。通過2次獨立計分，計算出2次評分的平均值，并對其進行極差R值分析。

1.5 雷公筍SCoT-PCR有效引物篩選和反應(yīng)體系驗證

以3份地理距離較遠的雷公筍資源的基因組DNA為模板，應(yīng)用最佳SCoT-PCR的反應(yīng)體系，對40對SCoT引物進行復(fù)選，從中篩選能夠擴增3條以上產(chǎn)物的引物，并對其進行多態(tài)性比率（PPB）評價和反應(yīng)體系穩(wěn)定性驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 模板DNA用量對SCoT-PCR擴增效果的影響

在20 μL體系中，其他因素不變，雷公筍DNA用量設(shè)置為10個梯度，即0、5、10、20、40、60、80、100、120、160 ng。通過圖1可見，除DNA的用量為0 ng外，其余用量都可擴增出條帶；隨著DNA用量的增加，條帶清晰度和豐富度逐漸升高后又逐漸下降。DNA用量在10～60 ng時條帶完整，亮度較其他用量時高，且無拖帶現(xiàn)象；DNA用量高于60 ng時擴增條帶的豐富度和清晰度均降低。因此，DNA用量范圍確定在10～60 ng 用于正交試驗。

2.2 引物濃度對SCoT-PCR擴增效果的影響

引物濃度對PCR擴增有重要影響，當引物濃度超過一定范圍時，增加非特異性擴增的概率，從而促進引物二聚體形成；引物濃度過低時，與模版DNA結(jié)合率下降，使擴增產(chǎn)物產(chǎn)率下降。根據(jù)圖1，當引物濃度低于0.10 μmol/L，與DNA 結(jié)合位點變少，導(dǎo)致PCR反應(yīng)不完全，泳道11、12擴增產(chǎn)物條帶少；隨著引物濃度的增加，擴增條帶逐漸增多并清晰，特別是在引物濃度在0.20～0.50 μmol/L時，擴增效果好；當引物濃度高于0.50 μmol/L 時，開始出現(xiàn)條帶不清晰現(xiàn)象。因此，正交試驗應(yīng)選擇引物濃度在0.20～0.50 μmol/L。

2.3 dNTPs濃度對SCoT-PCR擴增效果的影響

dNTPs作為PCR擴增反應(yīng)的原材料之一，如果濃度過低，擴增效率會下降，條帶變?nèi)趸驘o擴增產(chǎn)物［19］；相反，濃度過高時，其會與Taq 酶競爭Mg2+，從而大大降低Mg2+與Taq 酶的結(jié)合效率［17］。如圖2所示，不同濃度含量對擴增結(jié)果有顯著影響，在0.025～0.050 mmol/L，泳道均未出現(xiàn)條帶；0.100～0.200 mmol/L擴增的條帶數(shù)量較少，清晰度較差；而0.250～1.000 mmol/L擴增的條帶最佳。

2.4 Taq酶濃度對SCoT-PCR擴增效果的影響

Taq酶對PCR擴增的主要影響包括條帶的多少和亮度的強弱［20］，Taq酶濃度過低，擴增效率下降，Taq酶濃度過高時，PCR的穩(wěn)定性會下降，易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。由圖2可知，由于Taq酶濃度的增大，擴增條帶的清晰度和多態(tài)性都有所提升。當Taq酶濃度為0.05、0.25 U時，無擴增產(chǎn)物產(chǎn)生；當Taq酶濃度在0.50～0.75 U時，出現(xiàn)擴增條帶但豐富度低；當Taq酶濃度在1.00～3.00 U時，擴增條帶數(shù)量逐漸增加，并且更加清晰可見；當Taq酶濃度高于3.00 U時，擴增產(chǎn)物豐富度降低，且背景噪音較大。因此，選擇Taq酶濃度在1.00～3.00 U用于正交試驗。

2.5 雷公筍SCoT-PCR反應(yīng)體系的建立

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設(shè)計組合的L16 （44） 組合的SCoT-PCR正交試驗（表2）。從圖3可以看出，由于模板DNA、引物、dNTPs和Taq酶的濃度組合不同，擴增效果存在差異。根據(jù)擴增產(chǎn)物對16個組合進行PCR評分（表3）。如圖3所示，組合12擴增出豐富的條帶，有10個條帶，擴增明顯且清晰度高，擴增產(chǎn)物背景低，打分為16分；組合2、13和14的PCR擴增背景噪音低，也可擴增出9條清晰可辨的條帶，打分分別為14、14和15分；其余組合要么條帶缺失，要么擴增產(chǎn)物背景噪音高。因此，組合12為雷公筍SCoT的最佳反應(yīng)組合，即總體系為20 μL，DNA含量為40 ng，引物濃度為0.30 μmol/L，dNTPs濃度為0.25 mmol/L，Taq的含量3.00 U。

極差 （R）可以判斷對反應(yīng)體系的主要影響因素和次要影響因素。R越大，說明該因素對反應(yīng)體系的影響越大，該因素越重要。由表3可知，該研究模板DNA、引物、dNTPs和Taq酶的R值分別為3.25、2.25、3.25和6.25，說明各因素對SCoT-PCR擴增結(jié)果的影響程度為Taq酶>模板DNA=dNTPs>引物。

2.6 雷公筍SCoT-PCR引物篩選及穩(wěn)定性檢驗

利用已建立的SCoT-PCR體系，將雷公筍的MS、YT、XP基因組DNA作為模板，對初步篩選的引物進行復(fù)選。從圖4可以看出，所有引物均能擴增出條帶，擴增結(jié)果穩(wěn)定、清晰，特異性條帶無明顯彌散現(xiàn)象。篩選出8條擴增條帶清晰、多態(tài)性良好的引物。8個引物多態(tài)性比率在40.00% ～ 84.61%（表4），其中SCoT14多態(tài)性最好。結(jié)果表明，在最佳反應(yīng)體系下，3種資源均能擴增出清晰、豐富、穩(wěn)定的條帶。因此，該系統(tǒng)穩(wěn)定可靠，可用于雷公筍資源的SCoT分析。

3 討論

分子標記是繼形態(tài)標記、細胞標記、生物化學(xué)標記之后的遺傳多樣性標記，在基因組水平上直接反映遺傳多態(tài)性［21］。目前應(yīng)用最廣泛的分子標記技術(shù)有擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）、隨機擴增片段長度多態(tài)性（RAPD）、微衛(wèi)星DNA （SSR）等。SCoT作為一種新開發(fā)的分子標記，與其他標記相比，可以獲得與性狀密切相關(guān)的目標基因，具有操作簡單、引物通性強、遺傳信息豐富、性價比高等優(yōu)點［9-10，22］。目前廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)、親緣關(guān)系及遺傳圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域［11，23-25］。SCoT-PCR擴增結(jié)果經(jīng)常受到模版DNA、引物、dNTPs和Taq聚合酶等因素的影響，因此該試驗先用單因素試驗縮小每個因素的適宜濃度范圍，再用正交試驗優(yōu)化反應(yīng)體系。單因素試驗雖然操作簡單，可在單一水平下選出該因素的合適用量［26］，但SCoT-PCR擴增過程并不由單個因素決定，往往是多個因素、多個水平共同作用的結(jié)果，因此正交試驗可滿足該試驗的要求，綜合考察反應(yīng)體系中各因素的交互作用，從而快速獲得最佳組合［27］。該研究利用正交設(shè)計方法對模版DNA、引物、dNTPs和Taq聚合酶等因素進行篩選和優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)對雷公筍SCoT-PCR結(jié)果影響最大的是Taq聚合酶，其次為模板DNA和dNTPs，最小為引物濃度。這與趙瑞強等［28-29］在鐵皮石斛和菊花中的研究結(jié)果一致，但與韓國輝等［30］在藍莓上的研究結(jié)果有差異，對藍莓SCoT-PCR結(jié)果影響最大的因素為dNTPs。這說明不同物種間分子標記體系影響因素不同［31］。因此，在進行SCoT標記時，應(yīng)當對其反應(yīng)體系進行優(yōu)化，以確保其穩(wěn)定性和可靠性。

該研究從40條引物中共篩選出8條具有條帶清晰、多態(tài)性豐富、重復(fù)性好的引物。用篩選出來的引物對雷公筍3個居群（MS、YT和XP）的DNA進行擴增，均能獲得清晰穩(wěn)定、多態(tài)性豐富的擴增結(jié)果。通過對8條引物的擴增，共產(chǎn)生108條帶，平均每條引物擴增13.5條帶，多態(tài)性比率達到62.64%，高于熊發(fā)前等［9］在花生遺傳多樣性分析中的每條引物擴增條帶數(shù)（10.42）和多態(tài)性比率（31.80%），但低于蘇亞春等［32］對甘蔗的遺傳多樣性分析中的多態(tài)性比率（82.14%）。這可能是由于該研究采用的瓊脂糖凝膠分辨率較低，分離條帶模糊，導(dǎo)致多態(tài)性比率相對較低，這與李寧等［31］的研究結(jié)果一致。該研究從40條SCoT引物中篩選出8條多態(tài)性好、清晰度高的有效引物，從而證實了最佳反應(yīng)體系的穩(wěn)定性和可靠性，為雷公筍遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系鑒定及相關(guān)分子標記的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

4 結(jié)論

該研究經(jīng)過試驗得到適合雷公筍SCoT標記的20 μL的優(yōu)化體系：DNA含量為40 ng，引物濃度為0.25 μmol/L，dNTPs濃度為0.30 mmol/L，Taq含量3.00 U。從40條引物中共篩選出8條具有條帶清晰、多態(tài)性豐富、重復(fù)性好的引物。用篩選出的引物對雷公筍3個居群（MS、YT和XP）的DNA進行擴增，均能獲得清晰穩(wěn)定、多態(tài)性豐富的擴增結(jié)果。通過對8條引物擴增，共產(chǎn)生108條帶，平均每條引物擴增13.5條帶，多態(tài)性比率達到62.64%。

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基金項目 海南省科技專項資助（ZDYF2021XDNY127）。

作者簡介 孫秀秀（1993—），女，山東萊西人，助理研究員，碩士，從事熱帶植物種質(zhì)資源保護與創(chuàng)新利用研究。*通信作者，研究員，碩士，從事熱帶植物種質(zhì)資源保護與創(chuàng)新利用研究。

收稿日期 2023-05-29