王曉宇 梁曉欣 朱振遠

摘 要 廣藿香是我國嶺南地區(qū)傳統(tǒng)名貴中草藥，其主要活性物質是百秋李醇，屬于三環(huán)倍半萜化合物，在植物體內形成過程較復雜，目前已有研究主要集中在百秋李醇合成的相關基因。研究對 7種不同地域來源的廣藿香種質中的4個百秋李醇合成調控相關基因（PatPTS、PatFPS、PatHMGR、PattTpsCF2）進行了表達差異分析，同時測定了不同來源廣藿香樣品中的百秋李醇含量。結果表明：在所檢測的樣品中，4個百秋李醇合成調控相關基因表達量與百秋李醇含量均存在地域差異；PatPTS、PatFPS、PatTpsCF2在不同來源廣藿香樣品中的表達差異與百秋李醇含量呈正相關；PatHMGR基因在廣東高要和廣東石牌2個廣藿香樣本中表現(xiàn)為高表達，而在其他廣藿香樣本中表達差異與百秋李醇含量呈正相關。此次研究結果可為不同來源廣藿香藥效成分快速鑒定和分子育種提供理論依據。

關鍵詞 百秋李醇；合成基因；表達差異；廣藿香

中圖分類號：S567 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.06.001

廣藿香[Pogostemon cablin（Blanco）Benth.]為唇形科刺蕊草屬植物，其干燥的地上部分為中藥材廣藿香，性辛、微溫，屬十大南藥之一，具有芳香化濁、開胃止嘔、發(fā)表解暑之功效，是藿香正氣丸、抗病毒口服液等30多種中成藥的重要原料，具有很高的經濟價值[1]。百秋李醇也稱為廣藿香醇，是一種天然倍半萜類化合物，為廣藿香油中含量最多的成分之一。《中國藥典》中百秋李醇是評價廣藿香及其精油品質的重要指標，也被認為是廣藿香油藥效功能和芳香功能的主要來源[2]。近年來，百秋李醇成為研究熱點，針對其已經報道了多種有應用前景的藥用活性，包括抗流感、抗抑郁、抗?jié)儭⒖寡?、抗癌及對代謝性疾病的保護活性等[3]。

姚尹伊等對百秋李醇在廣藿香體內合成途徑已研究得較透徹，底物為2個乙酰CoA，合成乙酰乙酰CoA后，由HMG-CoA合酶催化形成3-羥基-3-甲基戊二單酰（HMG-CoA），經過一系列合酶催化形成甲羥戊酸、異戊烯基焦磷酸、牻牛兒基焦磷酸、法呢基焦磷酸等中間產物，最后形成百秋李醇[4]。整個合成過程存在4個限速酶，即HMG-CoA還原酶、法呢基焦磷酸合成酶、倍半萜合成酶和百秋李醇合成酶，其對應的基因分別為PatHMGR、PatFPS、PatPTS和PatTpsCF2[5-10]。此次研究采集了7個不同地域來源的廣藿香，分別測定其百秋李醇含量，以及4個百秋李醇合成限速酶基因表達量差異，以期闡明百秋李醇合成相關基因與百秋李醇含量的關系，為進一步探索廣藿香藥效成分代謝途徑，開發(fā)優(yōu)質廣藿香快速鑒定體系和遺傳改良提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為7份采集自不同地域的廣藿香資源樣品（見表1），利用扦插法種植于溫室大棚。

1.2 試劑和儀器

Tris-HCl、EDTA、NaCl購自生工生物工程（上海）股份有限公司，SteadyPure通用型RNA提取試劑盒、SYBR Green Pro Taq HS預混型qPCR試劑盒、Evo M-MLV反轉錄試劑盒、RNA free水購自湖北艾科瑞生物工程有限公司。引物均合成于生工生物工程（上海）股份有限公司。主要儀器有CFX96TM實時熒光定量PCR儀（Bio-RAD美國）、赫西 3H20R1臺式高速冷凍離心機（湖北赫西儀器裝備有限公司）、Nanodrop one超微量紫外分光光度計[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。

1.3 試驗方法

1.3.1 廣藿香百秋李醇含量測定

選取來自不同產地、生長期滿1年、長勢良好的廣藿香植株地上部分（3個重復），陰干后用研磨機打成粉末，每份樣品稱取100 mg，按照《中國藥典》（2020版）中的方法提取廣藿香揮發(fā)油并測定百秋李醇含量。此次檢驗委托廣州匯標檢測技術中心完成。

1.3.2 總RNA提取與檢測

選取長勢一致的不同來源廣藿香各3株（每株3個重復），采集葉片100 mg在液氮中研磨至細粉，轉入預冷的1.5 mL離心管，按照SteadyPure通用型RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，貯藏于-20 ℃或-80 ℃冰箱備用。按照Nanodrop one超微量紫外分光光度計操作說明測量RNA濃度。

1.3.3 反轉錄與qRT-PCR相對定量分析

按照SteadyPure通用型RNA提取試劑盒Evo M-MLV反轉錄試劑預混試劑盒說明書進行反轉錄，獲得的cDNA貯藏于-20 ℃冰箱備用。

研究采用SYBR Green Pro Taq HS 預混型qPCR試劑盒進行qRT-PCR相對定量分析。利用18S rRNA基因作為內參基因，目標基因擴增引物序列如表2所示，qRT-PCR 反應體系為2×SYBR Green Pro Taq?10 ?L，cDNA模板1 ?L，引物F（10 ?M）0.5 ?L，引物R（10 ?M）0.5 ?L，ddH2O 8 ?L。

反應程序為95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸30 s，60 ℃ 1 s讀板，40個循環(huán)；65～95 ℃測定溶解曲線。

2 結果與分析

2.1 不同來源廣藿香中百秋李醇合成相關基因的表達量分析

由圖1（a）可知，百秋李醇合成酶基因（PatPTS）在海南萬寧、廣西橫州、廣東陽春、廣東遂溪廣藿香中表達量較高。由圖1（b）可知，海南萬寧廣藿香中法呢基焦磷酸合成酶基因（PatFPS）的表達量明顯高于其他地區(qū)。由圖1（c）可知，倍半萜合成酶基因（PatTpsCF2）在海南萬寧、廣西橫州廣藿香中表達量較高，其他地域差異相對較小。由圖1（d）可知，廣東石牌、廣東高要廣藿香中HMG-CoA還原酶基因（PatHMGR）的表達量明顯高于其他地區(qū)。

2.2 不同來源廣藿香中百秋李醇含量差異分析

由圖2可知，所有廣藿香樣本中中百秋李醇含量均超過最低指標（不低于0.1%），不同來源廣藿香中百秋李醇含量有明顯差異。其中，海南萬寧、廣西橫州的廣藿香中百秋李醇含量最高，分別為0.83%和0.64%；廣東高要和廣東石牌的廣藿香中百秋李醇含量最低，分別為0.23%和0.14%；其余廣藿香樣本中百秋李醇含量差異較小，在0.30%～0.45%。

2.3 不同來源廣藿香中百秋李醇合成相關基因表達量與百秋李醇含量關聯(lián)性分析

由圖3可知，關聯(lián)性分析結果表明，PatPTS、PatFPS和PatTpsCF2在不同來源廣藿香樣品中的表達量與百秋李醇含量正相關。PatHMGR基因在廣東高要和廣東石牌2個廣藿香樣本中表現(xiàn)為高表達，而在其他廣藿香樣本中表達量與百秋李醇含量呈正相關。

3 結論與討論

《中國藥典》（2020版）中規(guī)定了廣藿香揮發(fā)油中百秋李醇含量不得低于0.1%。現(xiàn)代藥理學也證明了百秋李醇具有重要的藥用價值，如抗病毒、抗癌、消炎等。已有研究表明，廣藿香萜類物質合成關鍵酶有十幾種，但對于具體的調控機制還知之甚少。此次研究發(fā)現(xiàn)，4個已知的廣藿香醇合成限速酶基因在不同地域來源廣藿香中表達量存在差異。PatPTS、PatFPS和PatTpsCF2在不同來源廣藿香樣品中的表達量與百秋李醇含量呈正相關，進一步證明了法呢基焦磷酸合成酶、倍半萜合成酶和百秋李醇合成酶基因表達量直接影響百秋李醇含量，可作為廣藿香質量快速鑒定的直接指標，為進一步研究廣藿香藥效質量快速檢測方法和遺傳改良提供了依據。

不同來源廣藿香樣品中PatHMGR基因在廣東高要和廣東石牌2個廣藿香樣本中表現(xiàn)為高表達。這是因為廣藿香可分為醇型和酮型，廣東高要和廣東石碑的廣藿香為牌香類，屬于酮型廣藿香，揮發(fā)油中廣藿香酮含量較高。PatHMGR基因在廣東高要和廣東石牌2個廣藿香樣本高表達說明HMG-CoA還原酶是廣藿香酮合成途徑中的關鍵酶。此結果為進一步研究廣藿香酮代謝途徑提供了理論基礎。

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