hiPSCs分化的細胞和類器官在SARS-CoV-2感染研究上的應(yīng)用

征月良

(臨沂大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276000)

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)是一種由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)引起的傳染病，能感染人體多種器官。為了研究人體細胞和器官感染SARS-CoV-2后的病理反應(yīng)，可利用人的誘導(dǎo)性多能干細胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)分化成特定細胞和類器官，再通過病毒對這些細胞和類器官進行感染，從而進行此病毒的感染研究。

1 SARS-CoV-2、hiPSCs及類器官

SARS-CoV-2(2019-nCoV)為β屬冠狀病毒，是一種有包膜的RNA病毒，具刺突，通常呈球形，直徑約60-140 nm。[1]SARS-CoV-2對宿主細胞的感染與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)和跨膜絲氨酸蛋白酶2(transmembrane serine protease 2，TMPRSS2)有關(guān)。病毒通過其刺突蛋白(spike proteins，S蛋白)和細胞受體ACE2結(jié)合，促進病毒附著于細胞表面，TMPRSS2能切割病毒S蛋白，使得病毒和宿主細胞膜融合，導(dǎo)致病毒進入細胞。[2]

hiPSCs是一種多能干細胞，可由外周血單核細胞、成纖維細胞等細胞生成。從人體血液中分離出外周血單核細胞，使用仙臺病毒重編程試劑盒在單核細胞中過表達4種Yamanaka因子，對細胞進行重編程，產(chǎn)生hiPSCs。hiPSCs呈集落狀生長，核質(zhì)比高，具有正常核型，能表達多能性標志NANOG、OCT4、SOX2、SSEA4和TRA-1-81。hiPSCs有分化潛能，能分化成外胚層、中胚層和內(nèi)胚層細胞。[3]在一定條件下，hiPSCs可分化為類器官。類器官是一種3D培養(yǎng)物，具有體內(nèi)器官的一些結(jié)構(gòu)和功能。在類器官生成過程中，先將hiPSCs分化成形態(tài)和大小均勻的胚狀體(embryoid bodies，EB)，然后向培養(yǎng)基中添加特定生長因子，使EB分化為類器官。通過微流體共培養(yǎng)系統(tǒng)，對肝臟類器官和胰島類器官進行共培養(yǎng)，它們均表現(xiàn)良好活性和功能，并發(fā)生相互作用，胰島類器官在葡萄糖刺激下分泌胰島素，胰島素促進肝臟類器官利用葡萄糖。[4]

除了可用于器官功能研究外，hiPSCs分化的類器官也為病原體感染研究提供了一種有用模型。將人成纖維細胞誘導(dǎo)生成hiPSCs，然后將hiPSCs分化為腦類器官。腦類器官被乳頭多瘤空泡病毒感染后，病毒顆粒主要存在于被感染細胞的核區(qū)室中，而且這種病毒的增殖性感染可長達3周。[5]在hiPSCs分化的腦類器官中，小膠質(zhì)細胞具有吞噬活性和突觸修剪功能。腦類器官被寨卡病毒感染后，促炎性因子的表達增加，發(fā)生炎癥反應(yīng)。小膠質(zhì)細胞呈變形蟲狀，突觸消除能力增強，發(fā)生過度突觸修剪現(xiàn)象。[6]適當?shù)腟ARS-CoV-2感染模型對于病毒侵染機制研究至關(guān)重要，當前，hiPSCs分化的呼吸道上皮細胞、肺類器官、神經(jīng)系統(tǒng)細胞、腦類器官、心肌細胞、血管、腸類器官以及腎類器官已被應(yīng)用于SARS-CoV-2感染研究。

2 hiPSCs分化的細胞和類器官在SARS-CoV-2感染研究上的應(yīng)用

2.1 呼吸道上皮細胞和肺類器官

SARS-CoV-2在感染宿主細胞時，ACE2和TMPRSS2發(fā)揮重要作用。將hiPSCs分化為上皮基底樣細胞，然后將這些細胞在氣液界面上培養(yǎng)，生成呼吸道。該結(jié)構(gòu)為復(fù)層上皮，有能擺動的纖毛，其頂端具粘液層，能產(chǎn)生粘液。這種呼吸道表達ACE2和TMPRSS2，能被SARS-CoV-2感染，并分泌促炎性因子，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。[7]這種呼吸道也可用于抗病毒藥物的篩選，瑞德西韋和甲磺酸卡莫司他能減輕呼吸道被SARS-CoV-2感染的程度。[8]hiPSCs分化的呼吸道細胞受SARS-CoV-2感染后，細胞代謝過程被干擾，細胞因子如腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ和白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)的表達上調(diào)，產(chǎn)生高水平的活性氧，導(dǎo)致細胞周期異常。[9]

人肺泡受SARS-CoV-2感染后，發(fā)生病理變化，氣體交換功能受損。從患者直接獲取肺泡細胞來研究SARS-CoV-2感染存在一定障礙，但可將hiPSCs分化成肺泡細胞，用于病毒感染研究。這種肺泡細胞被SARS-CoV-2感染后，基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化，引起急性炎癥反應(yīng)。[10]SARS-CoV-2感染也觸發(fā)肺泡細胞中腫瘤生長因子-β1的表達，誘導(dǎo)上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致肺泡細胞發(fā)生纖維化。[9]在被SARS-CoV-2感染的肺泡細胞中，微管被破壞，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量增加，核糖體成分的合成也增加，對細胞增殖起負調(diào)控作用的基因表達上調(diào)，而與有氧呼吸相關(guān)的基因表達下調(diào)，細胞周期停止，肺泡細胞中這些變化促進了病毒的復(fù)制。[11]

在hiPSCs分化的肺類器官中，含有肺泡細胞、纖毛細胞和分泌細胞。此類器官能高效表達ACE2和TMPRSS2，易被SARS-CoV-2感染，并且感染率呈時間依賴性增加。受此病毒感染后，肺類器官中與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)的基因如干擾素和趨化因子基因的表達上調(diào)，與炎癥激活途徑有關(guān)的基因如IL-18和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1基因的表達也上調(diào)，引起肺類器官的炎癥發(fā)生和損傷。[12]

2.2 神經(jīng)系統(tǒng)細胞和腦類器官

從患者直接獲取神經(jīng)系統(tǒng)的細胞來進行SARS-CoV-2感染研究存在一定障礙，但hiPSCs分化的神經(jīng)系統(tǒng)細胞可用于此研究。在hiPSCs分化的小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞和脈絡(luò)叢上皮細胞中，小膠質(zhì)細胞不被SARS-CoV-2感染，星形膠質(zhì)細胞的感染程度低，而脈絡(luò)叢上皮細胞的感染程度高。此病毒對脈絡(luò)叢上皮細胞的趨向性感染會引起細胞合胞體的數(shù)量增加，并通過細胞間融合促進病毒的傳播。SARS-CoV-2的感染導(dǎo)致脈絡(luò)叢上皮細胞的基因轉(zhuǎn)錄失調(diào)，促炎性因子的表達增加，引起炎癥反應(yīng)，脈絡(luò)叢上皮的正常屏障功能和分泌功能受損。[13]

視網(wǎng)膜是眼球壁的內(nèi)層結(jié)構(gòu)，在感受光刺激方面起重要作用。hiPSCs可分化為視網(wǎng)膜類器官(retinal organoids)，此類器官含視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cells，RGCs)、視網(wǎng)膜祖細胞、無長突細胞和雙極細胞。與視網(wǎng)膜祖細胞、無長突細胞和雙極細胞相比，RGCs更易受SARS-CoV-2感染。IL-33與炎癥發(fā)生相關(guān)，Janus激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT)信號通路也參與炎癥發(fā)生和抗病毒反應(yīng)。視網(wǎng)膜類器官被SARS-CoV-2感染后，IL-33表達及JAK-STAT通路的基因表達上調(diào)，而與DNA修復(fù)相關(guān)的基因表達下調(diào)。SARS-CoV-2對視網(wǎng)膜類器官的感染與ACE2有關(guān)，使用ACE2抗體可阻斷此病毒對視網(wǎng)膜類器官的感染。[14]

hiPSCs可分化為神經(jīng)祖細胞，在未被SARS-CoV-2感染的神經(jīng)祖細胞中，富含半胱氨酸蛋白61(cysteine-rich protein 61，Cyr61)的表達水平低，但在被感染細胞中，Cyr61的表達水平高。Cyr61的表達水平升高可增強病毒的毒性并誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。[15]將人神經(jīng)祖細胞在旋轉(zhuǎn)振蕩條件下培養(yǎng)，可形成腦球結(jié)構(gòu)。SARS-CoV-2感染此腦球后，在受感染的神經(jīng)元中，病毒復(fù)制活躍，引發(fā)細胞裂解。[16]在hiPSCs分化的腦類器官中，含有充滿液體的腦室，有表達NESTIN的神經(jīng)祖細胞和表達TUJ1的神經(jīng)元。腦類器官被SARS-CoV-2感染后，出現(xiàn)細胞融合現(xiàn)象，釋放出病毒粒子。[17]在腦類器官中，相比于星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)祖細胞，神經(jīng)元更易受SARS-CoV-2感染。腦類器官被此病毒感染后，補體系統(tǒng)的基因表達增強，caspase-3的表達上調(diào)，B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，BCL-2)和BCL-2相關(guān)X蛋白的表達下調(diào)，神經(jīng)元發(fā)生突觸丟失現(xiàn)象。[12]與培養(yǎng)15天的腦類器官相比，培養(yǎng)60天的腦類器官更易受SARS-CoV-2感染。Tau是一種微管結(jié)合蛋白，位于神經(jīng)元軸突，起穩(wěn)定微管并促進軸突生長作用。腦類器官被SARS-CoV-2感染后，神經(jīng)元中Tau發(fā)生過度磷酸化，Tau被錯運至神經(jīng)元胞體中，導(dǎo)致Tau定位異常。在被SARS-CoV-2感染的神經(jīng)元中，出現(xiàn)核固縮和DNA片段化現(xiàn)象。[18]

2.3 心肌細胞

hiPSCs分化的心肌細胞(iPSC-derived cardiomyocytes，iCMs)可用于SARS-CoV-2感染研究。將hiPSCs分化為iCMs、心臟成纖維細胞和內(nèi)皮細胞后，用SARS-CoV-2進行感染，發(fā)現(xiàn)iCMs可被感染，但另二種分化細胞未被感染。[19]SARS-CoV-2進入iCMs后，在溶酶體樣囊泡中組裝，并通過胞吐作用排出大量病毒粒子。[20]除了能直接感染iCMs外，含有病毒RNA的細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是病毒感染iCMs的間接途徑。受SARS-CoV-2感染的細胞能分泌攜帶病毒RNA的EVs，這些EVs可被iCMs攝入，導(dǎo)致iCMs被感染。[21]在被SARS-CoV-2感染的iCMs中，TNF-α的表達水平升高，而TNF-α水平上升反過來又促進病毒進入iCMs。[22]

hiPSCs分化的iCMs受SARS-CoV-2感染后，染色質(zhì)可及性途徑發(fā)生上調(diào)，能量生成途徑發(fā)生下調(diào)，細胞代謝從氧化磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒猓毎碾娚砘钚允軗p。[20]在被SARS-CoV-2感染的iCMs中，出現(xiàn)雙鏈RNA，這種RNA是病毒感染細胞后形成的中間體。SARS-CoV-2感染會破壞細胞間縫隙連接，損害心肌細胞的興奮-收縮耦聯(lián)。[23]在被SARS-CoV-2感染的iCMs中，趨化因子(C-X-C基序)配體1(chemokine(C-X-C motif)ligand 1，CXCL1)、CXCL2、IL-6和IL-8的表達上調(diào)，細胞發(fā)生病變，聚成葡萄串狀，出現(xiàn)收縮和起皺，從培養(yǎng)皿上脫落。[24]另外，受SARS-CoV-2感染的iCMs發(fā)生碎片化，肌原纖維斷裂，導(dǎo)致細胞的收縮功能發(fā)生障礙。[19]

hiPSCs分化的iCMs可用于評估藥物的抗病毒作用。心肌細胞表達大麻素受體，大麻素通過對促炎性因子的釋放起負調(diào)節(jié)作用而具有抗炎特性。在SARS-CoV-2感染的iCMs中，大麻素激動劑WIN55，212-2能降低被感染細胞釋放促炎性因子的水平，從而減輕iCMs的損傷。[25]瑞德西韋和羥氯喹有抗SARS-CoV-2的作用，能防止iCMs被此病毒感染。[26-27]Sigma-1受體(Sigma-1 receptor，S1R)是一種在心肌細胞中廣泛表達的伴侶蛋白，S1R的拮抗劑NE-100可抑制iCMs的S1R活性，減輕SARS-CoV-2的感染。[28]

2.4 血管

血管是血液流動的管道，心臟泵出的血液，通過血管運輸?shù)饺斫M織和器官，以滿足機體生命活動的需要。hiPSCs可分化為血管，這種人造血管與人體內(nèi)血管相似，具有管腔和基底膜，有表達CD31的內(nèi)皮細胞和表達PDGFR的周細胞。人造血管被SARS-CoV-2感染后，病毒復(fù)制活躍，產(chǎn)生新的病毒粒子。SARS-CoV-2對人造血管的感染與ACE2有關(guān)，重組可溶性人ACE2(human recombinant soluble ACE2，hrsACE2)可抑制SARS-CoV-2對人造血管的感染，而且hrsACE2對人造血管沒有毒性，從而為預(yù)防這種病毒的感染提供了一種重要方法。[29]

2.5 腸類器官

hiPSCs分化的腸類器官(human iPSC-derived intestinal organoids，HIO)也是SARS-CoV-2感染研究的一種有用模型。HIO含有具微絨毛的腸上皮細胞，被SARS-CoV-2感染后，在受感染細胞內(nèi)部和鄰近細胞的刷狀緣處存在病毒顆粒。隨著感染時間的推移，病毒出現(xiàn)復(fù)制和傳播。在被感染的HIO近端區(qū)域，小腸上皮特異性標記的表達降低，干擾素信號通路上調(diào)，而在被感染的HIO遠端區(qū)域，結(jié)腸上皮特異性標記的表達提高，出現(xiàn)未折疊蛋白反應(yīng)，核因子κB信號通路上調(diào)，被感染的HIO發(fā)生炎癥反應(yīng)。[30]在HIO中，內(nèi)分泌細胞和帕內(nèi)特細胞也能被SARS-CoV-2感染。SARS-CoV-2感染不僅可能影響HIO對代謝產(chǎn)物的吸收，還可能影響其激素分泌和局部防御功能。HIO被SARS-CoV-2感染后，病毒能在整個HIO中傳播，導(dǎo)致HIO退化。[31]

2.6 腎類器官

將hiPSCs分化為腎類器官，這種類器官有腎單位樣結(jié)構(gòu)，能被SARS-CoV-2感染。在被感染的腎類器官中，近端腎小管上皮細胞和足細胞中MYC、E2F4和SRF的表達增加，引起細胞應(yīng)激反應(yīng)，類器官發(fā)生炎癥反應(yīng)和損傷。腎類器官被SARS-CoV-2感染后，I型膠原蛋白的表達增加，引起膠原沉積現(xiàn)象。在近端腎小管上皮細胞和間質(zhì)細胞之間，以及在足細胞與間質(zhì)細胞之間，發(fā)生細胞間相互作用，激活了纖維化相關(guān)信號通路，導(dǎo)致腎類器官發(fā)生纖維化。[32]在腎類器官中，SARS-CoV-2能感染近端腎小管上皮細胞，而內(nèi)皮細胞不被感染。被此病毒感染后，近端腎小管上皮細胞的標記物翅莢百脈根凝集素的表達中斷，caspase-3的表達增加，細胞出現(xiàn)腫脹和核固縮現(xiàn)象。LCB1蛋白能結(jié)合SARS-CoV-2的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，阻止此結(jié)構(gòu)域與細胞的ACE2發(fā)生相互作用，阻斷此病毒對腎類器官的感染，從而為防止SARS-CoV-2感染提供了一種新策略。[33]

3 結(jié)語

hiPSCs分化的細胞和類器官作為一種重要的材料來源，在SARS-CoV-2感染研究上具有重要應(yīng)用價值，可以克服直接用患者的細胞和器官來進行病毒感染研究的障礙。近年來的研究表明，這些細胞和類器官可成功用于SARS-CoV-2感染研究，病毒不僅能感染這些細胞和類器官，而且會影響它們的正常活性和功能。但是，hiPSCs分化的類器官應(yīng)用于SARS-CoV-2感染研究時，也存在一些缺陷。這些類器官類似于胎兒器官，而成體器官和胎兒器官在對病毒的易感性上可能存在一些差異，用hiPSCs分化的類器官來進行SARS-CoV-2感染研究，如何全面反映成體器官被感染情況，需要加以研究。另外，與體內(nèi)器官相比，hiPSCs分化的類器官缺乏一些種類的細胞，如何產(chǎn)生細胞種類齊全的類器官，研究不同種類細胞之間以及不同類器官之間的相互作用對SARS-CoV-2感染的影響，從而更全面反映器官被SARS-CoV-2感染的情況，需要進一步研究。另外，除了呼吸道上皮細胞、肺類器官、神經(jīng)系統(tǒng)細胞、腦類器官、心肌細胞、血管、腸類器官以及腎類器官外，如果hiPSCs分化的其它種類細胞和類器官用于SARS-CoV-2感染研究，病毒感染對它們有何影響，也有待加以研究。